Isolatie en cultuur van knaagdier Microglia ter bevordering van een dynamische vertakt morfologie in serumvrij Medium

Samenvatting

Inspanningen om microglial functie in detail te begrijpen hebben belemmerd door het ontbreken van microglial cultuur modellen die de eigenschappen van volwassen in vivo microglia recapituleren. Dit protocol beschrijft een aanpak van het isolement en cultuur ontworpen om robuust voortbestaan van zeer vertakte volwassen rat microglia voorwaarden gedefinieerd-medium.

Samenvatting

Microglia vormen 5-10% van alle cellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) en zijn steeds meer aandacht als gevolg van hun bijdragen tijdens de ontwikkeling, homeostase en ziekte. Hoewel macrofagen zijn in detail bestudeerd voor decennia, speciale functies van microglia, de weefsel-ingezeten macrofagen van het centraal zenuwstelsel, gebleven grotendeels mysterieus, gedeeltelijk als gevolg van beperkingen in de mogelijkheid om te recapituleren volwassen microglial eigenschappen in cultuur. We illustreren hier, een eenvoudige procedure voor de snelle isolatie van pure microglia van de volwassen knaagdieren hersenen. Ook beschrijven we serumvrij kweekomstandigheden die ondersteuning bieden voor hoge niveaus van microglial levensvatbaarheid na verloop van tijd. Microglia gekweekt onder deze omstandigheden gedefinieerd-medium exposeren uitgebreide vertakte processen en dynamische toezicht gedrag. We illustreren sommige gevolgen van serum blootstelling voor gekweekte microglia en bespreken hoe deze serumvrij culturen te vergelijken met zowel serum-blootgesteld culturen evenals microglia in vivo.

Inleiding

Als de macrofagen van de CNS parenchym, microglia interactie met een uitgebreid scala aan circuits van neuronale en gliale signalering netwerken. Ze spelen een cruciale rol in de ontwikkeling en de homeostase van de hersenen via synaptic snoeien, apoptotic cel goedkeuring en voorbijgaande interacties met neuronale processen^1,2. Microglia zijn vroege responders aan neurologische letsels, uitbreiding van hun lange, dunne processen naar laesie sites beperken bloeden^3,4te coördineren van inflammatoire reacties. Veranderingen in microglial morfologie en functie zijn alomtegenwoordig in zowel acute als chronische CNS verwondingen en microglia tentoonstelling gewijzigd morfologie, lokalisatie en expressie van inflammatoire mediatoren in een breed scala aan ziekte staten¹. Menselijke genetische studies blijkt dat mutaties die veranderen van risico voor neurodegeneratieve ziekten vaak voornamelijk of uitsluitend worden uitgedrukt door microglia in het intact VNV, wijzend naar een cruciale rol voor microglia in de pathogenese van de ziekte of progressie⁵ . Gezien hun bekendheid bij letsel en ziekte, is bevordering van het begrip van microglial biologie een hoge prioriteit voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen.

Vele kritische voorschotten aan het begrip van microglial biologie gerezen door extrapolatie van de technieken en mechanismen in het onderzoek van de populaties van andere macrofaag waaronder kweekmethoden, gen expressieprofielen en definities van functionele ontdekt / morfologische Staten. Hoewel generalized macrofaag functies vaak op verrassende manieren binnen de CNS-landschap spelen, microglia zelf sterk gespecialiseerd, vertonen een vertakte morfologie en een unieke gen expressie handtekening dat hen onderscheidt van ander weefsel macrofagen⁶. Microglia hebben een afkomst die verschilt van de meeste andere macrofagen weefsel; ze koloniseren de CNS tijdens een vroege embryonale Golf van primitieve Haematopoiese en zelf vernieuwen gedurende het hele leven, onafhankelijk van de bijdragen van definitieve Haematopoiese⁷. De volwassen gen expressie ondertekening van volwassen microglia wordt niet bereikt tot de tweede postnatale week⁸. Milieu signalen uit het omringende weefsel spelen een belangrijke rol in het weefsel-specifieke macrofaag functies⁶, waarin in het VNV beperkte blootstelling aan bloed overgedragen factoren die worden verleend door de bloed - hersenbarrière⁹dicteren.

