Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo

Samenvatting

Zebravis onlangs gewend waren als een modelsysteem in vivo DNA replicatie timing tijdens ontwikkeling bestuderen. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van embryo's de zebravis profiel replicatie timing. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van replicatie timing mutanten, individuele celtypes, ziekte modellen en andere soorten.

Samenvatting

DNA replicatie timing is een belangrijke cellulaire kenmerk, vertonen belangrijke relaties waarbij de structuur van de chromatine, transcriptie en DNA mutatie tarieven. Veranderingen in de timing van de replicatie optreden tijdens de ontwikkeling en in Kreeft, maar de timing van de replicatie rol speelt bij ontwikkeling en ziekte is niet bekend. Zebravis werden onlangs opgericht als een in vivo modelsysteem te bestuderen van de timing van de replicatie. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van de zebravis om DNA replicatie timing. Na het sorteren van cellen van embryo's en volwassen zebrafish, kunnen high-resolution genoom-brede DNA replicatie timing patronen worden geconstrueerd door het bepalen van de veranderingen in DNA exemplaaraantal door middel van analyse van de volgende generatie sequencing gegevens. De zebravis modelsysteem zorgt voor evaluatie van de timing replicatiewijzigingen die optreden in vivo in de gehele ontwikkeling, en kan ook worden gebruikt voor het beoordelen van wijzigingen in afzonderlijke celtypes, ziekte modellen of mutant lijnen. Deze methoden bestudering, onderzoek naar de mechanismen en de determinanten van replicatie timing vestiging en onderhoud tijdens de ontwikkeling mogelijk maken, de timing van de replicatie rol speelt in de mutaties en tumorigenesis, en de gevolgen van de storing veroorzaakt de timing van de replicatie op ontwikkeling en ziekte.

Inleiding

Voor cellen te verdelen met succes, moeten ze eerst nauwkeurig en getrouw repliceren hun gehele genoom. Genoom dubbel treedt op in een reproduceerbare patroon, bekend als de DNA replicatie timing programma¹. DNA replicatie timing is gecorreleerd met de organisatie van de chromatine, epigenetische merken en gene expression^2,3. Veranderingen in de timing van de replicatie optreden in de gehele ontwikkeling, en zijn aanzienlijk aan transcriptionele gerelateerde programma's en aanpassingen aan de chromatine merken en organisatie^4,5. Bovendien, replicatie timing is gecorreleerd met vogelgriepvirus frequenties en veranderingen in de timing zijn waargenomen bij verschillende soorten kanker^6,7,8. Ondanks deze opmerkingen, de mechanismen en de determinanten van replicatie timing vestiging en verordening zijn nog grotendeels onbekend, en de rol die het speelt bij ontwikkeling en ziekte is onbepaald. Bovendien, tot onlangs de genoom-brede replicatie had timing van de veranderingen die zich in de gehele gewervelde ontwikkeling voordoen alleen onderzocht in cel cultuur modellen.

Zebravis, Danio rerio, zijn zeer geschikt voor het studeren replicatie timing in vivo tijdens de ontwikkeling, zoals een enkele paring paar kan opleveren van honderden embryo's die ontwikkelen snel met veel gelijkenissen met zoogdieren ontwikkeling^{9, 10}. Verder zijn er in de gehele ontwikkeling van de zebravis, wijzigingen in de celcyclus, chromatine organisatie en transcriptionele's die relaties met DNA replicatie timing¹¹delen. Zebravis zijn ook een uitstekende genetische model, zoals ze zijn bijzonder vatbaar voor manipulatie door Transgenese, mutagenese en gerichte mutaties en genetische schermen hebben vele genen nodig zijn voor de ontwikkeling van de gewervelde¹²geïdentificeerd. Zebrafish kan daarom worden gebruikt om genen die betrokken zijn bij replicatie timing totstandbrenging en het beheer te identificeren en te observeren van de gevolgen van de deregulering van de replicatie timing op gewervelde ontwikkeling. Transgene lijnen kunnen ook worden gebruikt ter beoordeling van de timing van de replicatie van afzonderlijke celtypes geïsoleerd op verschillende ontwikkelings timepoints of bij ziekte. Nog belangrijker is, zijn er verschillende zebrafish modellen van ziekten bij de mens die kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de rol van replicatie timing in ziekte vorming en progressie^9,13,14.

