Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

Samenvatting

Dit protocol beschrijft in detail hoe te fabriceren en te exploiteren van microfluidic apparaten voor röntgendiffractie gegevensverzameling bij kamertemperatuur. Bovendien, het beschrijft hoe eiwitten kristallisatie controleren door Dynamische lichtverstrooiing en hoe om te verwerken en analyseren diffractie gegevens verkregen.

Samenvatting

Dit protocol beschrijft om microfluidic apparaten met lage X-ray achtergrond geoptimaliseerd voor goniometer vaste doelstelling seriële kristallografie gebaseerde. De apparaten zijn patroon van epoxy lijm met behulp van zachte lithografie en zijn geschikt voor in situ röntgendiffractie experimenten bij kamertemperatuur. De monster-putten zijn hardplastic aan beide zijden bekleed met polymere polyimide folie windows waarmee diffractie gegevensverzameling met lage X-ray achtergrond. Deze fabricage methode is undemanding en goedkoop. Na de inkoop van een SU-8 meester wafer, kan alle fabricage worden uitgevoerd buiten een cleanroom in een typische onderzoeksomgeving lab. Het protocol voor ontwerp en fabricage van chip gebruiken capillaire kleppen te splitsen een waterige reactie in gedefinieerde nanoliter formaat druppeltjes microfluidically. Dit mechanisme laden vermijdt het verlies van de steekproef van dode-volume kanaal en kan gemakkelijk handmatig worden uitgevoerd zonder gebruik te maken van pompen of andere apparatuur voor vloeiende bediening. We beschrijven hoe geïsoleerd nanoliter formaat druppels eiwit oplossing kan worden gecontroleerd in situ door dynamische licht verstrooiing controle eiwit crystal nucleatie en groei. Nadat geschikt kristallen geteeld worden, kan volledige röntgendiffractie datasets worden verzameld met behulp van goniometer gebaseerd in situ vaste doelstelling seriële röntgendiffractie bij kamertemperatuur. Het protocol biedt aangepaste scripts voor het verwerken van diffractie datasets met behulp van een suite van softwaretools op te lossen en verfijnen van de eiwit-kristalstructuur. Deze aanpak voorkomt de artefacten die eventueel veroorzaakte tijdens cryo-behoud of handmatige crystal behandeling in conventionele kristallografie experimenten. We presenteren en vergelijk drie eiwit structuren die werden opgelost met behulp van kleine kristallen met afmetingen van ongeveer 10-20 µm gegroeid in chip. Door het kristalliseren en buigingsinrichting in situ, overslag en vandaar mechanische storingen van fragiele kristallen wordt geminimaliseerd. Het protocol detailleert hoe te fabriceren van een aangepaste X-ray transparante microfluidic chip geschikt voor in situ seriële kristallografie. Zoals bijna elke crystal kan worden gebruikt voor het verzamelen van de gegevens van diffractie, zijn deze microfluidic chips een zeer efficiënt crystal leveringsmethode.

Inleiding

Het kennen van de 3D structuur van een eiwit is essentieel om te begrijpen van de functionaliteit. In de buurt van de atomaire resolutie structuren zijn tot nu toe meestal verkregen door middel van röntgendiffractie. Deze techniek bloot eiwit kristallen aan Röntgen straling en de resulterende diffractie patronen worden vervolgens geanalyseerd voor structuurbepaling en verfijning. In traditionele röntgendiffractie, is een volledige diffractie dataset opgenomen van een enkele, ideaal groot, kristal bij cryogene temperaturen. Deze kristallen, zijn echter meestal niet triviaal om te groeien en te identificeren van geschikte cryo-behoud voorwaarden kan worden uitdagend op zichzelf en kan soms ook leiden tot afwijkingen van de inheemse proteïne structuur⁵.

Recente technologische vooruitgang in X-ray gratis-elektron laser (FEL) en synchrotron straallijnen hebben toegestaan om op te lossen structuren van kleinere kristallen, als nieuwe micro-focusing straallijnen, verhoogde X-ray beam schittering en verbeterde X-ray detectoren werd beschikbaar:^6,7. Kleine kristallen zijn doorgaans gemakkelijker te groeien dan grote en defect gratis kristallen^8,9. Echter lijden kleine kristallen X-ray stralingsschade veel sneller dan grote kristallen. Dit is omdat in vergelijking met een groot kristal, een hogere dosis van X-ray in een kleiner volume van het kristal te diffract naar vergelijkbare resolutie moet worden geprojecteerd. Zelfs cryogene bescherming is daarom vaak niet voldoende om vast te leggen van een volledige diffractie-gegevensset van een enkele microcrystal.

Om te overwinnen deze hindernis, seriële kristallografie uitgegroeid tot de methode van keuze te verzamelen en samenvoegen van diffractie patronen uit vele willekeurig georiënteerde microcrystals te verkrijgen van een volledige dataset. Straling geïnduceerde crystal schade wordt geminimaliseerd door het verspreiden van de totale dosis röntgenstraling gebruikt bij het oplossen van de eiwitstructuur van een over een groot aantal kristallen^5,10. In een ' diffract voordat vernietigen ' FEL experimenteren, elk kristal wordt alleen gebruikt voor één blootstelling met behulp van femto-tweede X-ray pulsen. Micro-focus straallijnen op derde generatie synchrotron bronnen kunnen op hun beurt uitvoeren seriële kristallografie met een paar milliseconden korte X-ray blootstelling^11,12,13,14. Zonder een kristal trilling of rotatie tijdens het verzamelen van gegevens, echter alleen gedeeltelijke Bragg reflecties kunnen worden opgenomen en dus tienduizenden of meer diffractie patronen zijn meestal nodig voor de structuur vastberadenheid¹⁵. Tot op heden, is een gevarieerde set van methoden voor het afleveren van monster ontwikkeld voor seriële kristallografie, als onlangs herziene^{14,16,17,18,19}. Onder degenen, verschillende vaste-target gebaseerd monster levering strategieën werden met succes gecombineerd met crystal rotatie tijdens X-ray belichtingen zodanig dat aanzienlijk minder diffractie patronen ook volledige bestanden bieden kunnen terwijl het ook verbruiken minder monster in vergelijking tot klassieke seriële kristallografie experimenten waar stilstaande beelden zijn opgenomen^{7,16,20,21,22,23 , 24}.

We presenteren een protocol om het fabriceren van microfluidic apparaten met lage X-ray achtergrond. De apparaten zijn patroon van 5-min epoxy lijm met behulp van zachte lithografie en zijn geschikt voor in-situ röntgendiffractie experimenten bij kamertemperatuur, die profiteren van de integratie van de bereiding van de monsters rechtstreeks in de X-ray set-up, in voorkomend geval met time-resolved studies die mengen-geïnduceerde kinetiek^{18,19 volgen}. Microfluidic kanalen zijn hardplastic aan beide zijden met polymere polyimide folie, resulterend in X-ray windows met een gecombineerde dikte van ongeveer 16 µm waarmee voor lage X-ray achtergrond imaging. Alle gebruikte materialen bieden goede oplosmiddel weerstand. Deze fabricage methode is relatief eenvoudig en goedkoop. Na de inkoop van een SU-8 meester wafer, kan alle fabricage worden uitgevoerd buiten een cleanroom in een typische onderzoek lab omgeving.

In een toepassing bijvoorbeeld beschrijven we chips voor goniometer vaste doelstelling seriële kristallografie gebaseerde. Ten eerste, het ontwerp en de fabricage overwegingen voor het gebruik van de capillaire kleppen te splitsen een waterige reactie in een geselecteerd aantal nanoliter formaat druppels microfluidically worden besproken. Dit mechanisme laden vermijdt het verlies van de steekproef van kanaal doden-volume en splitsen kan gemakkelijk uitgevoerd worden handmatig zonder gebruik te maken van pompen of andere apparatuur voor vloeiende bediening. Deze geïsoleerde nanoliter formaat druppels eiwit oplossing zijn gecontroleerde in situ met behulp van Dynamische lichtverstrooiing (DLS &) controle eiwit crystal nucleatie en groei. Eerder is gebleken dat DLS in microfluidic apparaten die bestaat uit een structuur van de Polydimethylsiloxaan (PDMS metingenmogen) gebonden aan een glas dia^25,26. Omdat de polyimide laag een hoge transmissie voor golflengtes langer dan 550 heeft nm, de aanpak kan worden uitgebreid naar maten in X-ray transparante chips, bij gebruik van een passende laser golflengte^27,28. Gebaseerd op de resultaten van Distributielijsten, eerste nucleatie kan worden waargenomen, en verdere druppel verdamping kan worden gestopt met het oog op minder, maar grotere eiwit kristallen.

