Methodenartikel

Ruggenmerg laterale hemisectie en asymmetrische gedragsbeoordelingen bij volwassen ratten

21K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57126

⸱

24 maart 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Spinal Cord Injury and Repair, Trauma and Orthopedics Institute of Chinese PLA, 960th Hospital, Joint Logistics Support Force of PLA, 2Institute of Military Cognition and Brain Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Academy of Military Sciences, 3Spinal Cord and Brain Injury Research Group, Stark Neurosciences Research Institute, Department of Neurological Surgery and Goodman Campbell Brain and Spine, Indiana University School of Medicine, 4Program in Medical Neuroscience, Paul and Carole Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University School of Medicine, 5Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital, Shandong University, 6Beijing Computing Center, Beijing Academy of Science and Technology

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we chirurgische ingrepen om een betrouwbare ruggenmerglaterale hemisectie (HX) te produceren op het9e thoracale niveau bij volwassen ratten en neurogedragsbeoordelingen die zijn ontworpen voor het opsporen van asymmetrische tekorten na zo'n eenzijdige verwonding.

Samenvatting

Onvolledige dwarslaesie (SCI) leidt vaak tot beperkingen van sensorimotorische functies en is klinisch het meest voorkomende type SCI. Human Brown-Séquard syndroom is een veel voorkomend type van onvolledige SCI veroorzaakt door een laesie aan de ene helft van het ruggenmerg, wat resulteert in verlamming en verlies van proprioceptie aan dezelfde (of ipsilesional) kant als de schade, en verlies van pijn en temperatuur gevoel aan de tegenovergestelde (of contraionalles) kant. Adequate methoden voor het produceren van een ruggenmerg laterale hemisectie (HX) en het beoordelen van neurologische stoornissen zijn essentieel om een betrouwbaar diermodel van het Bruin-Séquard syndroom vast te stellen. Hoewel het laterale hemisectiemodel een centrale rol speelt in fundamenteel en translationeel onderzoek, ontbreken gestandaardiseerde protocollen voor het creëren van een dergelijke hemisectie en het beoordelen van unilaterale functie. Het doel van deze studie is om stapsgewijze procedures te beschrijven om een rat spinale laterale HX te produceren op het9e thoracale (T9) wervelniveau. We beschrijven dan een gecombineerde gedragsschaal voor HX (CBS-HX) die een eenvoudige en gevoelige beoordeling biedt van asymmetrische neurologische prestaties voor eenzijdige SCI. De CBS-HX, variërend van 0 tot 18, bestaat uit 4 individuele beoordelingen die eenzijdige achterpoot stappen (UHS), koppeling, contact plaatsen, en grid lopen omvatten. Voor CBS-HX worden de ipsilaterale en contralaterale achterpoten afzonderlijk beoordeeld. We ontdekten dat, na een T9 HX, de ipsilaterale achterpoot een verminderde gedragsfunctie vertoonde, terwijl de contralaterale achterpoot een aanzienlijk herstel vertoonde. De CBS-HX effectief gediscrimineerd gedragsfuncties tussen ipsilaterale en contralaterale achterpoten en gedetecteerdtemporeze progressie van het herstel van de ipsilaterale achterpoot. De CBS-HX componenten kunnen afzonderlijk of in combinatie met andere maatregelen worden geanalyseerd wanneer dat nodig is. Hoewel we alleen visuele beschrijvingen hebben verstrekt van de chirurgische ingrepen en gedragsbeoordelingen van een thoracale HX, kan het principe worden toegepast op andere onvolledige SGB's en op andere niveaus van de schade.

Inleiding

De onvolledige dwarslaesie (SCI) leiden vaak tot ernstige en aanhoudende aantasting van sensorimotorische functies en zijn klinisch het meest voorkomende type SCI1. Het Brown-Séquard syndroom bij de mens wordt veroorzaakt door een laesie aan de helft van het ruggenmerg, wat resulteert in verlamming en verlies van proprioceptie aan dezelfde (of ipsilesional) kant als de schade, en verlies van pijn en temperatuur sensatie aan de tegenovergestelde (of contralesional) kant2,3,4. Spinale laterale hemisectie dierlijke modellen worden in grote lijnen gebruikt om de menselijke Brown-Séquard syndroom na te bootsen en ze zijn gemeld bij ratten5,6,7,8,9, opossums10, en apen7,11,12,13 door verschillende laboratoria op verschillende spinale niveaus. Gedetailleerde gevisualiseerde procedures voor het produceren van een standaard laterale hemisectie zijn echter niet beschreven. Het bieden van stapsgewijze procedures voor een laterale hemisectie moet het model optimaliseren en de vergelijking of replicatie van experimentele resultaten in fundamenteel en translationeel onderzoek vergemakkelijken.

Een eenzijdige SCI produceert asymmetrische en onevenredige gedragstekorten die moeilijk te meten zijn met behulp van conventionele beoordelingen voor symmetrische verwondingen. Een adequate methodologie voor de beoordeling van neurologische stoornissen voor een eenzijdige SCI is een essentieel onderdeel van de ontwikkeling van een eenzijdig SCI-model. Ondanks de centrale rol van een eenzijdige dwarslaesie ontbreken gestandaardiseerde protocollen voor de evaluatie van sensorimotorische tekorten bij dieren met een dergelijke verwonding. De Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) locomotor rating schaal is de meest gebruikte meting van de functie na SCI voor volwassen ratten 14 die een semikwantitatieve beschrijving van de bewegingsvrijheid als geheel levert. Het meet echter niet elke achterpoot onafhankelijk.

In deze studie rapporteren we stapsgewijze procedures om een knaagdier spinale HX te produceren op het9e thoracale (T9) wervelniveau. We introduceren ook een gecombineerde gedragsschaal voor hemisectie (CBS-HX) die eenzijdige achterpootstepping (UHS), koppeling, het plaatsen van contact en rasterwandelbeoordelingen omvat voor het evalueren van neurologische stoornissen en herstel na een eenzijdige SCI. We hopen dat dit model een nuttig model zal zijn voor het onderzoeken van letselmechanismen en therapeutische werkzaamheid voor unilaterale SKU's.