Onlangs, waren de eerste replicatie timing profielen gegenereerd op basis van zebravis, tot vaststelling van het als een modelsysteem om te studeren van replicatie in vivo¹⁵timing. Om dit te bereiken, werden cellen verzameld uit zebrafish embryo's in meerdere stadia van ontwikkeling en in een celtype van volwassen zebrafish geïsoleerd. Cellen werden vervolgens gesorteerd FACS (fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren) op basis van DNA-inhoud te isoleren van de G1 en S fase populaties. Kopiëren met behulp van de G1 voorbeeld als een numeriek besturingselement kopiëren, aantal variaties in de S-fase populaties werden bepaald en gebruikt voor het afleiden van de replicatie van de relatieve timing¹⁶. Veranderingen in de timing van de replicatie kunnen vervolgens direct worden vergeleken tussen verschillende ontwikkelings monsters en celtypes en dit werd gebruikt om te bepalen van de veranderingen in de timing van de replicatie die in vivo in gewervelde ontwikkeling optreden. Deze methode biedt diverse voordelen ten opzichte van andere genomische methoden, vooral dat het niet nodig labelen met thymidine analogen of immunoprecipitation van DNA^4,6.

Hier is de protocollen profiel genoom-brede DNA replicatie timing op gedetailleerde hoge resolutie in zebrafish. Deze protocollen zijn gebruikt om de relaties met de genomische en epigenetische functies in het genoom van de zebravis, evenals profilering van veranderingen in deze relaties die zich in de gehele ontwikkeling voordoen bepalen. Deze protocollen zijn ook gemakkelijk aangepast om te bestuderen van de veranderingen in de timing van de replicatie in gemuteerde stammen van zebravis en ziekte modellen. Bovendien bevatten deze methoden een stichting die kan worden uitgebreid om te bestuderen replicatie timing in specifieke celtypen, door de eerste sortering uit de individuele celtypes van de zebravis. De zebravis kan dienen als een uitstekende in-vivo modelsysteem te bestuderen van replicatie timing en uiteindelijk het onthullen van de biologische functies van deze belangrijke epigenetische trek.

Protocol

Alle dieren waren behandeld in strikte overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door de Oklahoma medische onderzoek Stichting institutionele Animal Care en gebruik Comité.

1. het opzetten van volwassen zebrafish voor de fokkerij

1. Gebruik een grote cohort van volwassen mannelijke en vrouwelijke zebrafish van een single strain voor de fokkerij. Er zijn kleine verschillen in de genetische samenstelling van zebravis van zelfs een single strain, gebruik van een grote cohort om resultaten zijn representatief voor de genetische variabiliteit van de bevolking en niet beperkt tot een kleine ondergroep van de bevolking.
2. De nacht voordat embryo's worden verzameld, plaats tientallen fokken volwassenen in het fokken van tanks, gebruik maken van ongeveer gelijke nummers van mannetjes en vrouwtjes. Afhankelijk van het experiment, gebruikt u een van de volgende strategieën voor de fok.
   1. Fokken van strategie 1: plaats een paar mannelijke en vrouwelijke zebrafish in individuele fokken tanks, de mannetjes gescheiden van de vrouwtjes met een divider. Als deze benadering wordt gebruikt, setup veel verschillende fokken tanks en bundelen van de embryo's uit elk om ervoor te zorgen dat de biologische variabiliteit is representatief voor de bevolking.
   2. Fokken van strategie 2: combineren van tientallen mannelijke en vrouwelijke zebrafish in een grote fokken tank. Pas deze strategie toe, zolang er een voldoende groot aantal embryo's, het is redelijk te veronderstellen zij kwam uit een verscheidenheid van oprichters en zijn daarom genetisch representatief zijn voor de bevolking.