Een obstakel voor het volledig begrip van microglial bijdragen aan CNS homeostase en ziekte is de moeilijkheid van de gespecialiseerde eigenschappen van volwassen microglia gezien in vivo met gezuiverde cellen Recapitulerend in vitro. Veel methoden zijn ontwikkeld om te isoleren en cultuur intact microglia, maar de meeste benaderingen rekenen op serum ter ondersteuning van de overleving van de cel. We hebben aangetoond dat toevoeging van serum, dat is een inherent variabele reagens met een breed scala van biologische actieve moleculen, is met name problematisch wanneer werken met microglia omdat het bevordert een Wortelpotigen morfologie, verhoogd proliferatie, en verhoogde fagocytose⁹ vaak gezien in vivo wanneer microglia worden blootgesteld aan bloed gedragen factoren na de verstoring van de bloed - hersenbarrière. Door deze statistieken, serum-blootgesteld cellen lijken op microglia letsel of ziekte staten, maar dergelijke veranderingen worden verlaagd wanneer microglia worden gekweekt in de gedefinieerde groeimedium met CSF-1 (of IL-34), TGF-β, cholesterol en seleniet.

Dit protocol biedt details voor het kweken van jonge rat microglia onder serumvrij voorwaarden, in verband met de onlangs gepubliceerde werk⁹. Dit protocol is gestroomlijnd voor ratten uit postnatale dag 21-30 (P21 - P30), maar kan worden aangepast aan het isoleren van microglia van ratten en muizen van elke leeftijd, hoewel opbrengst en algehele levensvatbaarheid is afhankelijk van de soort en de leeftijd van het dier. Maximale opbrengsten en optimale levensvatbaarheid wordt bereikt bij het gebruik van iets onvolwassen microglia (~ P9), met opbrengsten en levensvatbaarheid geleidelijk taps toelopende tot enigszins lagere niveaus in de volwassen dieren. Microglia kan ook geïsoleerd van muizen, maar we hebben gevonden dat de rat cellen tonen beduidend hogere opbrengsten, levensvatbaarheid en complexiteit van vertakte morphologies, in vergelijking met de muis cellen in serumvrij culturen. Dieren ouder groter is dan P50 zijn niet geëvalueerd met dit protocol. Deze immunopanning isolatie procedure is geoptimaliseerd om te minimaliseren van wijzigingen in microglial transcriptionele profielen tijdens isolatie en te maximaliseren downstream levensvatbaarheid van de cellen. Met behulp van deze technieken en media formuleringen, kunnen hoge-levensvatbaarheid primaire culturen weken worden volgehouden. Microglia gekweekt onder deze omstandigheden vertonen een zeer vertakte morfologie waarbij snelle uitbreiding en intrekking van processen en relatief lage tarieven van proliferatie. We wijzen op de betekenis van de serum-blootstelling op deze eigenschappen, en bespreken van de sterke punten en zwakheid van deze methode ten opzichte van andere benaderingen.

Protocol

Alle procedures waarbij knaagdieren voldaan aan Stanford University richtsnoeren, die in overeenstemming met nationale en staatswetten en beleid. Alle dierlijke procedures goedgekeurd door Stanford University's administratieve Panel op Laboratory Animal Care.

Opmerking: Alle composities van de oplossing en buffer vindt u in de Tabel van materialen.

1. Prepareer een petrischaal CD11b Immunopanning (dag 0)

Opmerking: 1 immunopanning schotel voorbereiden op elke 1-2 jonge rat hersenen.

1. Voeg 25 mL 50 mM Tris pH 9,5 oplossing aan een petrischaal 15 cm.
2. Geit-antimuis IgG (H + L-kettingen) toevoegen aan de schotel voor een eindconcentratie van 6 µg/mL. Swirl plaat gelijkmatig verdelen.
3. Incubeer de schotel voor 1-3 h bij 37 ° C.
4. Gerechten van de Spoel driemaal met DPBS⁺⁺ (met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met Ca^{2 +} en Mg^{2 +}), vervolgens vervangen door een oplossing van de buffer met 1 µg/mL OX42 antilichaam pannen. Laat de gerechten 's nachts bij kamertemperatuur op een vlakke ondergrond.

2. de weefsels collectie (dag 1)

Opmerking: Dit protocol moet ~ 3-4 uur duren.