Protocol

Alle chirurgische en dierlijke behandelingsprocedures werden uitgevoerd zoals goedgekeurd onder de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Research Council) en de richtlijnen van de Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care and Use Commissie.

1. Algemene tegenprestatie

  1. Gebruik volwassen vrouwelijke Sprague-Dawley (SD) ratten (met een gewicht van 200 g, n=12) voor deze studie. Wenning dieren naar alle testomgevingen en het verzamelen van baseline gegevens voor alle gedragstests een week voorafgaand aan de chirurgische ingreep.
  2. Voer de gedragsbeoordelingen uit door twee waarnemers die blind zijn voor de experimentele groepen.

2. Dierbereiding

  1. Reinig de chirurgische tafel met 70% ethanol. Plaats een voorverwarmde verwarmingskussen op de chirurgische tafel. Bedek het chirurgische gebied met een steriel chirurgisch laken. Plaats het steriele gaasje, wattenstaafjes en autoclaved chirurgische gereedschappen op het oppervlak van het chirurgische gordijn.
  2. Zet een microbead sterilisator aan voor de interchirurgie sterilisatie van chirurgische hulpmiddelen.
    OPMERKING: Een voorbeeld van de hulpmiddelen die in dit experiment worden gebruikt, wordt weergegeven in figuur 1.
  3. Verdoof de rat met een intraperitoneale (i.p.) injectie ketamine (87,7 mg/kg) en xylazine (12,3 mg/kg). Zorg ervoor dat het juiste vlak van anesthesie wordt bereikt door geen reactie op de teen knijpstimulus. Breng dierenarts zalf aan op de ogen van het dier om hoornvliesdrogen tijdens de operatie te voorkomen.
  4. Verwijder het haar dat over de borstwervels ligt door te scheren (Figuur 2A). Verwijder het geschoren bont met een vacuüm uitgerust met een HEPA-filter.
  5. Reinig het chirurgische gebied met drie afwisselende scrubs van jodium gebaseerde scrub en ethanol.
  6. Bedek het dier met een steriel gordijn met een fenestratie over de voorgestelde incisieplaats (figuur 2B). Let op; In video, is het chirurgische gordijn weggelaten voor demonstratiedoeleinden.

3. Spinale hemisectie

  1. Raak de13e rib aan, de laagste rib in de rat en een zwevende rib die geen verbinding maakt met het borstbeen. Volg de13e rib rugom de verbinding met de T13 wervel te identificeren en vervolgens tellen om de T10 wervel te identificeren.
  2. Gebruik een scalpel mes (#15, figuur 1) om een 3 - 4 cm middellijn huid incisie uit te voeren op de rug boven de 8-11e wervelspinous processen.
  3. Onder een chirurgische microscoop, botweg ontleden en scheiden van de spinale spieren lateraal van de spineuze processen naar de facetten van de T9 en T10 wervels aan beide zijden met behulp van dezelfde scalpel mes.
    LET OP: Deze aanpak zal mooi plagen het weefsel uit elkaar zonder bloeding.
  4. Stabiliseer de wervelkolom met behulp van een gewijzigde stabiliserende houder. Maak een spleet aan beide zijden van het laterale wervelbeen. Schuif de roestvrijstalen armen onder de blootgestelde dwarsprocesfacetten en draai de schroeven aan om de stabiliteit te waarborgen.
  5. Gebruik een oprolmechanisme om spieren uit het chirurgische gebied(figuur 2B)in te trekken en om de T8-11 wervellaminae en spineuze processen bloot te leggen (Figuur 2C).
    OPMERKING: Er is een grote kloof tussen de T8 en T9 spinachtige processen, die oriëntatiepunten voor het identificeren van T9 (Figuur 2C, dorsale weergave). Vanuit de zijdezijde wijst het spinachtige proces van de T9-wervel caudally, het T10 spinachtige proces doraal en wijst het Spineuze proces van T11 rostrally; dus, de 3 spinous processen vormen een piramide en de T10 spinous proces vormt de piek (Figuur 2D, laterale weergave).
  6. Voer een dorsale laminectomie uit op de T9 wervel met behulp van een rongeur. Knip het spineuze proces van T9 weg en verwijder een klein deel van de lamina links naar de middellijn(figuur 3A, stippellijn) en het gehele rechtergedeelte van de lamina zo lateraal mogelijk(figuur 3A, stippellijn). Voor laminectomie, steek de rongeur voorzichtig onder de lamina en knip een klein stukje bot op een moment totdat een gewenste regio van laminectomie is voltooid(figuur 3B en figuur 3C).
  7. Onder een chirurgische microscoop, identificeren van de ruglijn van het ruggenmerg (Figuur 3C). Plaats een naald (30 G) verticaal door de middellijn in het ruggenmerg met de schuine kant naar de rechterkant(figuur 4A).
    OPMERKING: De naald moet het gehele ruggenmerg binnendringen om de ventrale wand van het wervelkanaal te bereiken.
  8. Stop het bloeden met een klein stukje steriel gelschuim.
  9. Steek een puntje van een iridectomie / microchirurgische schaar door de middellijn naald track, en de andere tip langs het laterale oppervlak van de rechter hemi-koord, en maak een volledige snede op de rechter hemi-koord met de schaar (Figuur 4B).
    LET OP: Gebruik een scherpe micro-schaar voor het ruggenmerg gesneden om compressie laesie te minimaliseren aan het ruggenmerg tijdens het snijden.
  10. Gebruik de laterale rand van dezelfde naald als een mes om door de laesieopening te snijden om een volledige rechter hemisectie te bevestigen. Controleer de volledigheid van de juiste hemisectie door de bodem van het wervelkanaal te visualiseren met de chirurgische microscoop (Figuur 4C, dwarsdoorsnede; Figuur 4D, zijdelingse weergave; Figuur 4E, dorsale weergave).
  11. Plaats een klein stukje gelatine spons over de laesie site (Figuur 4F). Gebruik cementmengsel en bouw een smalle brug over de spons en de spineuze processen van T8 en T10(Figuur 4G, H).
    OPMERKING: Het doel van het gebruik van een cementbrug is tweeledig: 1) het scheidt het litteken ontwikkeld op de plaats van de schade van de rest van het weefsel, en 2) het maakt het gemakkelijker om het ruggenmerg segment ontleden na dierenopoffering.
  12. Hecht de spier- en huidlagen apart met 4-0 zijden draad.
  13. Injecteer 0,9% steriele zoutzout ondermaats om hydratatie te behouden. Injecteer een pijnstillend middel Buprenorfine (0,05-2,0mg/kg S) 8-12 h/dag onderhuids gedurende 2 dagen. Druk op urineblaas 2-3 keer per dag voor de eerste week en 1-2 keer in de volgende weken tot spontane blaas ongeldig is keert terug.