Na voldoende kristallen geteeld worden, kan volledige röntgendiffractie datasets dan worden verzameld met behulp van goniometer gebaseerd in situ vaste doelstelling seriële röntgendiffractie bij kamertemperatuur. Diffractie datasets worden verwerkt met behulp van een reeks softwarehulpmiddelen en aangepaste scripts op te lossen de kristalstructuur van eiwit. Deze techniek vermijdt artefacten vaak geïnduceerde tijdens cryo-behoud gebruikt in conventionele kristallografie experimenten.

We vergelijken drie eiwit doel structuren die werden opgelost met behulp van over 10-20 µm kleine kristallen gegroeid in chip beter dan 2 Å resolutie. Door het kristalliseren en buigingsinrichting in situ, overslag en vandaar mechanische storingen van fragiele kristallen wordt geminimaliseerd. Dit protocol kan worden toegepast voor eiwit kristallen die diffract op hoge resolutie, evenals lage resolutie (1.7 Å naar 3.0 Å). Zoals bijna elke crystal worden voor diffractie gebruikt kan, wordt kleine monster verspild, waardoor dit een zeer efficiënte crystal leveringsmethode.

Dit protocol biedt een gedetailleerde gids over hoe voor te bereiden X-ray transparante microfluidic chips in situ eiwit kristallisatie en diffractie gegevensverzameling. De procedure is zorgvuldig ontworpen om te profiteren van de microfluidic precisie zonder geavanceerde apparatuur in het lab. Verzamelen van de gegevens op de synchrotron beamline, kan ook door niet-deskundigen zonder een gespecialiseerde goniometer of luchtbevochtiger te gemakkelijk reproduceren de resultaten te worden uitgevoerd. De gepresenteerde techniek kan worden toegepast voor seriële milliseconde kristallografie gegevensverzameling bij kamertemperatuur terwijl de stralingsschade minimaal en zonder invoering van stress aan de kristallen na groei door cryo-bescherming of crystal behandeling. Vandaar dat de beschreven methode is geschikt voor elk eiwit kristallisatie project.

Protocol

1. chip ontwerp en fabricage van de meester

1. Masker ontwerp
   1. Een overzicht van gewenste kanaal meetkundes met behulp van een geschikte CAD-tekenprogramma. Voor elke laag fotoresist, bereiden een individuele masker. Alle ontwerpen gebruikt in dit protocol worden besproken in detail in het gedeelte ' resultaten ' en zijn beschikbaar als AutoCad '. DWG' formaat in de aanvullende bestand 1.
      Opmerking: Voor het bouwen van all-PDMS apparaten, de hoogte-breedteverhouding van kanaal hoogte en de breedte mag niet meer dan 1:10 om te voorkomen dat instorting van het kanaal. Zowel polyimide folie uitgeharde epoxyhars steviger en zijn in principe mag ook hogere hoogte-breedteverhoudingen. Echter wij doelbewust niet meer dan de 1:10 verhouding, dus die ontwerpen eerste prototyped als traditionele PDMS apparaten kon worden.
   2. CAD-bestanden worden omgezet in emulsie film fotomaskers. Gebruik een nominale 64 k DPI resolutie om nauwkeurige functies tot ongeveer 5 µm grootte.
      Opmerking: Dit kan gebeuren door middel van een commerciële dienst. Imaging services, kunt verschillende tekening verdragen te stroomlijnen bestandsconversie voor masker imaging. Gelieve te informeren over de gewenste tekening verdragen upfront om te voorkomen dat moeizame probleemoplossing tijdens de conversie. Maskers met transparante functies op zwarte achtergrond zal het patroon van SU8 fotoresist functies op de wafer functionele PDMS microchannels tijdens replica molding opleveren. Op zijn beurt, zijn zwarte functies op transparante achtergrond maskers nodig om te bereiden PDMS mallen geschikt voor X-ray chip fabricage. Het is raadzaam beide polariteiten masker te maken voor vroege prototyping en ontwerp validatie te fabriceren PDMS apparaten vóór het vertalen van het ontwerp in X-ray chips te bestellen.
2. SU8 master fabricage
   Opmerking: Dit is het enige proces dat moet worden uitgevoerd in een cleanroom. Als kritische cleanroom apparatuur niet beschikbaar is, kan de volledige stap worden uitbesteed aan MEMS-gieterij servicebedrijven die klaar patroon SU8 meesters leveren. Proces SU8 volgens de gegevens vel instructie. Stappen 1.2.1 tot en met 1.2.4 vatten de algemene SU8 master fabricage workflow, met de volledige parameters voor de drie lagen X-ray chip ontwerp vermeld in tabel 1. Een inleiding tot multi-layer SU8 uitlijning is gepubliceerd eerder²⁹.
   1. Giet ongeveer 1 mL van SU8 weerstaan naar de 3-inch wafer en spin jas de SU8 tot de gewenste dikte met behulp van passende vrille vaart en tijd zoals aangegeven in tabel 1 (Figuur 1, stap 1). Bak vooraf de fotoresist naargelang de laagdikte bij 65 ° C en 95 ° C gedurende een paar minuten elke. Voer de pre bak om te stollen van SU8 om te voorkomen dat het vasthouden aan de photomask en ter verbetering van weerstaan hechting aan de ondergrond (Figuur 1, stap 2).
   2. Bloot de fotoresist aan UV-licht zoals aangegeven in tabel 1 gevolgd door een na-exposure-bak bij 95 ° C te catalytically voltooien het reactiemechanisme dat wordt gestart tijdens de blootstelling (Figuur 1, stap 3).
   3. Herhaal deze stappen voor elke volgende laag. Vervolgens sluiten de fotomaskers van de latere laag bij de meester met behulp van een masker aligner en schuifmaat gemeten uitlijning merken²⁹.
   4. Wegwassen alle onbelicht SU8 weerstaan door de ontwikkeling van de wafer in propyleenglycol methylacetaat ether (PGMEA), totdat isopropanol spoelen niet langer onthult melkachtig neerslag (Figuur 1, stap 4). Droog de wafer met hydrofoor stikstof.
      Opmerking: Isopropanol is een oplosmiddel arme SU8 en haar neerslag geeft aan resterende niet-uitgeharde resten.
3. PDMS schimmel fabricage
   1. Plaats een stuk aluminiumfolie (15 × 15 cm) in een petrischaal (10 cm) en plaats van de meester van de SU8 op de aluminiumfolie in de petrischaal voor het eenvoudig verwijderen van de master na het PDMS uitharden.
   2. Meng silicone basis met het genezen van de agent (10:1), resulterend in een totaal bedrag van 25 g, krachtig met een spatel in een pot of een mechanische mixer. Een 3-inch wafer in een petrischaal (10 cm) verbruikt ongeveer 25 g voor PDMS resulteren in een 5 mm dikke plaat.
   3. Giet vooraf gemengde PDMS op het SU8-model (Figuur 1, stap 5) tot een hoogte van 4 mm. de Desiccate de PDMS gedurende 5 minuten om te verwijderen van luchtbellen totdat geen, of slechts enkele luchtbellen blijven op het oppervlak van het PDMS.
   4. Genezen het PDMS in een oven bij 70 ° C gedurende 1 uur. Vervolgens uitknippen de uitgeharde PDMS met een scalpel en zachtjes schil de PDMS schimmel uit het SU8 model (Figuur 1, stap 6). Snijden helemaal tot aan de kapitein te voorkomen PDMS scheuren tijdens peeling.
   5. Optioneel: Bereiden transversale segmenten van het PDMS mallen om te bevestigen dat alle SU8-lagen op de master de gewenste diktes (Figuur 1 hebben). Vroege microfluidic kanaal lay-out tests kan worden uitgevoerd in alle PDMS chips.
      Opmerking: Een replica-gegoten PDMS kan verlijmen direct op een glazen substraat na ponsen-poorten (stap 3.3) in het PDMS via O₂ plasma activeren met behulp van 20 s, 0.4 mbar O₂, 50 W, 13,56 MHz. Zoals opgemerkt in paragraaf 1.2., dit vereist tegenover maskeren van polariteit en vandaar wafer schets voor X-ray chip fabricage.