1. Voordat u begint, moet u zorgen dat alle oplossingen zijn steriel en gekoeld op ijs. Chill alle instrumenten op ijs en steriliseren met ethanol voorafgaand aan gebruik.
2. Volgende passende regelgevende procedures, offeren een jonge laboratorium rat door kooldioxide verstikking.
   Opmerking: U kunt ook jongere dieren kunnen worden opgeofferd met een dodelijke dosis ketamine/xylazine (100-200 µL van 24 mg/mL ketamine, xylazine 2,4 mg/mL). Ketamine/xylazine moet worden gebruikt als dieren leeftijd van minder dan 14 dagen. Als u meerdere dieren, uittreksel van het weefsel van het ene dier en leg deze in vooraf gekoeld DPBS⁺⁺ op ijs voordat wij overgaan tot de volgende dieren.
3. Knijp een hindpaw en zorgt voor de volledige apathie van het dier voordat u verdergaat.
4. Transcardially perfuse het dier met 10-30 mL ijskoud perfusie buffer met behulp van een 27½-G naald, totdat de buffer loopt duidelijk.
   Opmerking: Volume van perfusie buffer zal variëren afhankelijk van de grootte/leeftijd van het dier.
5. Verwijder de kop van het dier onmiddellijk na perfusie. Vanuit het ruggenmerg snijd de occipital condyle aan beide zijden met een dissectie schaar, wees voorzichtig niet om de hersenen beschadigen. Na het snijden van weerskanten zorgvuldig, versneden één kant langs de pariëtale en voorhoofdsbeen richting het neusbeen. Met een tang voorzichtig terugtrekken van de bovenkant van de schedel, snel verwijderen van de hersenen (of CNS structuren van belang), en plaats in vooraf gekoeld DPBS⁺⁺ op ijs.
6. Herhaal voor alle resterende dieren.
   Opmerking: Alle stappen van de procedure moeten worden uitgevoerd in een laminaire flow hood onder juiste steriele omstandigheden.

3. mechanische dissociatie (dag 1)

1. Nadat alle hersenen zijn verzameld, hak een hersenen in 1 mm³ stukjes in een petrischaal op ijs met een koude scalpel mes, en overbrengen naar een ijskoude dounce homogenizer met 5-7 mL ijskoud douncing buffer. Één hersenen distantiëren tegelijk.
2. Het weefsel dat 10-20 zacht en onvolledige slagen met een wijde dounce homogenizer distantiëren. Wees voorzichtig niet te verpletteren direct het weefsel aan de onderkant van de homogenizer, maar in plaats daarvan impel het weefsel door de ruimte tussen de zijkanten van de zuiger en de homogenizer.
3. Verwijder voorzichtig de zuiger om insleep van luchtbellen te voorkomen. Slecht gedissocieerde weefsel brokken om af te wikkelen naar de onderkant van de homogenizer toestaan en supernatant overbrengen in een nieuwe gekoeld 50 mL conische buis.
4. Het verwijderde volume vervangen door verse douncing buffer en herhaalt u stap 3.2 en 3.3 voor een totaal van 3-4 rondes, of totdat alle weefsel heeft zijn losgekoppeld. Herhaal de procedure voor elke hersenen.

4. myeline verwijdering (dag 1)

Opmerking: Myeline verwijdering wordt gebruikt voor isolatie van microglia van dieren ouder dan P12.

1. Meten van de omvang van de celsuspensie in de conische buis van 50 mL, met behulp van een precisiepipet 25 mL, voeg dan ijskoude douncing buffer om het totale volume aan 33.5 mL.
2. Voeg 10 mL van myeline scheiding buffer (MSB) naar de celsuspensie en meng grondig door het omkeren van de buis meerdere malen. Dit zal resulteren in een 23% eindconcentratie van MSB in een volume van 43,5 mL.
3. Centrifugeer cellen gedurende 15 minuten staan bij 500 x g bij 4 ° C bij langzaam remmen.
   Opmerking: De centrifuge moet duren ongeveer 1,5-2 min vertragen. Hierdoor genereert u een bovenste laag van myeline en dode cel puin, een enigszins troebele supernatant en een kleinere pellet die is verrijkt voor levende cellen.
4. Verwijder de bovenste laag van myeline/puin en de bovendrijvende substantie met een pipet. Wees voorzichtig bij het verwijderen van de bovenste laag om ervoor te zorgen, aangezien veel van het zoveel mogelijk is verwijderd.
5. Resuspendeer de pellet cel in 12 mL buffer pannen. Zachtjes triturate de celsuspensie te breken klontjes van cellen die kunnen blijven.