4. Postoperatieve dierverzorging

  1. Breng het dier terug naar zijn kooi met één huis. Zorg voor vochtige knaagdier chow of gel op de bodem van de kooi om te helpen bij het vermogen van het dier om te eten / hydrateren. Plaats een verwarmingskussen onder de kooi tijdens het herstel na de operatie. Zorg ervoor dat het verwarmingskussen slechts de helft van de kooibodem bedekt om oververhitting te voorkomen.
  2. Injecteer 0,9% steriele zoutzout ondermaats om hydratatie te behouden. Injecteer een pijnstillend middel Buprenorfine (0,05-2,0mg/kg S) 8-12 h/dag onderhuids gedurende 2 dagen. Druk op urineblaas 2-3 keer per dag voor de eerste week en 1-2 keer in de volgende weken tot spontane blaas ongeldig is keert terug.

5. Beoordeel de unilaterale hemisectie stepping (UHS)

OPMERKING: De eenzijdige hemisectie stepping (UHS) test is een directe maatstaf voor het vermogen van SCI-dieren om hun ipsilesional achterpoot in het open veld te gebruiken. Zoals vermeld in 1.1, werden de dieren gewend aan een open veld omgeving (diameter 42 inch) 15 twee keer per dag gedurende 7 dagen. Twee waarnemers die blind zijn voor de dierengroepen voeren de test uit. UHS score op zowel baseline (7 dagen voor de T9 HX) en tijdpunten na blessure zal worden verzameld. De beoordelingsstappen worden als volgt beschreven.

  1. Plaats het dier in een open veld omgeving en onderzoek de beweging van het dier gedurende 4 min.
    OPMERKING: Tijdens het testen kan het dier worden aangemoedigd om actief te bewegen.
  2. Met het formulier in tabel 1,wijs een waarde van 1 voor Ja en 0 voor Nee voor elke gedragscategorie en som vervolgens de totale waarde om een definitieve UHS-score van 0 tot 8 te geven.
    OPMERKING: Volgens tabel 10: geen waarneembare beweging van de achterpoot; 1 – 4: geïsoleerde bewegingen van 3 achterpootgewrichten (heup, knie en enkel); 5: vegen zonder gewichtssteun; 6: plaatsing zonder gewichtssteun; 7: het plaatsen met gewichtssteun; en 8: stappen met gewichtssteun.
  3. Verzamel UHS-scores op zowel baseline (7 dagen voor de T9 HX) als tijdpunten na een blessure.
    LET OP: De scores worden op verschillende tijdspunten na de T9 HX beoordeeld.

6. Koppeling

  1. Analyseer de CPL (gangkoppeling) met een video die een dier opneemt dat op een smal baanapparaat of een eenvoudig open veld loopt.
  2. Wijs in de koppelingssectie van tabel 1een score van 0 toe voor "Nee", 1 voor "Onregelmatig/onhandig" en 2 voor "Normaal" voor elke CPL-categorie.
    OPMERKING: De koppelingstest (CPL) is het evalueren van de coördinatie van afwisselende bewegingen van ledematen, met inbegrip van homologe CPL (voorste/achterste ledematen, figuur 5A),diagonale CPL (linksvoor of rechtsvoor, linkerledematen links, figuur 5B) en homolaterale CPL (voorste/achterste ledematen aan dezelfde kant, figuur 5C). Na een T9 HX worden de tekorten van de achterpoot aan de ipsilesionalzijde zichtbaar, wat resulteert in de afwisseling van de homologe CPL (figuur 5D), diagonale CPL (figuur 5E) en homolaterale CPL (figuur 5F).

7.

OPMERKING: De test voor het plaatsen van contact met achterpoten wordt gebruikt om de motorische integratie van achterpootreacties op proprioceptieve stimuli te evalueren 16. Proprioception wordt beschouwd als intact als het dier stappen met zijn achterpoot op het oppervlak na de achterpoot wordt naar beneden getrokken onder het oppervlak.

  1. Houd het dier in een verticale positie, zodat beide achterpoten beschikbaar zijn voor de plaatsing s.
  2. Borstel het rugoppervlak van een achterpoot licht naar voren naar de rand van een oppervlak (bijvoorbeeld dierlijke werkbank).
  3. Let op de voet plaatsing op het oppervlak en wijzen een achterpoot contact plaatsen score. 0: geen plaatsing; 1: plaatsing.
    OPMERKING: Het rugoppervlak krijgt stimulatie en de voet zal zich vervolgens uitbreiden en de voet op het oppervlak plaatsen als de reflex intact is. Het beoordelingsformulier staat ook in tabel 1.

8. Grid Walking

OPMERKING: De grid walking test beoordeelt spontane motorische tekorten en ledematen bewegingen die betrokken zijn bij nauwkeurige stappen, coördinatie, en nauwkeurige poot plaatsing.