2. in Situ X-ray Chip Fabrication

1. Verdun beide epoxy hars precursoren in ethanol tot een definitieve ethanol-concentratie van 40% van de wt. Een totale massa van 0,25 g elke epoxy hars precursor in ethanol is voldoende voor een 1 cm² chip.
   Opmerking: Dit vermindert de viscositeit van de resulterende 5 minuten epoxy bubble-free mengen en replica-mal gieten te vereenvoudigen en om te minimaliseren van de dikte van de definitieve uitgeharde epoxy-laag. De ethanol verdampt via de PDMS tijdens de uithardende stap.
2. Ontgas de PDMS schimmel in een vacuüm exsiccator gedurende 30 minuten, zodat het kleine luchtbellen uit de epoxyhars tijdens de molding stap absorberen kan.
3. Snijd de polyimide folie ongeveer 70 × 70 mm en span het rond een 75 × 50 mm dia met behulp van tape om het verkrijgen van een plat en stijf oppervlak met de tape op de achterkant van glas. Plasma activeren de folie met 50 W, 13,56 MHz, 0.4 mbar O₂ plasma voor 20 s, vervolgens Incubeer de volledige folie-dia in een waterige oplossing van 1 vol % (3-aminopropyl) trimethoxysilane (APTS) of (3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GPTS) gedurende 5 minuten bij 20 ° C.
4. Grondig meng beide ethanol verdund epoxy voorloper oplossingen zodat optimale uithardende gedrag. PDMS-mallen halen uit de Vacuuemcel en plaats ze op een plat oppervlak. Vervolgens snel het afzien van een druppel van gemengde hars op elke microstructuur op de mal met behulp van een micropipet (ongeveer 10 µL per 1 cm² van microstructuren) (Figuur 1, stap 7a).
5. De sandwich van polyimide folie-dia ophalen uit de waterige silane (APTS of GTPS) oplossing. Droog de folie met perslucht of stikstof.
6. Plaats de voorbereide polyimide folie-glasplaatje sandwich op de gedeponeerde epoxyhars (Figuur 1, Stap 7b). Druk stevig op het glasplaatje gekoppeld aan de polyimide folie tegen de PDMS schimmel. Het plaatsen van een metalen plaat op het glasplaatje en vervolgens storting gewichten toe te passen tot 1.4 N/cm² druk gedurende 1 uur, terwijl de epoxy hars kuren bij kamertemperatuur.
   Vergeet niet: Bij voorkeur geen hars blijft op de folie in de gebieden waar de structuren in de mal de maximale hoogte hebben. Deze komen overeen met de kristallisatie putten waar de kristallisatie daarna plaatsvindt.
   1. Optioneel: Als nauwkeurige molding van kleine elementen is van cruciaal belang, de PDMS schimmel kan worden versterkt met een aluminium frame tijdens de plinten stap³¹.
7. Het glasplaatje met de polyimide folie en het patroon epoxy verwijderen door het schillen van de PDMS mal (Figuur 1 stap 8). Plasma activeren de patroon epoxy kant met 50 W, 13,56 MHz, 0.4 mbar O₂ plasma voor 20 s.
8. Na de verwijdering van de folie polyimide uit de plasma-zaal, Incubeer de folie epoxy-patroon in een 1% waterige APTS (of GPTS)-oplossing van vol gedurende 5 minuten bij 20 ° C. Op dezelfde manier bereiden een tweede VN-patroon polyimide folie met de complementaire 1 vol % GPTS (of APTS) silane activering. Na de incubatie, droge zowel gestructureerde en ongestructureerde folie met perslucht.
9. Plaats de epoxy zijde bedrukte zijde naar boven op een vlakke ondergrond, met behulp van de oppervlaktespanning van een druppel water onder als bemiddelaar te krullen van de folie te voorkomen en om maximale vlakheid. Plaats vervolgens de tweede geactiveerde polyimide folie op boven- en zachtjes streak met uw vinger van de ene hoek naar het tegenovergestelde deze obligatie te maken en om te voorkomen dat de vorming van luchtbellen.

3. toegang-poorten voor vlotte levering

1. 4 mm dikke PDMS platen in een petrischaal volgens stappen 1.3.1 aan 1.3.3 bereiden zonder gebruik te maken van de SU8-master. Snijd de plak in PDMS blokjes van passende omvang ter dekking van alle inlaat poorten in de chip, zonder die betrekking hebben op de individuele kristallisatie compartimenten van de chip.
2. Plasma activeren beide, de chip en het PDMS blokkeren in 50 W, 13,56 MHz, 0.4 mbar O₂ plasma voor 20 s. Voor chemische binding, incubeer vervolgens elk onderdeel in een 1 vol % waterige APTS of GPTS oplossing gedurende 5 minuten bij 20 ° C. Elk deel met perslucht droog en druk op de PDMS plaat op de folie-chip.
3. Ter verbetering van hechting, plaatsen van de chip op een vlakke plaat voor PDMS, en bedek het met een plastic folie, gevolgd door een schone glasplaatje en een metalen blok. Tot slot storten gewichten om toe te passen tot 1.4 N/cm² druk gedurende ongeveer 1 uur.
4. Punch toegang gaten met een biopsie 0,75 mm punch op elke positie waar de inlaat-en uitlaatpoorten zijn gemarkeerd in de chip ontwerp en verzegel de achterkant met tape. De chip is nu toegankelijk voor alle buizen met een buitendiameter overeenkomen met de diameter van het gat (zoals beschreven in stap 4.2).

4. oppervlakte behandeling

1. Bereiden van een 1:20 9 wt % fluorpolymeer voorraad in fluoro-oplosmiddel om een eindconcentratie van 0,45 wt % verdunning. Opslaan van de stamoplossingen en verdunningen in een koelkast in het donker bij 4 ° C.
2. Laden van de 1:20 fluorpolymeer verdunning in een spuit van 1 mL Luer-lock. Bevestig een 27G × 5/8" naald op de spuit, waarna een PTFE-buis om de naald.
3. Sluit de slang aan op de X-ray chip wandcontactdoos en injecteren de fluorpolymeer werkoplossing bereid in stap 4.1 totdat alle kanalen zijn gevuld.
4. Plaats de chip met de platte zijde naar beneden op een warmhoudplaat 190 ° C gedurende 5 minuten aan alle oplosmiddel om te storten de fluorpolymeer op een dunne film coating verdampen.
   Opmerking: Wanneer u een nieuwe geometrie, Controleer als kanalen met fluorpolymeer tijdens dit coatingproces verstopt waren. Zo ja, verder verdunnen de stockoplossing.

5. eiwitten voorbereiding

1. Weeg gelyofiliseerd Thaumatine en los het op in een bufferoplossing vermeld in tabel 2 naar het juiste volume te verkrijgen van een definitieve eiwitconcentratie van 40 mg mL^-1.
2. Dialyze glucose isomerase tegen de buffer die is vermeld in tabel 2 volgens het protocol van de fabrikant.
3. Voorbereiden van de eiwit-thioredoxin, zoals eerder is beschreven door Schubert et. al. ³⁰.
4. Controleer of de definitieve eiwit concentraties fotometrisch met behulp van de coëfficiënten van de uitsterven samengevat in tabel 2, berekend door de software ProtParam³².
5. Alle oplossingen met behulp van ultrazuiver water bereiden en hen met een 0,2 µm filter te filteren.
6. De eiwit-oplossingen bij 20 ° C gedurende 15 minuten staan bij 16100 x g centrifugeren en nemen het supernatant voor kristallisatie experimenten.