5. Immunopanning (dag 1)

1. De celsuspensie passeren door een zeef cel 70-µm groot puin of cel bosjes te verwijderen.
2. Spoel de OX42 beklede panning schotel driemaal met DPBS⁺⁺. Niet toestaan dat de plaat naar volledig droog tussen wast.
3. Giet af de laatste DPBS⁺⁺ wassen en de gefilterde celsuspensie van toepassing op de panning schotel. Zachtjes swirl van de plaat om te verspreiden van de cellen en Incubeer de plaat op een vlakke ondergrond bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om cellen te houden. Doen niet langer dan 20 min Incubeer of cellen wordt zeer moeilijk om te herstellen van de schotel.
4. Spoel de panning schotel met DPBS⁺⁺ 10 keer voor het verwijderen van niet-aanhanger cellen. Microglia zal worden stevig gekoppeld aan de plaat, zodat de plaat met elke spoelen om verwijdering van andere niet-aanhanger cellen wervelen.
5. Giet af de laatste DPBS⁺⁺ wassen en vervangen door 15 mL DPBS⁺⁺ en 200 μl trypsine (1,25% stockoplossing).
6. Incubeer de schotel voor ≤10 min bij 37 ° C met 10% CO₂ te trypsinize.
   Opmerking: Blijven niet langer dan 10 min of microglia zal worden moeilijk te verwijderen.
7. Na 10 min van trypsinebehandeling, zal microglia nog steeds worden geplakt op plaat. Giet af trypsine/DPBS⁺⁺ en 2 x met DPBS⁺⁺ vervangen met 12 mL ijskoud microglia groeimedium (MGM) te verwijderen van trypsine voorzichtig te wassen.
8. Plaats pannen schotel op het ijs gedurende 2 minuten om te helpen verzwakken cel/substraat interactie, en zorg ervoor dat de schotel is vlak om te voorkomen dat gebieden van de panning schotel uitdrogen.
9. Pipetteer krachtig met een 10 mL pipet en Pipetteer controller op hoge snelheid om te herstellen van cellen van de panning schotel. Tekent een raster van 16 x 16 met de stroom van de vloeistof uit de pipet te proberen en te verwijderen van alle cellen.
10. Controleer de cellen onder een microscoop op 20 X vergroting om ervoor te zorgen dat cellen hebben losgemaakt van de plaat. Mark plekken op de top van het gerecht waar de cellen nog steeds vast, en herhaal pipetteren in die gebieden.
11. Verzamelen celsuspensie en aliquoot 3-4 mL van het supernatans dat per 15 mL conische buis. Spin voor 15 min bij 500 x g bij 4 ° C bij langzaam remmen.
    Opmerking: Spinning microglia door middel van een klein volume zorgt voor de maximale herstel van cellen.
12. De bovendrijvende substantie, 0,5 mL van MGM verlaten met de cel pellet gecombineerd.
13. Resuspendeer elke pellet in resterende MGM en bundelen van de cellen van alle de buizen.
14. Cellen tellen met hemocytometer.
15. De cellen van de plaat zoals beschreven in stap 6 - 7 afhankelijk van de toepassing.
16. De cellen van de cultuur bij 37 ° C met 10% CO₂.
    Opmerking: Cellen kunnen cultuur voor maximaal 3-4 weken met veranderingen in de reguliere media of een week met geen wijzigingen van de media.

6. ter plaatse Coating weefselkweek platen/Coverslips (dag 1)

1. Plaat 15 µL van collageen IV coating direct in het centrum van een 24-well anionogene/kationische gecoate weefselkweek plaat (Zie Tabel van materialen voor details) en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C met 10% CO₂.
2. Na het tellen van cellen met verdunde cellen van de hemocytometer aan 2.3 x 10⁵/mL in MGM. Gecombineerd collageen IV spot en onmiddellijk plaat 15 µL celsuspensie naar deze plek; Dit geeft 3.5 x 10³ cellen/plek. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C met 10% CO₂ cellen houden, voeg 500 µL van CO_{2 -}geëquilibreerd TGF-β2/IL-34/cholesterol met groeimedium (TIC) toestaan zachtjes naar de waterput.
3. Als plating op coverslips, eerste vacht steriele glazen coverslips met 10 µg/mL truc-D-lysine (PDL) in H₂O gedurende 1 uur bij RT, 3 keer wassen met H₂O en laten drogen in een kap onder UV-licht. Zodra de coverslips zijn droog, doorgaan met plek plating op de coverslips zoals beschreven in stap 6.2.