  1. Plaats een rat op een verhoogd met plastic gecoate gaasraster (36 × 38 cm met 3 cm2 openingen) en laat hem gedurende 30 treden vrij over het platform lopen.
  2. Tel het totale aantal voetstappen en het aantal voetmisstappen voor elke ledemaat. Er worden video-opnames gemaakt om het tellen te bevestigen.
    OPMERKING: Twee geblindeerde waarnemers beoordelen de plaatsing van de poot van voorpoten en achterpoten terwijl dieren lopen.
  3. Wijs de grid walking scores voor elke achterpoot als volgt toe – 0: misstappen groter dan 15; 1: misstappen van minder dan of gelijk aan 15; 2: misstappen van minder dan of gelijk aan 10; en 3: misstappen minder dan of gelijk aan 5.
    LET OP: De scorebeoordeling is gebaseerd op tabel 1. De cutoffs scores worden gebruikt als maat voor de ernst van de motorische tekorten.

9. Perfusie en weefselverwerking

  1. Na passende anesthesie vergelijkbaar in stap 2.3, doorboren de dieren zorgvuldig volgens de transcardiale perfusie protocol 17.
  2. Ontleden en verzamelen van de ruggenmerg monsters en post-fix ze in 4% PFA 's nachts.
  3. De monsters kunnen vervolgens worden overgedragen naar 30% sacharose oplossing.
  4. Snijd het ruggenmerg in dwarsdoorsnedes en bevlek de geselecteerde secties met een axon marker SMI-31 en astrocytische marker gliaal fibrillaire zure eiwitten (GFAP) volgens standaardprocedures18.

Resultaten

De hierboven beschreven chirurgische ingrepen maken de productie van een consistente en reproduceerbare laterale HX bij T9 mogelijk. Na perfusie en huidverwijdering kon de chirurgische locatie bij T9 gemakkelijk worden geïdentificeerd door een resterende hechting(figuur 6A). Verdere dissectie maakt de blootstelling van de cementbrug (Figuur 6B), en gelatine spons (Figuur 6C) in lagen. Het ruggenmerg wordt vervolgens blootgesteld aan het geopende wervelkanaal en een laterale hemisectie aan de rechterkant wordt bevestigd (Figuur 4D). Het niveau van de schade kan verder worden bevestigd door de associatie met de blootgestelde wervellichamen en ribben (Figuur 6D). Immunofluorescentie kleuring van een dwarsdoorsnede bij het epicentrum van de schade toont een volledig verlies van rechts hemicord en het behoud van de linker hemicord contralaterale aan de schade. De sectie bevlekt met een axonmarker SMI-31 en astrocytische marker gliaal fibrillaire zure eiwitten (GFAP) (Figuur 6E).

Neurobehaviorally, het CBS-HX systeem is in staat om asymmetrische tekorten te detecteren na verloop van tijd na een T9 HX. Na HX, verloor de ipsilaterale achterpoot zijn capaciteit om te stappen terwijl de contralaterale achterpoot de capaciteit behield om te lopen. Voor elke gedragsmeting hebben we 3 proeven uitgevoerd en het gemiddelde van de 3 proeven gebruikt voor kwantificering en analyse. We gebruikten pre-chirurgie maatregel als een basislijn die we beschouwen als de meest nauwkeurige controle in vergelijking met het gebruik van andere ratten. Scores van de 4 individuele metingen, d.w.z. UHS, CPL, contactplaatsing en grid walking kunnen afzonderlijk worden geanalyseerd (figuur 7A-D) of ze kunnen worden gecombineerd tot een samengestelde CBS-HX (Figuur 7E). Tweeweg ANOVA-analyses toonden significante verschillen in UHS (F = 23.199, p < 0,001), koppeling (F = 8.376, p < 0,01), contactplaatsen (F = 17.672, p < 0,001), grid walking (F = 19.261, p < 0,001), CBS-HX (F = 20.897, p < 0,001) tussen de ipsilaterale en contralaterale zijden. Figuur 7A toont de resultaten van UHS na een T9 HX. In de eerste 3 dagen na de blessure, ratten verloor de mogelijkheid om stap en kreeg een score van 0-2 voor de ipsilesional achterpoot. Stap-achtige bewegingen begon te verschijnen op de ipsilesional kant op 7-10 dagen na de schade met de meeste stappen zijn dorsale stappen. Door 28 dagen na de T9 HX, konden de ratten plantaire stappen nemen met vrijwel normale coördinatie met een toegewezen UHS score van 8. Ter vergelijking, de contralesional achterpoot werd minder onderbroken en de UHS score daalde binnen de eerste 5 dagen na de T9 HX en keerde terug naar het basislijnniveau na dag 10 na de blessure. Voor de totale CPL-test (inclusief homolaterale, homologe en diagonale koppeling) werden zowel de stabiliteit als het aanpassingsvermogen van de coördinatie na T9 HX aanzienlijk verminderd (figuur 7B). Op 1-5 dagen na de schade, de HX dieren toonde geen teken van CPL. Na verloop van tijd, CPL van de ipsilaterale achterpoot ontstaan, vaak onhandig, onstabiel, en ongepast variëren in hun snelheid, kracht en richting. Het contact plaatsen (Figuur 7C) en grid walking (Figuur 7D) van de ipsilaterale achterpoot werden ook beïnvloed door de T9 HX met name binnen de eerste 5 dagen na het letsel, en meestal hersteld toen het dier begon plantaire stappen te nemen. Het samengestelde CBS-HX-systeem omvat de UHS, CPL, contactplaatsen en netlooptests voor een maximaal mogelijke score van 18 (Figuur 7E). De motorische functie van de ipsilaterale achterpoten toonde een daling van de CBS-HX scores na de T9 laterale HX, die in overeenstemming is met de tekorten gezien in de menselijke Brown-Séquard syndroom. De motorische functie van de ipsilaterale achterpoten toonde een daling van de CBS-HX scores van 1 dag tot 4 weken na de T9 laterale HX in vergelijking met de contralaterale achterpoten (Figuur 7E).