2. getimede verparingen - inzameling, sortering en huisvesting zebrafish embryo's voor experimenten

1. Uitvoeren van getimede verparingen, begint zodra het licht cycli in de ochtend. Gooi embryo's 's nachts gegenereerd.
2. Toestaan vis te kweken in ondiep water (3-5 cm) gedurende een periode van 10 minuten, met een valse bodem voor embryo's door kan ontsnappen.
3. Na 10 min, verzamelen van embryo's door door een zeef gieten en in een 10-cm plaat met een fles van wassen spoelen. Zwembad alle embryo's verzameld op het zelfde tijdstip, markeren ze met moment van collectie en plaats onmiddellijk in een incubator bij 28,5 ° C.
4. Honderden van embryo's kunnen worden verwacht van een enkele paring pair in een dag. Meerderjarigen tot broeden in 10 min cycli totdat het aantal embryo's verkregen minder dan twintig is.
5. Ongeveer 1-1,5 h na het verzamelen, sorteren embryo's te verwijderen dode en onbevruchte embryo's. Als u wilt sorteren van embryo's, verwijder uit incubator en observeren onder een Microscoop ontleden.
   1. Tellen van embryo's en plaatsen bij een dichtheid van 100 embryo's per 10 cm plaat.
   2. Voeg verse E3 medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO₄) en embryo's terug te keren naar de 28,5 ° C incubator.

3. Dechorionate, deyolk, en op te lossen zebrafish embryo 's

Opmerking: Deze sectie van het protocol is ontworpen voor embryo's vóór 48u post bevruchting (hpf). Er is geen behoefte om te verwijderen van de chorions van embryo's in latere stadia van ontwikkeling (na 48 hpf), zoals ze vaak natuurlijk afvallen. Er is geen behoefte aan deyolk of het verwijderen van de chorions van vis oudere post de 5 dagen bevruchting (dpf).

1. Wanneer embryo's gewenste developmental leeftijd hebben bereikt, controleert u of fasen van ontwikkeling morfologisch onder een lichte Microscoop volgens "Stadia van embryonale ontwikkeling van de zebravis"¹⁷.
2. Tot 1500 geënsceneerde embryo's overbrengen in een conische buis 15 mL en meerdere malen wassen met E3.
   1. Voeg 1 mL E3 en 20 µL van Pronase-oplossing (30 mg/mL) voor elke 100 embryo's en zachtjes wervelen. Maximaal 1500 embryo's kunnen worden dechorionated in een enkele buis met 15 mL E3.
   2. Buis op zijn kant leggen en embryo's in een gelijkmatige laag om ervoor te zorgen maximale oppervlakte volumeverhouding te regelen. Zachtjes doorroeren buis elke 2-3 min tot alle chorions gedaald off van de embryo's. De totale dechorionation tijd zal variëren afhankelijk van de Pronase-activiteit.
3. Bovendrijvende vloeistof verwijderen en voorzichtig spoelen embryo's 3 keer met 10 mL van E3. Plaats de embryo's op het ijs voor de rest van deze sectie van het protocol.
4. Verwijderen van E3 en wassen van embryo's met vers bereide ijskoude deyolking buffer (0,5 x Ginzburg vis Ringer's oplossing, zonder calcium: 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 1.25 mM NaHCO₃).
   1. Voeg 1 mL ijskoud deyolking buffer voor maximaal 500 embryo's.
   2. Met behulp van een P1000, zachtjes Pipetteer embryo's op en neer 5 - 10 keer te verstoren dooier zak.
   3. 1 mL overbrengen in een 1,5 mL microfuge buis en centrifugeer bij 4 ° C en 500 x g gedurende 5 min.
5. Bezinken en wassen pellet met 1 mL ijskoud 1 x PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing, pH 7,0) te verwijderen van Ringer's oplossing verwijderen. Centrifugeer bij 4 ° C en 500 x g gedurende 5 minuten.
6. Zorgvuldig verwijderen van supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL 1 x PBS. Plaats de buis op ijs.
7. Voeg 3 mL ijskoud ethanol (EtOH) tot een conische buis 15 mL. Vortex buis van EtOH zachtjes op laag instelling.
   1. Met behulp van een P1000, langzaam (1 druppel per seconde) druppelen zebrafish embryo celsuspensie in EtOH terwijl vortexing zachtjes.
   2. Voeg een totaal van 1 mL van de celsuspensie embryo, voor de oplossing van een definitieve vastlegging van 75% EtOH.
8. Na 1 mL van cel is schorsing toegevoegd, voorzichtig swirl buis te mengen en plaats bij-20 ° C gedurende ten minste 1 uur. Het is aanbevolen om het plaatsen van de buizen aan hun kant te zorgen voor maximale oppervlakte volumeverhouding en verminderen van het aantal embryo's en cellen die plakken aan elkaar. Opgeslagen embryo cellen bij-20 ° C gedurende 2-3 weken.