6. eiwit kristallisatie in X-ray Chip

1. Om het kristalliseren van eiwitten in microfluidic chips, meng gelijke hoeveelheden eiwit oplossing en precipitant oplossing. Eiwitconcentratie, samenstelling van de buffer en precipitant samenstelling worden samengevat in tabel 2. Voorbereiden van een totaal volume van ongeveer 20 µL te vullen een microfluidic chip.
2. Onmiddellijk na het mengen, injecteren de oplossing in de perszijde van de chip via een spuit, gekoppeld aan een 27G × 5/8" naalden en PTFE-buis met 0,75 mm buitendiameter (zie stap 4.2).
   Opmerking: De procedure van de vulling voor de seriële indeling vereist een voorafgaande priming van de chip met gefluoreerde olie, die is makkelijkste gedaan door het laden van de gefluoreerde olie uit de retourzijde vóór het injecteren van de kristallisatie oplossing door de perszijde. Alle laden stappen moeten worden gecontroleerd met behulp van een microscoop de toegepaste spuit druk en de bijbehorende stroomsnelheid."
3. Nadat de chip is gevuld, scheidt u de afzonderlijke kristallisatie compartimenten door het injecteren van gefluoreerde olie in de perszijde van de chip. Het zegel van de chip door het blokkeren van alle havens van de inlaat en uitlaat van de chip. Dit kan worden gedaan door het invoegen van een paperclip.
   Opmerking: Omdat de kristallisatie compartimenten worden opgevuld door eiwitten/neerslaande oplossing, de gefluoreerde olie alleen vult het inlaat kanaal van de chip, zonder dat de oplossing in de kristallisatie compartimenten.
4. Om na te bootsen damp diffusie kristallisatie kinetiek, plaatst u de verzegelde fiche bij kamertemperatuur en normale sfeer zodat de druppel in het compartiment van de kristallisatie te krimpen door de verdamping van water door de polyimide folie.
5. Na kristal vorming wordt waargenomen via een microscoop of DLS metingen (stap 7), breng de volledige microfluidic-chip in de juiste precipitant oplossing, om te stoppen verdere verdamping uit de kristallisatie putten tot de röntgendiffractie experiment is uitgevoerd.

7. dynamisch licht verstrooiing metingen in kristallisatie Wells in Chip

Opmerking: DLS metingen werden uitgevoerd met een laser uitvoergegevens vermogen van 100 mW, een golflengte van 660 nm en het verstrooide licht onder een hoek van de verstrooiing van 142° werd ontdekt. Omdat alle onderzochte monsteroplossingen waterige waren de brekingsindex van water (n = 1.33) werd gebruikt in alle berekeningen.

1. Plaats de microfluidic chip in de in het SBS formaat plaat houder van het instrument van de Distributielijsten met behulp van de adapter in stap 8.1 beschreven. Steek de adapter in het apparaat.
2. Zorgvuldig de laser focus in een compartiment voor de microfluidic chip aanpassen met behulp van de gemotoriseerde x-, y- en z-fase. Omdat de chip microfluidic erg dun is, het z-niveau aanpassen door kleine toename stappen toe te passen.
   Opmerking: Een correcte afstelling wordt bevestigd door een hoge onderscheppen en een vlotte staart van de resulterende autocorrelatiefunctie van de DLS-meting. Een kalibratie-bestand kan worden gemaakt zodat deze overeenkomen met de positie van elke individuele kristallisatie goed in de microfluidic-chip, geautomatiseerde DLS metingen in verschillende compartimenten waardoor na verloop van tijd.
3. Uitvoeren van elke DLS-meting bij 293 K voor 30 s en herhaal de meting elke 5 min. tot het einde van het experiment kristallisatie.
   Opmerking: Eerste nucleatie kan worden gevolgd door de verdeling van de straal van de metingen, DLS na verloop van tijd en succesvolle kristal vorming kan parallel worden gevolgd door de ingebouwde Microscoop van de DLS-afleesapparaat.

8. diffractie gegevensverzameling

1. Adapters voor beamline goniometers
   1. Afdrukken van de adapters voor de goniometer plaat om te positioneren en de X-ray chips draaien tijdens kristallografische gegevensverzameling.
   2. Fabriceren de adapters voor het basis goniometer op een hobby-grade 3D-printer met behulp van standaard-parameterinstellingen zoals aanbevolen door de fabrikant.
      Opmerking: De adapters werden ontworpen met behulp van een 3D-CAD-systeem en de coördinaat bestanden van de adapters zijn aangesloten '. STL'-bestandsindeling in het supplement.
   3. De X-ray-chips op de adapter met behulp van dubbele dubbelzijdige tape vast te stellen.
2. in situ röntgendiffractie
   1. Verzamelen van diffractie gegevens met behulp van de grootte van een straal van 10 × 5 µm (FWHM van Gauss profiel) op 296 K. gebruik x-stralen met een energie van 12,8 keV en een stroom van 2.2 · 10¹¹ fotonen · s^-1 in de verzwakte en record diffractie patronen met behulp van een Pilatus 6 M hybrid pixel detector.
      Opmerking: Microfluidic meettoestellen Thaumatine, glucose isomerase of thioredoxin kristallen worden gebruikt voor in situ X-ray kristallografische experimenten op het EMBL beamline P14 van de synchrotron PETRA III. Beschikbare lichtbundel focus grootte en flux afwijken bij andere bronnen van X-ray. Het aantal blootgestelde eiwit kristallen, het aantal diffractie patronen opgenomen van elke crystal, het bereik van de hoek trilling per blootstelling en de blootstellingstijd worden samengevat in tabel 3.
   2. Proces sets van twee opeenvolgende diffractie patroon afzonderlijk met behulp van het programma XDS³³. Gebruik de bash-script "xds.sh" gevonden in het supplement.
   3. HKL-bestanden maken voor elke dataset van alle kristallen en schalen ze met behulp van de software XSCALE³³. Gebruik de bash-script "xscale.sh" in het supplement een invoerbestand voor XSCALE maken.
      Opmerking: Alleen de datasets van kristallen hebben correlatiecoëfficiënten groter is dan 90%, hetgeen aangeeft een hoge mate van isomorfisme dat, moet worden geschaald. De conservatieve criterium ‹I/σ (I) › (> 2) moet worden gebruikt voor het bepalen van de hoogste resolutie shell. Moleculaire vervanging met behulp van het programma MOLREP³⁴ uit de CCP4 suite³⁵ kan verkrijgen van de fasen voor verdere modelbouw met behulp van de 3D-coördinaten van de Protein Data Bank (VOB) weergegeven in tabel 3worden gebruikt.
   4. Alle structuren ionenpaar met behulp van Refmac5^35,36 verfijnen en COOT³⁷ voor visuele inspectie van het uiteindelijke model gebruiken.
      Opmerking: Oplosmiddel moleculen automatisch moeten worden toegevoegd tijdens de verfijning en moeten worden gecontroleerd om te bevestigen chemisch redelijke standpunten. Alle modellen moeten worden gecontroleerd om te identificeren Ramachandran uitschieters.

9. de gegevensevaluatie

1. Schade door straling
   1. Analyseer het verval van diffractie macht na verloop van tijd met behulp van een methode die is beschreven door Owen et al.³⁸. Bereken de totale som van I/σ(I) (op voorwaarde van XDS³³) van alle geïndexeerde reflecties van elke beoordeeld diffractie dataset (2 opeenvolgende diffractie patroon), als een referentiewaarde te gebruiken hiervoor. Gebruik de bash-script "ISigma.sh" van het supplement.
   2. De kracht van de diffractie van elke dataset aan de macht van de gemiddelde diffractie van de eerste dataset te normaliseren.
   3. Het analyseren van de verandering van de Rmeas waarden na verloop van tijd door het nemen van de Rmeas-waarden van de bestanden van de Correct.LP verkregen XDS³³ (bash script "Rmeas.sh" van het supplement).
2. Crystal oriëntatie
   1. Het bepalen van de hoeken van Euler informatie te verkrijgen over de verdeling van de kristalrooster oriëntaties met betrekking tot het coördinatensysteem van het laboratorium. Bereken de Euler-hoeken uit de XDS oriëntatie matrix gegeven in het uitvoerbestand XPARM³⁹ using naar de software Matlab. Gebruik de bash-script "rotation_matrix.sh" de rotatie-matrix in elk kristal van het XPARM-bestand uitpakken. Het uitvoerbestand als input in Matlab gebruiken voor het berekenen van de Euler-hoeken met behulp van de functie rotro2eu.m van Matlab (aanvullende bestand).
      Opmerking: Een gedetailleerde beschrijving van de berekening is gepubliceerd door Zarrine-Afsar et al.⁴⁰.
   2. De verkregen Euler-hoeken converteren van radialen naar graden. De verkregen hoeken van Euler voor alle drie rotatie vliegtuigen (xy, xz en zy) in klassen van 10° groep en plot ze met behulp van de software Origin9.