Zo kan het samengestelde CBS-HX-systeem dat de UHS, CPL, contactplaatsing en rasterwandeling combineert, worden gebruikt om de gedragsfunctie van ratten na de laterale schade van het thoracale ruggenmerg te evalueren voor een maximaal mogelijke score van 18.

figure-results-1
Figuur 1. Chirurgische instrumenten die worden gebruikt voor het produceren van een T9 rechtszijdige hemisectie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Chirurgische exposure. A) Scheer het haar op de rug boven het operatiegebied. B) Trek spieren uit het chirurgische gebied met behulp van een oprolmechanisme. C) Stel de T8-11 wervellaminae bloot en definieer individuele spineuze processen (pijlen). Merk op dat er een grote kloof tussen de T8 en T9 spinous processen, dat is een mijlpaal voor het identificeren van T9. D) De schematische tekening toont de zijdelingse weergave van de spineuze processen. De T9-11 spinachtige processen vormen een piramide met de T10 spinous proces wordt de piek. Nogmaals, een grote kloof tussen de T8 en T9 spinous processen wordt duidelijk gezien als een mijlpaal voor het identificeren van T9 waar een laminectomie wordt uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Laminectomie en blootstelling van de juiste hemicord. A) De schematische tekening toont de dwarsdoorsnede van het ruggenmerg in de T9-wervel. De stippellijn geeft de mate van laminectomie aan elke kant aan. B) De schematische tekening toont de verwijdering van een klein deel van de lamina aan de linkerkant en de gehele wervelboog aan de rechterkant. Een pijl geeft de ruglijn van het koord aan. C) Dorsale weergave van het blootgestelde ruggenmerg. Merk op dat de dorsale ader zich in het midden van het ruggenmerg bevond dat de linker- en rechterhemicords verdeelde. De rechter hemicord was volledig blootgesteld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. Laterale hemisectie. A-D) Schematische tekeningen tonen de middellijnnaald inbrengen in het ruggenmerg (A), de T9 hemisectie (B), de bekleding van gelatine spons en cement (C), en de laterale weergave van een T9 laterale hemisectie (D). Stippellijnen in C schetsen de verwijderde T9 wervellamina en het rechter hemicord. E) Dorsale weergave van een rechter ruggenmerg hemisectie. F) Plaatsing van een klein stukje gelatine spons over de hemisectie site. G-H) Een Simplex-P cementbrug gebouwd over de spons en de spinous processen van T8 en T10. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. Schematische tekening van de koppelingstest (CPL). test. De CPL-test is het evalueren van de coördinatie van afwisselende bewegingen van ledematen, waaronder A) homologe CPL (voorste/achterste ledematen), B) diagonale CPL (linksvoor-rechts/rechts-rechts-rechts-achter linkerledematen) en C) homolaterale CPL (voorste-achterste ledematen aan dezelfde kant). Na T9 HX (rode doos, D-F), werd het tekort aan achterpoten zichtbaar aan de ipsilesional kant en de dieren tonen gebrek aan coördinatie in homolog (D), diagonaal (E), en homolaterale (F) CPL. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6. Weefseldissectie en histologie. Na de perfusie werden weefsels ontleed om het ruggenmerg bloot te leggen. Dwarsdoorsnedes werden verwerkt voor dubbele immunofluorescerende kleuring van gliafibrillaire zure eiwitten (GFAP, een marker voor astrocyten) en SMI31 (een marker voor axonen). A) Blootstelling van de hechting als oriëntatiepunt voor de plaats van de verwonding (gele pijl). B) Blootstelling van het tandcement (gele pijl). C) Blootstelling van de gelatinespons (gele pijl). D) Identificeer de spinale hemisectie aan de rechterkant (gele pijl). E) Een ruggenmergdwarsdoorsnede bij het epicentrum van de verwonding immunostained met GFAP (groen) en SMI 31 (rood). Het toont aan dat de rechter spinale hemicord volledig werd gesneden en de linker hemicord was goed bewaard gebleven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7. Resultaten van neurogedragsscores. Grafieken tonen scores van de 5 maten: A, de eenzijdige hemisectie score (UHS); B, koppeling (CPL); C, contact plaatsen; D, grid walking en E, combined behavior score (CBS) op ipsilaterale en contralaterale achterpoten na een T9 HX. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± s.e.m. *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 tussen ipsilaterale en contralaterale achterpoten (Two-way ANOVA, Tukey's multiple comparisons test, n = 12 ratten/groepen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscorenaam/bereikBeschrijvingScore
Eenzijdige achterpoot stappenWaarneembare lichte achterpootbeweging№0
(UHS)Ja1
(0-8)Beweging van enkel№0
Ja1
Beweging van knie№0
Ja1
Beweging van Heup№0
Ja1
Vegen (geen gewichtssteun)№0
Ja1
Plaatsen (geen gewichtssteun)№0
Ja1
Plaatsen (met gewichtssteun)№0
Ja1
Intensivering№0
Ja1
KoppelingHomolaterale№0
(0-6)Onregelmatig/onhandig1
Normale2
Homologe№0
Onregelmatig/onhandig1
Normale2
Diagonale№0
Onregelmatig/onhandig1
Normale2
Contact plaatsen№0
(0-1)Ja1
Het lopen van het roosterMiss stappen>150
(0-3)≤151
≤102
≤53
Totaal CBS-HX
(0-18)

Tabel 1: De gecombineerde gedragsscores voor hemisectie (CBS-HX)

Discussie

In deze studie rapporteren we stapsgewijze procedures voor het produceren van een eenvoudige, consistente en reproduceerbare T9 spinale HX bij volwassen ratten die het Brown-Séquard Syndroom bij de mens nabootsen. Verder introduceren we een gecombineerd gedragsscoresysteem voor hemisectie (CBS-HX) dat gevoelig is voor het evalueren van asymmetrische neurologische stoornissen en progressie van herstel, gemeten door een combinatie van eenzijdige achterpootstepping (UHS), koppeling (CPL), het plaatsen van contact, en grid lopen. Hoewel we de schade op T9-niveau aantonen, kan deze procedure op een eenvoudige en niet-veeleisende manier worden toegepast op andere gebieden van het ruggenmerg, waaronder de cervicale en lendenkoorden. We hopen dat dit model, samen met unilaterale gedragsbeoordelingen, nuttig zal zijn voor het onderzoeken van schademechanismen en therapeutische werkzaamheid voor dergelijke soorten SCI.