7. plating voor RNA/eiwit isolatie

1. Op dag 1, jas het gehele grondgebied van een 24-well anionogene/kationische gecoat weefselkweek plaat met collageen IV coating en incubeer voor 10 min - 1 uur bij 37 ° C met 10% CO₂, haal hem eruit en onmiddellijk plaat 3-5 x 10⁴ cellen per putje in CO₂ geëquilibreerd TIC media.
2. Uitvoeren op dag 2, een wijziging van de 50% media voor elk goed de dag na bereiding. Dode cellen de neiging om het cluster in het midden van de put, dus neem media vanaf daar.
3. Uitvoeren van een 50% media veranderen elke 2-3 dagen om te handhaven de culturen. Als media aangebrachte een ongewenste variabele voor de culturen introduceren, kunnen cellen overleven voor ongeveer 1 week zonder enige veranderingen van de media, in tegenstelling tot de meer dan 3 weken met regelmatig onderhoud.

Resultaten

Dit protocol wordt een methode beschreven om cultuur hoge zuiverheid vertakt microglia van jonge ratten. Vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen met behulp van onrijpe, perinatale en volwassen dieren, zoals hieronder besproken. Omdat cel isolatie vaak bevatten subtiele nuances en veel mogelijkheden voor cellen om te sterven, wij gewend kwaliteitscontrole controlepunten helpen bepalen succes op verschillende stappen. Wij gecontroleerd meestal schorsingen van de cel met behulp van ...

Discussie

Omdat microglia dienen als sentinel immuuncellen van het centraal zenuwstelsel, zijn ze zeer soepel reageren op veranderingen in het milieu; Daarom is zorgvuldig vereist om te minimaliseren van inflammatoire reacties binnen de cellen tijdens hun isolement en de cultuur⁸. Dit wordt bereikt in dit protocol door snelheid en temperatuur. Het houden van de cellen op ijs of bij 4 ° C wanneer mogelijk sterk activering, vermindert zodat alle centrifugeren stappen bij 4 ° C plaatsvinden, de dieren zijn gep...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoklonaal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1.000; Staining: 1:500
Geiten polyklonaal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Konijn polyklonaal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Ezel anti-muis 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Ezel anti-geit 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Ezel anti-konijn 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergens in ICC-kleuring)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparansulfaat	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparine	Sigma	Cat# M3149
Pepton van melksoliden	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Muur IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Schapenwol cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collageen IV	Corning	Cat# 354233
Oleaanzuur	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadieenzuur (Gondoïnezuur)	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM-kleurstof	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsine	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicilline/ Streptomycine	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteïne	Sigma	Cat# A9165
Insuline	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrine	Sigma	Cat# T1147
Natriumseleniet	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (hoge glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Voorraad reagentia
Apo-transferrine			Reconstitutie: 10 mg/mL in PBS Concentratie gebruikt: 1:100 Opslag: -20°C
N-acetyl cysteïne			Reconstitutie: 5 mg/mL in H2O Concentratie gebruikt: 1:1.000 Opslag: -20°C
Natriumseleniet			Reconstitutie: 2,5 mg/mL in H2O Concentratie gebruikt: 1:25.000 Opslag: -20°C
Collageen IV			Reconstitutie: 200 μg/mL in PBS Concentratie gebruikt: 1:100 Opslag: -80°C
TGF-b2			Reconstitutie: 2 mg/mL in PBS Concentratie gebruikt: 1:1.000 Opslag: -20°C
IL-34			Reconstitutie: 200 μg/mL in PBS Concentratie gebruikt: 1:1.000 Opslag: -80°C
Schapenwol cholesterol			Reconstitutie: 1,5 mg/mL in 100% ethanol Concentratie gebruikt: 1:1.000 Opslag: -20°C
Heparansulfaat			Reconstitutie: 1 mg/mL in H2O Concentratie gebruikt: 1:1.000 Opslag: -20°C
Oleaanzuur/Gondoïnezuur			Reconstitutie: Gondoïnezuur: 0,001 mg/mL; Oleaanzuur: 0,1 mg/mL in 100% ethanol Concentratie gebruikt: 1:1.000 Opslag: -20°C
Heparine			Reconstitutie: 50 mg/mL in PBS Concentratie gebruikt: 1:100 Opslag: -20°C
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Oplossingen
Perfusiebuffer			Recept: 50 μg/mL heparine in DPBS++ (PBS met Ca++ en Mg+ +) Opmerkingen: Gebruik wanneer ijskoud
Douncingbuffer			Recept: 200 μL van 0,4% DNaseI in 50 mL van DPBS++ Opmerkingen: Gebruik wanneer ijskoud
Panningbuffer			Recept: 2 mg/mL pepton van melksoliden in DPBS++
Microglia Groeimedium (MGM)			Recept: DMEM/F12 bevattend 100 eenheden/mL