Resultaten

Epoxy is een uitstekende vulling materiaal voor X-ray chip fabricage. Het is goedkoop, eenvoudig en robuust aan proces zonder specialistische gereedschappen (Figuur 1). Vermindering van de epoxy viscositeit door verder verdunnen het met 40 wt % ethanol vergemakkelijkt het verwijderen van overtollige hars boven de kristallisatie Nou, wat resulteert in gedefinieerde X-ray windows. Hogere ethanol verdunningen resulteerde in gebreken van de uitgeharde hars. Door het analyseren van Röntgen chip dwarsdoorsneden, vastbesloten wij de totale venster dikte van beide zijden om ongeveer 19 µm dik, die zeer dicht bij de nominale dikte van de gebruikte polyimide folies van 2 × 7,5 µm (Figuur 2)

Kristallisatie proeven werden geïsoleerd in verschillende nanoliter formaat reactie compartimenten elk, met behulp van een capillaire ventiel mechanisme zoals eerder beschreven⁴¹. Deze 'winkel-dan-maak' laden techniek vermijdt het verlies van de steekproef van dode-volume kanaal en kan gemakkelijk worden uitgevoerd handmatig, eliminerend de behoefte pompen of andere apparatuur te gebruiken voor vloeiende bediening⁴². De chip is gevuld met gefluoreerde olie alvorens het waterige monster te laden. De oppervlaktespanning op de olie-water-interface tussen priming olie en waterige monster resultaten in een drukverschil op de interface. Deze druk Laplace is afhankelijk van zowel de straal van de kromming en de oppervlaktespanning van de interface. Om te minimaliseren zijn energie, moet de interface zijn oppervlak, die gelijk is aan het maximaliseren van haar belangrijkste kromtestralen bij constant volume minimaliseren. Een geringe kromming interface in een breed kanaal heeft een lagere druk van Laplace dan een hoge kromming interface in een smal kanaal segment. Dus, de stekker van de steekproef netcongestieproblemen binnenkomt en stroomt door de brede rondweg kanaal in plaats van door de beperkingen van de smalle capillaire ventiel stroomt. Tot slot wordt de stekker van de steekproef gevolgd door gefluoreerde olie om te scheiden van de monster-putten in onafhankelijke druppels.

Robuuste en betrouwbare laden werd bereikt met een spuitsnelheid van maximaal 1 mL/h, in zowel een serienummer en een parallelle goed regeling (Figuur 3). In de 'seriële' lay-out, zijn goed inlaat en capillaire ventiel beperkingen sequentieel aangesloten via een bypass kanaal³¹ In tegenstelling, in de "parallelle" lay-out, twee aparte belangrijkste kanalen verbinden alle goed inhammen of capillaire kleppen alleen⁴³. Beide concepten regeling worden eerder gecombineerd met formulering controle scherm samenstelling, dat een nuttige aspect in eiwit kristallisatie^43,44. Het seriële ontwerp heeft slechts twee vloeibare poorten, een inlaat en een uitlaat. Het heeft minder vloeibare havens, en vanwege dit, is het eenvoudiger om te bouwen en te beheren. De parallelle lay-out heeft 4 vloeistof poorten, 2 voor het belangrijkste kanaal aansluiten van de putten en 2 voor het koppelen van de capillaire kleppen om lucht of ontsnappen van de overtollige olie te laten. Laden kunt vandaar verder aan weerszijden van de belangrijkste kanaal. Deze lay-out is over het algemeen lagere stromingsweerstand voor een gelijk aantal putten te wijten aan de kortere omleiding. Het is daarom beter geschikt voor up-scaled apparaten met een hoog aantal wells. Ook de monster-putten zijn georiënteerd samen dichter, die voordelen biedt voor geautomatiseerde imaging.

Volledige monster goed laden werd waargenomen voor beide lay-outs, als ofwel gebouwd als een twee-hoogte of een drie-hoogte ontwerp. In een ontwerp met twee-hoogte zijn zowel het monster goed en de rondweg kanalen van gelijke hoogte. Het ontwerp van de drie-hoogte vereist een derde masker, een extra SU8 laag en een stap in de uitlijning verder te verzekeren dat de steekproef putten hoger is dan de voorgaande worden kanalen omzeilen. Deze hoogte-differential bevordert invoeren van monster vloeistof in de put via het dezelfde capillair kleppen beginsel dat stroom op de beperkingen stopt. Hier, het hogere goed plafond komt overeen met een lagere Laplace druk van de oprukkende meniscus en stroom langs de rondweg richting alleen favoriet is nadat wells volledig hebt ingevuld, zodanig dat de beperkingen van de klep verder stroom blokkeren en het doorschakelen naar beneden de bypass. Echter is succesvol laden niet strikt vereist de putjes hoger dan de bypass zoals passende capillaire kleppen kan ook worden bereikt door kanaal breedtes dienovereenkomstig aan te passen. Echter in onze ervaring, de hogere putten aanzienlijk meer robuust uitgevoerd en defect gratis laden werd waargenomen op maximaal tien keer hoger debiet in alle ontwerpen van drie-hoogte ten opzichte van hun twee hoogte-equivalenten. Dit effect was meer uitgesproken in de parallelle lay-out.

Om na te bootsen damp diffusie kristallisatie kinetiek, was de eindige permeabiliteit van de folie van polyimide benut om het water verdamping na verloop van tijd te controleren. Experimentele verdampingssnelheden werden gekwantificeerd door de wijziging van druppel volume na verloop van tijd door het gelijkstellen van de daling van de oppervlakte en goed hoogte (figuur 4C). De verdamping van kristallisatie putten in de X-ray-chip gaat het niet verder op een lineaire wijze, als een krimpende oppervlakte van de druppel samenvalt met opgeloste concentratie resulteert in een verminderde verdampingssnelheid gedurende tijd⁴⁵te vergroten. De eerste verdamping volgde een ongeveer lineaire groei van over 0.5 nL h^-1 in putjes van de seriële layoutgeometrie.

Om beter te begrijpen de kristallisatie kinetiek, werden DLS-metingen uitgevoerd in de putten van de kristallisatie van de microfluidic-chip. Voor eerste DLS metingen, was een chip van de PDMS gebonden op een glasplaatje gewend beter optische eigenschappen voorzien in de verstrooiing van licht-experiment. Deze chip had goed dezelfde afmetingen als de X-ray-chip. PDMS heeft een hogere waterdamp doorlaatbaarheid dan de polyimide van polyimide Vensters in de X-ray chip⁴⁵. Aangezien flux lineair met afstand schalen, kan het traject van de verdamping van een windowed polyimide goed gepaard gaan met een overeenkomstige PDMS venster van de juiste dikte.

DLS resultaten tonen aan dat de verdeling van de straal na verloop van tijd (figuur 4A-B) verandert, waaruit blijkt dat de metingen DLS toestaan om te ontdekken de eerste nucleatie alvorens eerste kristallijne deeltjes worden waargenomen. Deze informatie kan worden gebruikt voor nucleëren en groeien enkele kristallen per putje door extern aan te passen de verdampingssnelheid en vandaar oververzadiging niveaus in een vroeg stadium van de nucleatie⁴⁶.