Aangezien het laterale HX-model alleen de ipsilaterale helft van het snoer aangeeft, is de contralaterale zijde van het snoer grotendeels bewaard gebleven en kan het als interne controle worden gebruikt. Veel dalende en opgaande paden worden eenzijdig geprojecteerd en een zijdelingse hemisectie veroorzaakt in veel omstandigheden schade aan een axonale darmkanaal aan de ene kant en behoudt hetzelfde traktaat aan de andere kant, waardoor een vergelijking van reorganisatie en functionele gevolgen van deze traktaten bij hetzelfde dier. Bovendien kan het produceren van een meer gelokaliseerde laesie het mogelijk maken om specifieke trajecten te targeten. Bijvoorbeeld, een ventrale en ventrolaterale laesie kan invloed hebben op reticulospinale en vestibulospinale paden. Een dorsale of dorsolaterale laesie kan de corticospinale en rubrospinale paden beïnvloeden. De hemisectie of gedeeltelijke schade model kan ook worden gebruikt om de anatomie en functie van andere trajecten te bestuderen, zoals de propriospinale, noradrenergic of serotonergic trajecten. Zo kan het hemisectiemodel op unieke wijze worden gebruikt om compensatie te bestuderen door zintuiglijke affiniteiten, door dalende paden en door intrinsieke spinale circuits. Dit model is ook geschikt voor het onderzoeken van mechanismen van motorisch herstel na HX.

De laterale HX leidt tot duidelijke gedragsstoornissen, die kunnen worden beoordeeld onder motorische taken (bijvoorbeeld Treadscan of Loopband) paradigma voor de geautomatiseerde ganganalyse 19. Ook de geleidbaarheid van de axonale traktaten aan de contralaterale kant van de laesie kan worden gemeten met behulp van elektrofysiologische opnames, en deze evaluatie biedt de mogelijkheid om een functionele reorganisatie na verschillende behandelingen vast te stellen. Bovendien, eenzijdige injecties van de anatomische tracers in neuronen van een bepaalde route mogelijk visualisatie van anterogradely gelabeld midline kruising vezels en hun verbinding met retrograde ly gelabeldneuronen20,21,22,23,24,25.

Hoewel een typische spinale HX-operatie minder dan 20 minuten in beslag neemt, vereist het enige oefening om een nauwkeurige en consistente HX te bereiken. Ten eerste is het belangrijk dat het HX-niveau van dier tot dier consistent is. Daarom is het van cruciaal belang dat het juiste wervelsegment voor laminectomie wordt geïdentificeerd. Ten tweede, zorg ervoor dat de HX is voltooid. Om een complete HX te maken, kan men een 30-gauge naald verticaal ingebracht door de middellijn gebruiken om het snijden met behulp van microscissors te begeleiden. Het inbrengen van de naald voorkomt ook schade aan de achterste spinale vaten of koord over laesies. De tweede functie van de 30-gauge naald is dat het kan dienen als een mes om de snede te traceren om ervoor te zorgen dat er geen dubbelzinnigheid van de laesie. Ten derde kan het plaatsen van gelatine op de laesieplaats de lekkage van hersenvocht minimaliseren en het cement bovenop de gelatine plaatsen en het overbruggen van de wervellamina de stabiliteit van de wervelkolom op de laesieplaats versterken en wondgenezing vergemakkelijken. Om te voorkomen dat het signaal interferentie met de toepassing van elektrofysiologische opnamen, spieren, fascia, en de huid moet worden gehecht in lagen met 4-0 zijden draad. Ten slotte moet alles in het werk worden gesteld om de schade aan het contralaterale ruggenmerg te minimaliseren. Er moet een histologische controle worden ingesteld om een volledige zijdelingse hemisectie aan de ene kant en het behoud van de andere helft van het koord aan de andere kant te bevestigen (zoals afgebeeld in figuur 6E).

Om de bewegingsvrijheid na SCI te verbeteren, hebben eerdere studies gebruik gemaakt van een breed scala aan strategieën, waaronder celtransplantatie, axonregeneratie 8,18,26,27en op activiteiten gebaseerde revalidatie 28,29,30. Ondertussen zijn verschillende gedragstests vastgesteld voor functionele beoordeling en om te screenen op de beste behandelingen na SCI. De BBB locomotorische ratingschaal is ontworpen voor motorische beoordeling van spinale symmetrische verwondingen, zoals een middenlijnkneuzing of transsectieletsels die van invloed zijn op bilaterale achterpoten 14,31. Bepaalde parameters van BBB, zoals coördinatie en teenklaring, worden geregistreerd door beide achterpoten te observeren. Als een achterpoot intact is en de andere vertoont tekorten zoals gezien in asymmetrische verwondingen, dan is de intacte achterpoot zal verwarren de score van de aangetaste achterpoot. Aangezien de BBB-score niet geschikt is voor de ene achterpoot score van de andere na de eenzijdige blessure, is het niet ideaal voor de beoordeling van eenzijdige dwarslaesie. Echter, als gezamenlijke beweging en gewichtssteun aan elke kant afzonderlijk worden beoordeeld en niet worden berekend als onderdeel van de BBB, dan zal de intacte achterpoot (vergelijkbaar met een schijncontrole) de score van de aangetaste achterpoot niet verwarren. Bovendien zal de intacte kant niet bias de totale score van het dier, omdat de intacte achterpoot heeft geen dramatische tekorten in gezamenlijke beweging, gewichtsondersteuning, of intensivering.