4. vlekken van DNA en FACS embryo's sorteren

Opmerking: Deze sectie van het protocol is ontworpen voor embryo's in 1 dpf.

1. EtOH-vaste embryo cellen verwijderen van-20 ° C en centrifugeer bij 4 ° C 1500 x g gedurende 5 min.
   1. Plaats de buis op ijs en zorgvuldig verwijderen supernatant. Met behulp van een P1000, zachtjes resuspendeer de cellen in 1 mL vers bereide koude PBS-BSA (1 x PBS, 1% bovien serumalbumine).
   2. Centrifugeer cellen bij 4 ° C en 1500 x g gedurende 5 minuten en plaats op ijs.
2. Verwijderen supernatant en resuspendeer cellen in propidium jodide (PI) kleurstofoplossing (50 µg Mo/mL PI, 100 µg/mL RNase A, PBS, pH 7,0), met behulp van 200 µL voor elke 1000 embryo's.
   1. Toestaan dat cellen te broeden in PI oplossing voor 30 min op ijs, voorzichtig mengen elke 5 min.
   2. Plaats een 40 µm nylon cel zeef op een 50 mL conische buis op ijs. Zachtjes Pipetteer cellen meng en filtreer door de Maas.
      Opmerking: Als er meerdere buizen van embryo's uit de dezelfde timepoint werden verzameld in sectie 3 van het protocol, combineren deze embryo's op dit punt zodat ze samen worden gesorteerd.
   3. Met behulp van de flat binnen einde van de zuiger van een injectiespuit, zachtjes verstoren alle resterende bosjes van cellen op de Maas.
   4. Spoel de cellen via het filter met 500 µL van koude PBS-BSA voor elke 1000 embryo's.
   5. Plaatst u een 40-µm net boven een 15 mL conische buis op ijs en filtreer de celsuspensie uit de conische buis van 50 mL een tweede keer in de buis 15 mL.
3. Met behulp van een gewenste cel Sorteren instrument, stel de excitatie van de laser op 561-nm en emissie detectie tot 610/20 te detecteren propidium jodide.
   1. Mix 15 mL tube gekleurde cellen kort door vortexing en plaats in het instrument bij 4 ° C.
   2. De stem van de cellen op een langzame stroming, ideaal 1,0 mL/min, het verkrijgen van een schone celcyclus profiel en vermijden mengen G1 of G2/M cellen met de S fase bevolking uitvoeren.
   3. Eerst, poort voor FSC-A x SSC-een (forward scatter gebied door kant scatter gebied) te verwijderen van puin (figuur 1A).
      Opmerking: Cellen van de embryo's kunnen worden verschillende maten, afhankelijk van het stadium en cel type. Filter met neutrale dichtheid (ND) wellicht worden geschakeld tussen 1.0 en 1.5 afhankelijk van de grootte van cellen aanwezig. Poort een groot gebied voor het verzamelen van de meeste cellen en het verwijderen van puin.
   4. Tweede, poort voor SSC-gebied (WS-A) door PI-gebied (PI-A), verwijderen van puin en cel paren (figuur 1B).
   5. Ten derde poort voor SSC-A door SSC-W (breedte) te verwijderen van alle resterende cel paren (Figuur 1 c).
4. Weergeven van de gated populaties in een histogram met celaantal (graaf) op de y-as en propidium jodide-gebied (PI-A) op de x-as. Voor 24 hpf embryo's moeten hierdoor een stereotiepe celcyclus profiel zoals in Figuur 1 d.
   1. Wilt sorteren de S fase bevolking, stelt u de poort vanaf de rechterkant van de G1 piek aan de linkerzijde van de G2 piek, met inbegrip van slechts een minimale hoeveelheid van de G1 en G2 populaties. Voor 24 hpf embryo's, zal dit meestal ongeveer 10-15% van de gated bevolking omvatten (Zie Figuur 1 d).
   2. Wilt sorteren de G1 bevolking, stelt u de poort aan de linkerkant van de piek van de G1, niet door te geven van de top van de piek. De breedte van de G1 poort zo smal mogelijk aanpassen (Zie Figuur 1 d).
   3. Een back-poort de G1 en S fase populaties om goede eerste gating (figuur 1E).
5. Sorteren van de G1 en S fase populaties in 15 mL conische buisjes met 3 mL PBS-BSA. Het doel moet zijn om te verkrijgen tussen de 500.000 en 1 miljoen of meer gesorteerde cellen per fractie (G1 en S-fase).
6. Nadat het sorteren is voltooid, centrifuge buizen op 1500 x g en 4 ° C gedurende 10 minuten.
   Opmerking: De pellet kleincellige moeilijk zal zijn om te zien en het is belangrijk om niet te verstoren het, dus gebruik bij voorkeur een swingende emmer rotor over een vaste hoek rotor.
7. Zorgvuldig verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet met 1 mL 1 x PBS. Cellen overbrengen in een 1,5 mL microfuge buis en centrifugeer bij 6.000 x g en 4 ° C gedurende 5 min.
8. Verwijder voorzichtig alle vloeistof uit buis en het bevriezen van droge pellet bij-20 ° C. Bewaar de pellet bij-20 ° C gedurende 2-3 weken.