De X-ray-chip werd vastgesteld op een 3D gedrukte adapter voor de SBS compatibel plaat goniometer op het EMBL-beamline van de synchrotron P14 bij PETRA III (figuur 5A). Als alternatief, een kleinere 3D afgedrukte frame kan worden gebruikt om mount X-ray chips om standaard beamline goniometers²¹. Thaumatine kristallen hebben een grootte van 10-20 µm (figuur 5B) en diffract tot een resolutie van 2.0 Å (figuur 5C). Zoals verwacht, de bijdrage van de X-ray achtergrond van de twee dunne polyimide folies windows vanaf de X-ray-chip is beperkt tot polyimide polymeer verstrooiing ringen op 11 Å (2θ ~ 5°) en 33 Å (2θ ~ 1,7 °) voor de X-ray golflengte van 0.97 Å. Deze twee ringen storen gegevensverwerking niet. Een totale dataset met 83 Thaumatine kristallen werd verzameld en 10 diffractie patronen werden geregistreerd vanuit elke kristal met een 1° rotatie tijdens elk frame. Gegevensverwerking en verfijning parameters, evenals de statistieken van de dataset Thaumatine zijn weergegeven en vergeleken met twee andere datasets van glucose isomerase en thioredoxin, die ook werden verzameld in situ zijn vermeld in tabel 3 en Tabel 4.

Het verval van de intensiteit van de macht van de genormaliseerde diffractie na verloop van tijd werd onderzocht door het opsplitsen van de dataset Thaumatine in vijf sub datasets (twee diffractie patronen werden gebruikt per subset om volledige datasets). Zoals blijkt uit figuur 6B, de diffractie macht begon te dalen na de eerste sub-dataset en was onder de 50% in het vierde sub dataset. Dientengevolge, de waarden van de Rmeas van de sub-datasets zijn ook steeds meer na verloop van tijd, met vermelding van X-ray stralingsschade tijdens het verzamelen van gegevens. We veronderstellen dat vrije radicalen gegenereerd tijdens de X-ray blootstelling snel naburige kristallen in hetzelfde compartiment reactie degraderen. Bijvoorbeeld, dergelijke secundaire X-ray schade was dat minder uitgesproken in een verwante experimentele aanpak, waarbij over een aanzienlijk groter gebied in een polyimide sandwich²¹kristallen zijn rondgedeeld. U wilt algemene X-ray schade minimaliseren, moet slechts een klein aantal diffractie patronen uit een bepaald kristal worden verzameld bij kamertemperatuur. Ook, mag slechts één enkele eiwit kristal plaatsen per compartiment van de microfluidic-chip worden blootgesteld. Alle structuurmodellen verfijnd met behulp van de verwerkte datasets tonen echter zeer goede stereochemie en geschikt statistieken (tabel 4). Daarnaast waren alle laatste elektron dichtheid kaarten van zeer goede kwaliteit.

In eerdere kristallografie benaderingen op X-ray transparante chips, de afdrukstand en de rangschikking van de kristallen moest opzettelijk worden gemanipuleerd om het verkrijgen van een willekeurige distributie van crystal oriëntaties⁴⁰ of is verkregen door crystal bewegingen laag²¹binnen de vloeistof. Om te beoordelen in de X-ray transparante microfluidic chips beschreven in dit protocol de stand van de kristal, werd de oriëntatie van de mobiele eenheid van alle blootgestelde kristallen met betrekking tot het coördinatensysteem van het laboratorium vastgesteld. Voor de bipyramidal Thaumatine kristallen, werd een lichte voorkeur waargenomen (figuur 7A), terwijl we een brede distributie voor glucose isomerase kristallen (figuur 7B) verkregen. We redeneerde dat op de nanometerschaal, de meeste materialen aanzienlijke ruwheid vertonen. Vandaar, kristallen kunnen spontaan ervoor op het oppervlak in aanzienlijk minder vooringenomen oriëntaties spontaan. Deze kern van een klein kristal kan worden opgesloten in een oriëntatie, terwijl het voortdurend te groeien naar de juiste grootte zonder heroriënteren ten opzichte van de normale van het oppervlak. In feite, is oppervlakte gemedieerde crystal nucleatie al lang een last aan kristallografen proberen lus een bijgevoegde kristal vandoor naar de oppervlakte zonder beschadiging van het kristal in het proces. Hier, kunnen we direct gebruik maken van dergelijke kristallen voor diffractie gegevensverzameling. Systeem specifieke beperkingen bestaan echter, zoals de thioredoxin bleek een sterke voorkeur voor bepaalde oriëntaties in de xy-, xz- en yz-vlakken (Figuur 7 c). Toonde voorbeelden ziet u dat de verdeling van de geaardheid is niet alleen afhankelijk van op het milieu van de groei, maar ook op de vorm van kristal. De thioredoxin kristallen hebben langgerekte vormen die de neiging om te groeien in de gewenste richting, terwijl de tetragonale bipyramidal Thaumatine kristallen of de orthorhombisch glucose isomerase kristallen worden niet getoond voor dit probleem. Echter, in alle gevallen, zelfs met voorkeur oriëntaties die het toegankelijk bereik van crystal rotaties in voldoende goede dekking van reciproque ruimte en vandaar volledige gegevenssets voor alle resulteerde onderzocht eiwitten. Dus geen aanvullende maatregelen moesten worden genomen bij het selecteren van kristallen voor Xray blootstelling.

Figuur 1 : Regeling van microfluidic X-ray chip fabricage. (1) SU-8 wordt aangeboden op een silicium substraat en spin coating om te verkrijgen van de gewenste laagdikte. (2) fotoresist is blootgesteld aan UV-straling door middel van een masker. (3) onbelicht fotoresist vervolgens weg is ontwikkeld door het achtereenvolgens wassen met PGMEA en isopropanol, resulterend in (4) een meester van de SU-8 voor het gieten van verdere stappen. (5) PDMS wordt gegoten op, en van de meester van de SU-8 (6) na het genezen van het PDMS schimmel, wordt gepeld. (7 bis) Epoxy lijm wordt aangeboden op de PDMS mal en (7b) een geactiveerde polyimide folie is chemisch gebonden aan de epoxyhars. (8) na uitharding wordt de polyimide folie met de patroon dunne epoxy-film uit de mal PDMS gepeld. (9) in een laatste stap moet het apparaat is hardplastic met een tweede polyimide folie aan het rendement van een gesloten lage X-ray achtergrond microfluidic chip. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Foto (links) en microscopie beelden van cross-secties van de definitieve chips. Een representatieve kanaal segment (midden) en een kristallisatie waterput (rechts) uit twee afzonderlijke chips worden weergegeven. Pijlen geven aan gemeten afstanden. Alle afmetingen zijn in µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Schema van kristallisatie goed ontwerpt met [A] parallelle of seriële indeling van [B], gezien vanaf de bovenkant en vanaf de kant met afmetingen aangegeven in µm. Typische kanaal hoogten waren: 50 µm omzeilen, 50-60 µm kristallisatie goed, 5-10 µm capillaire kleppen, overeenstemt met het goed van de volumes van ongeveer 2.5 nL (parallelle lay-out) en 8 nL (seriële lay-out). Vertegenwoordiger goed laden gedrag wordt weergegeven met behulp van kleurstoffen voor levensmiddelen. De chip was gevuld met 12 wt % 1H, 1 H, 2H, 2H-perfluoro-1-octanol in FC-43, voordat voedsel kleurstof werd geïnjecteerd in de opslag putten. Witte pijlen geven de richting van de stroom. Overzicht beelden van geladen apparaten Toon alle putjes geladen defect gratis, ter illustratie robuuste monster laden. De parallelle lay-out wordt geïllustreerd als een drie-hoogte design met kristallisatie wells hoger dan de bypass, terwijl de seriële indeling wordt afgebeeld als een twee-hoogte ontwerp met putten en met gelijke hoogte te mijden. Typische debiet waren ongeveer 150 µL/h tijdens het laden, maar defect gratis laden werd waargenomen voor debieten van maximaal 1 mL/h in een 3-hoogte-ontwerp. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : In situ dynamische licht verstrooiing van een kristallisatie ruim tijd. [A] microscopische opname serie van de kristallisatie goed. De opgeslagen druppel continu krimpt als waterdamp na verloop van tijd verdampt. Eerste Thaumatine microcrystals kan worden waargenomen na 4 h. [B] overeenkomstige hydrodynamische straal verdeling van de deeltjes van de Thaumatine gemeten door DLS tijdens hetzelfde kristallisatie proces gefotografeerd in [A]. De vorming van een tweede RADIUS-breuk, die aangeeft eerste nucleatie gebeurtenissen kunnen worden gezien na ongeveer 1-2 h. [C] vertegenwoordiger volume afnemen van twee referentie druppel volumes als gevolg van waterverlies door verdamping in de tijd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5 : in situ diffractie gegevensverzameling. [A] individuele microfluidic chips zijn gemonteerd door een 3D gedrukte adapter die op een plaat goniometer (blauw). [B] Thaumatine kristallen in de microfluidic chip tijdens de X-ray blootstelling zoals beeld door de in-line Microscoop op beamline P14. [C] de diffractie van Thaumatine kristallen werd opgenomen naar een resolutie van 2.0 Å, met een verwaarloosbaar laag achtergrond. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6 : Evaluatie van de gegevens van gegevens van de diffractie van Thaumatine kristallen in de microfluidic-chip, geregistreerd bij de kamer-temperatuur. [A] elektronen dichtheid van het model van de verfijnde Thaumatine met het frame 1-2 dataset alleen (blauwe contouren op 1,5 σ). [B] intensiteit verval van Thaumatine kristallen als een functie van X-ray dosis. [C] evolutie van de waarde van de Rmeas over X-ray dosis. Het vak percelen in [B] en [C] met kwartielen (bovenste waarden 75%, 50% van de gemiddelde waarden, lagere waarden 25% en gemiddelde) en snorharen met 95% betrouwbaarheidsintervallen vertegenwoordigen het bederf van de intensiteit van de diffractie en Rmeas van alle blootgestelde kristallen (n = 83). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7 : Verdeling van eenheid cell oriëntaties in de microfluidic chip folie met betrekking tot het laboratorium coördinatensysteem. [A] de bipyramidal Thaumatine kristallen toonde een brede verspreiding van de oriëntaties die betrekking hebben op bijna 180° in de xy-(blauw), xz-vlak (groen) en yz-(red) vliegtuig. [B] glucose isomerase toont ook een brede distributie, terwijl [C] thioredoxin een sterke voorkeur voor bepaalde oriëntaties toonde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