De gecombineerde gedragsscore voor hemisectie is ontworpen om een gevoelige en gemakkelijk uitgevoerde evaluatie van gedragsherstel in het rattenmodel van laterale hemisectie te zijn. Het kan worden gebruikt om gedrag van zowel vroege als late fasen van herstel te beoordelen. De vroege fase is binnen 7-10 dagen na de blessure. In de eerste 3-5 dagen na HX nam de activiteit van de ipsilaterale achterpoot gestaag toe en moet vaker worden beoordeeld om spontane of door de behandeling gemedieerde herstelbewegingen van de achterpoot op te nemen. Door 5-7 dagen na-HX, ratten begon te vegen achterbeen bewegingen te maken zonder gewichtssteun. Door 7-10 dagen, ratten meestal begon te staan en stap. Tijdens deze fase moet aandacht worden besteed aan het stappenpatroon. In de late fase (14-28 dagen) was de activiteit van de ipsilaterale achterpoot stabiel en dicht bij normaal.

Er moet ook veel aandacht worden besteed aan de capaciteit van de koppeling (CPL). De CPL-test (loopkoppeling) kan worden uitgevoerd met een video (bijvoorbeeld Treadscan/Catwalk) of een filmvideo tijdens een open-veldtest. De tweede optie biedt flexibiliteit als de onderzoekers geen toegang hebben tot het loopanalysesysteem. Voor beide video-opnamesessies is minimaal twee opeenvolgende touchdowns voor elke voet vereist voor deze test. Voor de analyse zijn er drie koppelingsparameters: homologe, homolaterale en diagonale koppeling (stap 6.2). Elke koppeling omvat een referentievoet en de gegeven voet. Neem homologe koppeling (linksvoor rechts, of achterlinks-achter rechts) bijvoorbeeld, het is de eerste touchdown tijd van de gegeven voet gedeeld door een hele pas tijd van de referentie voet. Aangezien de linker- en rechtervoet uit fase moeten zijn, moet de perfecte koppeling 0,5 zijn. Dit is hetzelfde geval in homolaterale koppeling (links voor-links achter, of rechts voor-rechts achter). Echter, voor diagonale koppeling (links voor-rechts achter, of rechts voor-links achter), moet de perfecte koppeling 0 of 1, omdat de twee voeten moeten worden in fase. In stap 6.4 wijzen we voor elke CPL een score toe van 0 tot 2. In details, een score 0 zal vertegenwoordigen de gegeven voet niet in staat is om te bewegen om een touchdown te voltooien, dus geen CPL; een score 1 vertegenwoordigt een onregelmatige of onhandige CPL sinds de gegeven voet een touchdown voltooit, maar niet in de perfecte koppeling; een score 2 betekent een perfecte koppeling van 0,5. De drie koppelingsparameterconcepten zijn goed beschreven in de vorige publicaties32,33. CPL kan worden gecombineerd met de beoordelingen van contactplaatsing en grid walking. Individuele componenten van het gecombineerde gedragsscoresysteem zullen min of meer effectief zijn in verschillende rattenmodellen van SCI. Voor CPL werden de tekorten duidelijk zichtbaar in de mate van afwisseling en de volledigheid van de sequentie. Proprioceptive achterpoot plaatsen van tekorten kan duidelijk worden onthuld na eenzijdige HX. In onze studie, alle ratten toonde ipsilesional achterpoot plaatsen van tekorten, terwijl de contralaterale achterpoot plaatsen toonde geen tekorten. De grid walking test moet worden overwogen wanneer contact plaatsen, waarbij het corticospinale kanaal, begint te herstellen. Om eventuele vermoeidheidsproblemen uit te sluiten, kan de volgorde van gedragstests bij elke test worden gerandomiseerd.

Tot slot rapporteren we stapsgewijze procedures om een reproduceerbaar in vivo rattenmodel te maken van de T9 spinale HX die het Brown-Séquard Syndroom bij de mens nabootst. Het gecombineerde gedragsscoresysteem voor hemisectie biedt een meer discriminerende maat voor individuele gedragsresultaten achterpoten voor de evaluatie van letselmechanismen en behandelingen na een eenzijdige SCI. Hoewel we alleen een visuele beschrijving geven van de chirurgische ingrepen en gedragsbeoordelingen van een thoracale HX, kunnen hier beschreven methoden worden toegepast op andere onvolledige SGB's op verschillende letselniveaus.

Openbaarmakingen

We hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

Wij danken de heer Jeffrey Recchia-Rife voor zijn uitstekende technische bijstand. Dit werk werd mede ondersteund door de Stichting van directeur van het Algemeen Ziekenhuis van Jinan Militaire Regio Chines PLA 2016ZD03 en 2014ZX01 (XJL en TBZ). Onderzoek in het Xu-laboratorium wordt ondersteund door NIH 1R01 100531, 1R01 NS103481 en Merit Review Award I002356, I01 BX003705, I01 RX002687 van het Amerikaanse Ministerie van Veteranenzaken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Baby-Mixter HemostatFST13013-14Kan elke merk zijn naar keuze
Verhoogd kunststof gecoat gaasAlle36×38 cm met 3 cm2 openingen
GelschuimMoore Medical2928Kan elke merk zijn naar keuze.
Grip cement kit, poeder en oplosmiddelDentsply675570Kan elke merk zijn naar keuze.
Microbead SterilizerFSTNAKan elke merk zijn naar keuze
Pearson RongeurFST16015-17Kan elke merk zijn naar keuze.
RetractorenJinxie chirurgische gereedschappen6810Kan elke merk zijn naar keuze
Scalpel HandvatFST10003-12Kan elke merk zijn naar keuze
Simplex-P cementStrykerKan elke merk zijn naar keuze.
TreadScan automatische ganganalyseCleverSys IncNAKan elke merk zijn naar keuze