5. DNA isolatie, RNase behandeling en zuivering van DNA

1. Verwijder cel pellet van-20 ° C en plaats op het ijs.
   1. Voeg 400 µL van SDS buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5% SDS) pellet en resuspendeer.
   2. Proteïnase K toevoegen om een eindconcentratie van 0,2 mg/mL en meng door vortexing kort.
   3. Incubeer monsters bij 56 ° C gedurende 2 uur, vortex elke 15 min.
2. Voer na 2U, fenol-chloroform extractie door 400 µL van fenol-chloroform (fenol: Chloroform: Isoamylalcohol 25:24:1, verzadigd met 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) toe te voegen.
   1. Vortex voor 20 s en centrifuge monster bij 16.000 x g gedurende 5 min om de fasen te scheiden.
   2. Verwijder voorzichtig de bovenste waterfase (400 µL) en overdracht aan een 1,5 mL-buis.
3. Uitvoeren EtOH neerslag door 40 µL van 3M Natriumacetaat (pH 5.2), 2 µL van glycogeen, en 1 mL EtOH toe te voegen.
   1. Vortex meng en plaats bij-20 ° C's nachts te precipiteren DNA. Monster kan ook worden neergeslagen bij-80 ° C of op droog ijs gedurende 1 uur.
   2. Centrifuge monster bij 4 ° C en 16.000 x g gedurende 30 minuten aan pellet DNA.
   3. Discard supernatant en wassen pellet met 1 mL 70% EtOH. Centrifugeer bij 4 ° C en 16.000 x g gedurende 5 minuten.
   4. Gooi supernatant en aan pellet bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten.
4. Los van de pellet in 96 µL van gesteriliseerde met autoclaaf water, en voeg 4 µL van RNase A (2 mg/mL).
   1. Meng goed door vortexing en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
5. Fenol-chloroform extractie door toevoeging van 100 µL van fenol-chloroform en volgende procedure in stappen 5.2.1 - 5.2.2 uitvoeren
6. Uitvoeren EtOH neerslag toevoegen 10 µL van 3M Natriumacetaat, 1 µL glycogeen en 250 µL van EtOH en na de procedure in stappen 5.3.1 - 5.3.5.
7. Resuspendeer de pellet in 60 µL van TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH8.0)) en DNA-concentratie met behulp van een kwantitatieve fluorescentie gebaseerde methode te bepalen. Winkel DNA bij-20 ° C.
   Opmerking: Het is belangrijk te kwantificeren van DNA met behulp van DNA-bindende fluorescentie gebaseerde kleurstoffen of anderszins betrouwbaarder dan UV spectrometer gebaseerde methoden.

6. bereiding van DNA bibliotheken en de volgende generatie sequencing

Opmerking: Een G1 kopie nummer referentiemonster voor elk biologische bron is vereist voor elke sequencing run (d.w.z. WT, mutant, transgene, cellijn, etc). Vergelijk alle S fase monsters uit dezelfde biologische bron in de dezelfde volgorde uitvoeren op de dezelfde G1-objectverwijzing. Voer ten minste twee biologische replicatieonderzoeken van elk monster te zorgen voor samenhang tussen de monsters.