SU8-laag	Spin jas	Pre bak	Bloot	Na bakken
		[65 / 95 ° C]		[65 / 95 ° C]
1st laag: Wells	1000 RPM	0 / 10 min	200 mJ/cm2	1 / 4 min
15 µm SU8-3010
2nd laag: Bypass	2000 TOEREN PER MINUUT	0 / 16 min	220 mJ / cm2	1 / 5 min
35 µm SU8-3025
3rd laag: kleppen	3000 RPM	0 / 3 min	150 mJ / cm2	1 / 2 min
5 µm SU8-3005

Tabel 1: voorbeeld van het proces van de SU8 voor drie lagen parallelle X-ray chip ontwerp. Het bestellen van deze laag zal zorgen voor een PDMS mal gieten voor X-ray chip fabricage. Als u wilt schimmel direct een PDMS tijdens prototyping, omkeren de laag bestellen tijdens de master fabricage te starten vanaf de 3^rd tot finish met de 1^st laag in plaats daarvan.

Eiwit	Eiwitconcentratie	Eiwit buffer	precipitant	Ruimtegroep, VOB vermelding	Uitsterven coëfficiënt [M-1 cm-1]
Thaumatine (Thaumatococcus daniellii)	40 mg mL-1	50 mM Bis-Tris, pH 6,5	1.1 M natriumkaliumtartraat, 50 mM Tris, pH 6.8	I4222, 1LR2	29420
Glucose isomerase (Streptomyces rubiginosus)	25 mg mL-1	10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, pH 7,0	100 mM Bis-Tris, 2.7 M ammoniumsulfaat, pH 5.7	I222, 4ZB2	46410
Thioredoxin (Wuchereria bancrofti)	34 mg mL-1	20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8,0	27,5% PEG1500, 100 mM SPG buffer, pH 6,3	P41212, 4FYU	24075

Tabel 2: Kristallisatie voorwaarden en ruimte groepen van eiwit kristallen voorbereid, inclusief de uitsterven coëfficiënt en VOB-code.

Eiwit	Aantal blootgestelde kristallen	Aantal diffractie patroon per kristal	Trilling bereik per blootstelling [°]	Belichtingstijd [ms]	VOB vermelding voor MR
Thaumatine (Thaumatococcus daniellii)	103	10	1	40	1LR2
Glucose isomerase (Streptomyces rubiginosus)	69	100	0.1	80	4ZB2
Thioredoxin (Wuchereria bancrofti)	68	10	1	40	4FYU

Tabel 3: röntgendiffractie gegevens collectie parameter.

Data collectie statistiekeneen	Thaumatine (Frame 1-20)	glucose isomerase (Frame 1-100)	thioredoxin (Frame 1-10)
Beamline		P14
Golflengte [Å]		0.96863
Ruimtegroep	P41212	I222	P42212
Cel eenheidparameters: een = b, c [Å]	58.62, 151.48	93.91, 99.60, 103.04	58.45, 151.59
Aantal kristallen	101	41	34
Totale trilling [°]	10	10	10
Resolutie [Å]	30.1.1989 (1.95-1,89)	30.1.1975 (1.80-1,75)	30.3.2000 (3.20-3.00)
Temperatuur [K]	296	296	296
R p.i.m.b	7.5 (25,5)	8,8 (28,0)	9.1 (33.2)
Gemeten reflecties	1553200	690000	1111196
Unieke reflecties	21850	48942	44449
Gemiddelde I/σ(I)	6,07 (1.78)	5.85 (1.66)	4.08 (1.47)
Mn(I) half-set correlatie CC(1/2)	96,2 (72,2)	95,8 (68,2)	97.9 (75,3)
Volledigheid [%]	99,8 (100.0)	100.0 (99,9)	99,9 (100.0)
Redundantie	71,1	14.1	25
Verfijning statistieken
Resolutie bereik [Å]	1/30/1989	1/30/1975	30-3-2000
R / Rgratis [%]	18.8/23.9	18.1/20.5	18.9/23.1
Eiwit atomen	1550	3045	1129
Watermoleculen	51	111	164
Ligand moleculen	20	0	0
RMS-afwijking
Bond-lengte [Å]	0.02	0.026	0,01
Bond hoek [°]	2.04	2.22	1.43
B factor [Å2]
Eiwit	22,6	20	50
Water	25.1	27.1	29,7
Ligand	20.4
Ramachandran plot analyse
Meest geliefde regio's [%]	97.67	95.32	96,13
Toegestane regio's [%]	2.44	4.16	3,64
Royaal toegestaan regio's [%]	0,49	0.52	0.23
a: waarden tussen haakjes zijn voor de hoogste resolutie shell.
b: (), waar ik (hkl) is de gemiddelde intensiteit van de reflecties hkl, Σhkl de som over alle reflecties is en Σi de som meer dan ik is metingen van reflectie hkl.

Tabel 4: Gegevens verzameling statistieken van datasets van Thaumatine, glucose isomerase en thioredoxin.