Referenties

  1. Center, N. S. C. I. S. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet. , (2018).
  2. Zhang, X. Y., Yang, Y. M. Scissors stab wound to the cervical spinal cord at the craniocervical junction. Spine Journal. 16 (6), e403-e406 (2016).
  3. Enicker, B., Gonya, S., Hardcastle, T. C. Spinal stab injury with retained knife blades: 51 Consecutive patients managed at a regional referral unit. Injury. 46 (9), 1726-1733 (2015).
  4. Witiw, C. D., Shamji, M. F. Brown-Sequard syndrome from herniation of a thoracic disc. Canadian Medical Association Journal. 186 (18), 1395(2014).
  5. Webb, A. A., Muir, G. D. Compensatory locomotor adjustments of rats with cervical or thoracic spinal cord hemisections. Journal of Neurotrauma. 19 (2), 239-256 (2002).
  6. Filli, L., Zorner, B., Weinmann, O., Schwab, M. E. Motor deficits and recovery in rats with unilateral spinal cord hemisection mimic the Brown-Sequard syndrome. Brain. 134 (Pt 8), 2261-2273 (2011).
  7. Friedli, L., et al. Pronounced species divergence in corticospinal tract reorganization and functional recovery after lateralized spinal cord injury favors primates. Science Translational Medicine. 7 (302), (2015).
  8. Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. European Journal of Neuroscience. 11, 1723-1740 (1999).
  9. Gulino, R., Dimartino, M., Casabona, A., Lombardo, S. A., Perciavalle, V. Synaptic plasticity modulates the spontaneous recovery of locomotion after spinal cord hemisection. Neuroscience Research. 57 (1), 148-156 (2007).
  10. Xu, X. M., Martin, G. F. The response of rubrospinal neurons to axotomy in the adult opossum, Didelphis virginiana. Experimental Neurology. , 46-54 (1990).
  11. Wu, W., et al. Axonal and Glial Responses to a Mid-Thoracic Spinal Cord Hemisection in the Macaca fascicularis Monkey. Journal of Neurotrauma. , (2013).
  12. Shi, F., et al. Glial response and myelin clearance in areas of wallerian degeneration after spinal cord hemisection in the monkey Macaca fascicularis. Journal of Neurotrauma. 26 (11), 2083-2096 (2009).
  13. Nout, Y. S., et al. Methods for functional assessment after C7 spinal cord hemisection in the rhesus monkey. Neurorehabililation and Neural Repair. 26 (6), 556-569 (2012).
  14. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  15. Liu, N. K., et al. Cytosolic phospholipase A2 protein as a novel therapeutic target for spinal cord injury. Annals of Neurology. 75 (5), 644-658 (2014).
  16. Kunkel-Bagden, E., Dai, H. N., Bregman, B. S. Recovery of function after spinal cord hemisection in newborn and adult rats: differential effects on reflex and locomotor function. Experimental Neurology. 116, 40-51 (1992).
  17. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiment. (65), (2012).
  18. Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNF-overexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  19. Liu, J. T., et al. Methotrexate combined with methylprednisolone for the recovery of motor function and differential gene expression in rats with spinal cord injury. Neural Regeneration Research. 12 (9), 1507-1518 (2017).
  20. Schnell, L., et al. Combined delivery of Nogo-A antibody, neurotrophin-3 and the NMDA-NR2d subunit establishes a functional 'detour' in the hemisected spinal cord. European Journal of Neurosciences. 34 (8), 1256-1267 (2011).
  21. Arvanian, V. L., et al. Chronic spinal hemisection in rats induces a progressive decline in transmission in uninjured fibers to motoneurons. Experimental Neurology. 216 (2), 471-480 (2009).
  22. Hunanyan, A. S., et al. Alterations of action potentials and the localization of Nav1.6 sodium channels in spared axons after hemisection injury of the spinal cord in adult rats. Journal of Neurophysiology. 105 (3), 1033-1044 (2011).
  23. Garcia-Alias, G., et al. Chondroitinase ABC combined with neurotrophin NT-3 secretion and NR2D expression promotes axonal plasticity and functional recovery in rats with lateral hemisection of the spinal cord. Journal of Neuroscience. 31 (49), 17788-17799 (2011).
  24. Petrosyan, H. A., et al. Neutralization of inhibitory molecule NG2 improves synaptic transmission, retrograde transport, and locomotor function after spinal cord injury in adult rats. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4032-4043 (2013).
  25. Yu, Y. L., et al. Comparison of commonly used retrograde tracers in rat spinal motor neurons. Neural Regeneration Research. 10 (10), 1700-1705 (2015).
  26. Lu, P., et al. Long-distance axonal growth from human induced pluripotent stem cells after spinal cord injury. Neuron. 83 (4), 789-796 (2014).
  27. Teng, Y. D., et al. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells. PNAS. 99, 3024-3029 (2002).
  28. Wang, H., et al. Treadmill training induced lumbar motoneuron dendritic plasticity and behavior recovery in adult rats after a thoracic contusive spinal cord injury. Experimental Neurology. 271, 368-378 (2015).
  29. Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (Pt 10), 2338-2358 (2005).
  30. Ichiyama, R. M., et al. Step training reinforces specific spinal locomotor circuitry in adult spinal rats. Journal of Neuroscience. 28 (29), 7370-7375 (2008).
  31. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Experimental Neurology. 139, 244-256 (1996).
  32. Li, S., et al. Assessing gait impairment after permanent middle cerebral artery occlusion in rats using an automated computer-aided control system. Behavioural Brain Research. 250, 174-191 (2013).
  33. Bonito-Oliva, A., Masini, D., Fisone, G. A mouse model of non-motor symptoms in Parkinson's disease: focus on pharmacological interventions targeting affective dysfunctions. Frontiors in Behavioral Neuroscience. 8, 290(2014).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Hemisectie van het ruggenmergBrown S quard modelCombined Behavior Scaleunilateraal stappen van de achterpootgrid loopanalysecontact placingtestT9 wervelniveaurattenmodel voor SCIasymmetrische gedragsbeoordeling
Ruggenmerg laterale hemisectie en asymmetrische gedragsbeoordelingen bij volwassen ratten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.