1. Verdunnen 1 µg van DNA tot een eindvolume van 50 µL en transfer naar een gespecialiseerde buis voor ultrasoonapparaat.
2. Schuintrekken genomic DNA voor een doel van 250-300 bp in een gerichte ultrasonicator, volgens de specificaties en het protocol van de fabrikant.
3. Controleer of de kwaliteit en grootte van sheared genomic DNA met behulp van een geautomatiseerde elektroforese machine, volgens de specificaties en het protocol van de fabrikant. Zorgen er is een grote piek van ~ 250-300 bp voor de sheared genomic DNA.
4. Bereiden sequencing bibliotheken met behulp van een DNA kit voor de voorbereiding van de bibliotheek met multiplex oligos voor het rangschikken op Illumina platform, volgens protocol van de fabrikant.
5. Controleer of kwaliteit van bibliotheek prep met behulp van geautomatiseerde elektroforese machine, volgens protocol van de fabrikant. Zorgen er is een grote piek van ~ 400-450 bp, en er zijn minimale pieken voor inleidingsdimeer (80-85 bp) en adapter Dimeren (~ 120 bp).
6. Kwantificeren van bibliotheken die een DNA kit voor de kwantificering van de bibliotheek gebruiken voor de volgende generatie DNA sequencing, volgens protocol van de fabrikant.
7. Verdunde 15 µL van bibliotheek tot een concentratie van 5 nM en combineren multiplexed bibliotheken nodig om gewenste unieke toewijzing lezen tellingen per monster.
   Opmerking: Het aantal unieke toewijzing leest per monster bepalend zijn voor de resolutie. Gebruik zo weinig als 5 miljoen toegewezen leest te beoordelen van replicatie timing voor de zebravis genoom. Het is raadzaam om te beginnen met 10-20 miljoen leest.
8. Uitvoeren gekoppeld-einde 100 bp hele genoom DNA sequentiebepaling van monsters op een volgende generatieplatform voor sequencing, volgens de instructies van de fabrikant.

7. analyse van de gegevens rangschikken

Opmerking: De instructies in dit gedeelte zijn bedoeld als leidraad voor analyse. Gebruik extra methoden voor sequencing uitlijning, filteren, verwerken, enz. Dit gedeelte van het protocol zal bezighouden met de geprefereerde methode voor de analyse in dit werk. Als extra methoden worden gebruikt, past u de parameters en functies aan die doeleinden. De onderstaande commando's worden ingevoerd in de Ubutnu of Mac terminal, met de juiste pakketten geïnstalleerd.

1. Verkrijgen van de meest recente versies van het genoom van de zebravis (danRer10, vanaf wanneer dit protocol werd geschreven) vanuit UCSC genome browser met behulp van de volgende opdrachten:
   wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz
   1. Decomprimeer het bestand fa.gz met de volgende opdracht:
      gunzip danRer10.fa.gz
   2. Sequencing gegevens uitlijnen op genoom BWA-mem met behulp van de volgende opdrachten gebruiken:
      BWA mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam
2. .Sam bestand converteren naar .bam bestand samtools met de volgende opdracht:
   samtools bekijken -bS input.sam > output.bam
   1. Sorteren de bestanden van de gebonden sequencing samtools met de volgende opdracht:
      samtools sorteren output.bam > output_sorted.bam
   2. Index van het .bam bestand samtools met de volgende opdracht:
      samtools index output.bam
3. Mark PCR wordt gedupliceerd met Picard met behulp van de volgende opdrachten:
   Java-Xmx2g-jar picard.jar MarkDuplicates \
   INPUT=input.BAM
   OUTPUT=output.BAM
   REMOVE_DUPLICATES = false
   METRICS_FILE=output_metrics.txt
4. Genereren van tekstbestanden (.txt) van leesbewerkingen voor elk chromosoom met het volgende commando:
   voor ik in {1,25}; CHROM doen = "chr" $i; ECHO $CHROM; samtools bekijken input.bam $CHROM | Cut -f 2,4,5,7,8,9 > readsChr$ {i} .txt; gedaan
   Opmerking: De kolommen in de resulterende txt-bestand zijn vlag, locatie, mapQ, paar chr, paar locatie en de grootte van het fragment, respectievelijk.
5. .Txt-bestanden lezen in Matlab (of elke andere soortgelijke software) met behulp van de functie textscan.
   1. Toewijzing van lage kwaliteit leest uitfilteren door het instellen van een mapQ drempel van 30.
   2. Verwijder leest met vlaggen voor niet-primaire uitlijning, PCR duplicaten of paar toewijzing aan een ander chromosoom.
   3. Elke leest met hun paar boven de drempel van een afstand van 2000 bp uitfilteren.
   4. Evalueren van statistieken van de resulterende leest om te bepalen aantal lees statistieken, dekking, invoegen grootte en kwaliteit (Figuur 2).
6. Lees dekking in 100 bp vaste windows voor elk monster bepalen door het tellen van het aantal leest in intervallen van 100 bp over de lengte van elk chromosoom.
   1. Bereken dat de mediaan lezen tellen voor alle vensters.
   2. Regio's van de hoge dekking uitfilteren door het verwijderen van windows groter is dan 5 standaardafwijkingen van de mediaan.
7. Regio's voor analyse in de G1 referentiemonsters definiëren door het vinden van de segmenten langs elk chromosoom met 200 leest met behulp van schuiframen.
   1. Lees diepte in elk monster S fase bepalen door het tellen van het aantal S fase leest in de Vensters van de graaf van de 200-lezen gedefinieerd voor de begeleidende G1 verwijzing.
8. De ruwe gegevens die met de csaps functie in de software, met een interpolatie-factor (p) van 10^-16glad.
9. Normaliseren afgevlakte gegevens naar z-score met een gemiddelde van 0 en een standaarddeviatie van 1.