Normalelichtdoorlatingsfactor-bestand 1: chip_geometry.dwg. CAD-bestand van de chip geometrieën gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Normalelichtdoorlatingsfactor-File 2: goniometer_adapter.stl. STL-bestand opgeven de X-ray chip goniometer adapter. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Normalelichtdoorlatingsfactor-bestand 3: xds.sh. Bash-script voor het maken van invoerbestanden voor het verwerken van wiggen door XDS vangegevens diffractie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Normalelichtdoorlatingsfactor-bestand 4: xscale.sh. Bash script te diffractie gegevens uit deelverzamelingen samenvoegen en een HKL-bestand maken. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Normalelichtdoorlatingsfactor-bestand 5: ISigma.sh. Bash script te uittreksel van de ISigma-waarden van alle individuele deelverzamelingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Normalelichtdoorlatingsfactor-File 6: Rmeas.sh. Bash script te Rmeas waarden extraheren op basis van alle individuele deelverzamelingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Normalelichtdoorlatingsfactor-bestand 7: rotation_matrix.sh. Bash script te bereiden van het invoerbestand voor Matlab voor het berekenen van de Euler-hoeken uit de rotatie-matrix. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Wij fabriceren microfluidic apparaten voor in situ röntgendiffractie door patronen van epoxyhars als vulling materiaal en polyimide folie als venster materiaal. Onze procedure geoptimaliseerd verschillende stappen van het fabricageproces over vorige X-ray chip ontwerpen^16,21. Wij verminderd de venster dikte en daarmee de achtergrond verstrooiing terwijl ook versoepeling fabricage als minder processtappen zijn vereist. in situ kristallisatie via het protocol beschreven heeft aanzienlijke voordelen. Het verzamelen van de gegevens van de diffractie staat bij kamertemperatuur en daarmee sluit de noodzaak cryo bescherming, die in sommige gevallen het risico bevat van de invoering van artefacten in de eiwitstructuur. Bovendien, de kristallen gelden geen fysieke spanning, omdat de overdracht van de kristallen uit hun oorspronkelijke omgeving kan worden vermeden. Via deze procedure, de kristallen handhaven van de hoogste kwaliteit en lijdt niet aan elke behandeling.

In onze ervaring rond de belangrijkste stappen in het protocol beheersen de kristallisatie proces. De parameters voor het verkrijgen van X-ray geschikt kristallen met passende afmetingen moeten empirisch worden geïdentificeerd en rechtstreeks vanuit de damp diffusie experimenten kunnen worden genomen. Met behulp van identieke concentraties van eiwitten en neerslaande niet altijd leiden tot kristallen in verschillende chips, of soms in verschillende putten binnen dezelfde chip. Dit geeft aan dat alle factoren die beïnvloeden crystal nucleatie en groei moeten zorgvuldig worden, zoals moeder liquor samenstelling of kristallisatie kinetiek (via het traject van de verdamping). Als grotere kristallen met hogere resolutie diffract, worden voldoende grote kristallen ideaal gekweekt. Het proces van crystal nucleatie en groei kan worden gevolgd met DLS metingen. Aanpassing van de laser focus binnen de ~ 50 µm kunnen dunne kristallisatie compartimenten van de chip uitdagend en zorgvuldige handmatige aanpassing is mogelijk. Met behulp van putten dieper dan 100 µm, was laser auto-uitlijning haalbaar en betrouwbaar, zodat meerdere putten kunnen worden gecontroleerd door middel van geautomatiseerde overname regelingen.

De chips van polyimide gebaseerd X-ray produceren slechts een lage achtergrond en wij laten zien dat de geschiktheid van deze apparaten voor routine röntgendiffractie gegevensverzameling door het oplossen van de structuren voor drie model eiwitten. De beste resolutie verkregen in chip verschilden, vergeleken met de eerder bereikte resoluties, van aanzienlijk groter eiwit kristallen en conventionele röntgenfoto gegevensverzameling. Dit zou te wijten aan verschillende factoren en kristallisatie voorwaarde optimalisatie kan verder verbeterd de diffractie. Was het mogelijk om in situ diffractie gegevens tot 1,8 Å resolutie toepassen kristal met afmetingen kleiner dan 30 µm te verzamelen. De gedetailleerde analyse van Thaumatine diffractie gegevens geboden inzichten over schade door straling. Als u wilt beperken van de mate van schade door straling, slechts één enkel kristal dienen te worden blootgesteld plaatsen per compartiment in het microfluidic-apparaat, zoals de verspreiding van radicalen en in het naburige kristallen kan optreden. Ter verbetering van de snelheid van gegevensverzameling, moet dit worden geautomatiseerd in de toekomst.

Als gevolg van crystal morfologie, in sommige gevallen kan een voorkeur oriëntatie optreden. Dit was bijvoorbeeld het geval met de dataset thioredoxin, waar de kristallen had een sterk voorkeur oriëntatie ten opzichte van de Vensters van de chip. Zelfs hier, kunnen wij een volledige diffractie dataset verzamelen. Als kristallen een voorkeur oriëntatie in chip vertonen en in het bijzonder als de bijbehorende ruimtegroep ook een lage symmetrie heeft, vervolgens de volledigheid van de dataset moet worden gecontroleerd tijdens de collectie zodanig dat voldoende diffractie patronen riet verzameld.

Time-resolved studies met behulp van deze chips zijn direct mogelijk wanneer met behulp van licht reacties met een benadering van de pomp-sonde geïnduceerde. De polyimide folie lichttransmissie, zodat de laser van de pomp moet worden opgehelderd en anderzijds duidelijke optisch polyimide of COC kan worden gebruikt. De huidige microfluidic geometrieën toegestaan niet voor substraat mixen experimenten nadat de kristallen zijn gegroeid. We verwachten echter dat de beschreven X-ray chip fabricage protocol ook geschikt is voor dergelijke ontwerpen voor beide röntgendiffractie time-resolved mengen evenals verstrooiing benaderingen¹⁹.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
SU-8 3000 Series	MicroChem Corp.	SU-8 3000	Photoresist
PGMEA	Sigma-Aldrich	484431	Ontwikkelaar
Isopropyl alcohol			Oplosmiddel
Ethanol			Oplosmiddel
Epoxy lijm	UHU	Plus Schnellfest 5 min	Epoxy lijm
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184	Silicone
Kaptonfolie	Dupont/ American Durafilm	HN grade, gauge 30 (7.5 μm)	Polyimide folie
APTS	Sigma-Aldrich	440140	Chemische stof
GPTS	Sigma-Aldrich	440167	Chemische stof
Cytop CTX-109AE	Asahi Glass Co. Ltd	Cytop CTX-109AE	Cytop fluoropolymeercoating
CT-Solv 100E	Asahi Glass Co. Ltd	CT-Solv 100E	Cytop fluoro-oplosmiddel
HFE-7500	3M	Novec 7500	Gefluoreerd olie
AutoCAD	AutoDesk Inc.	AutoCAD	CAD-software
Biopsy Punch	Harris	Uni-core 0.75 mm
Fotomasker	JD Photo Data
3 inch wafer	University Wafer		Silicium wafer
Masker aligner	SÜSS MicroTec	MJB4	Masker aligner
PDMS mixer	Thinky	ARE-250
Plasmamachine	Diener electronic	Zepto
Thaumatin	Sigma Aldrich	T7638	Proteïne
Glucose Isomerase	Hamton Research	HR7-102	Proteïne
Bis-Tris	Sigma Aldrich	B9754	Chemische stof
Natriumtartraat	Merck	106664	Chemische stof
Tris-HCl	Sigma Aldrich	10812846001	Chemische stof
HEPES	Carl Roth	6763.2	Chemische stof
Magnesiumchloride	Sigma Aldrich	208337	Chemische stof
Ammoniumsulfaat	Sigma Aldrich	A4418	Chemische stof
EDTA	Sigma Aldrich	E6758	Chemische stof
Natriumchloride	Sigma Aldrich	1064060250	Chemische stof
PEG1500	Molecular Dimensions	MD2-100-6	Chemische stof
SPG buffer	Jena Bioscience	CSS-389	Chemische stof
SpectroLight600	XtalConcepts		DLS-instrument
Nanodrop	Thermo Scientific		Spectrofotometer
Centrifuge	Eppendorf
Ultimaker2	Ultimaker		3D-printer
Form2	Formlabs		3D-printer
Amicon Filter	Sartorius Stedim		0.2 µm filter
Slangen	Adtech Polymer Engineering Ltd	Bioblock/05	PTFE-slang 0,3 mm binnendiameter x 0,76 mm buitendiameter
Spuiten	BD	309628	1ml Luer-Lock Tip
Naald	Terumo Agani Needle	AN*2716R1	27Gx5/8"