Resultaten

Met behulp van gepubliceerde replicatiegegevens timing, representatieve replicatie timing profielen en kwaliteitscontrole maatregelen dienen¹⁵. De eerste stappen van verwerking betrekken de gegevens rangschikken aan het genoom, lees lengte en genoom dekking statistieken te berekenen en het filteren van lage kwaliteit, ongepaarde, en PCR dubbele leest uitlijnen. Lezen statistieken voor een typische zebrafish sequencing steekproef zijn afgebeeld in

Discussie

Zebravis vormen een nieuwe en unieke in-vivo modelsysteem te bestuderen van DNA replicatie timing. Wanneer getimede verparingen zijn uitgevoerd als beschreven in deze experimentele protocol, duizenden embryo's kunnen worden verzameld in een enkele dag voor experimenten. Deze embryo's ontwikkelen synchroon door precies getimed en duidelijk gekenmerkt stadia van ontwikkeling. Zebrafish kan worden gemakkelijk en nauwkeurig enscenering morfologie met een stereomicroscoop, zoals zebrafish embryo's extern te ontwikkel...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
KCl	Fisher Scientific	P217-500
CaCl2	Fisher Scientific	C79-500
MgSO4	EMD Millipore	MMX00701
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-500
Pronase	Sigma	10165921001	protease oplossing
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	D1408
Ethanol (EtOH)	KOPTEC	V1016
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A9647-100G
Propidium Iodide (PI)	Invitrogen	P3566
Tris-HCl	Fisher Scientific	BP153-500
EDTA	Sigma	E9844
SDS	Santa Cruz	sc-24950
Proteinase K	NEB	P8107S
Phenol:Chloroform	Sigma	P3803-100ML
Sodium acetate	J.T.Baker	3470
Glycogen	Ambion	AM9510
RNase A	Thermo Scientific	EN0531
Quanit-iT	Invitrogen	Q33130	Reagentia voor fluorescentie-gebaseerde DNA-kwantificering
Covaris AFA microTUBE	Covaris	520045	gespecialiseerde buis voor sonicatie
Covaris E220 Sonicator	Covaris	E220	gefocuste ultrasoon
Agilent 4200 Tapestation	Agilent	G2991AA	geautomatiseerde elektroforesemachine
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582	Reagentia voor geautomatiseerde elektroforesemachine
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina	NEB	Cat#E7370L	DNA-bibliotheekvoorbereidingskit
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1)	NEB	Cat#E7335S	multiplex oligo's voor DNA-bibliotheekvoorbereidingskit
NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2)	NEB	Cat#E7500S	aanvullende multiplex oligo's voor DNA-bibliotheekvoorbereidingskit
NEBNext Library Quant Kit for Illumina	NEB	E7630L	kwantificeringskit voor bibliotheekvoorbereiding
Agencourt AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63882	magnetische kralen
Illumina HiSeq 2500	Illumina	SY–401–2501	next generation DNA-sequencingplatform
40 µm Falcon Nylon Cell Strainer	Fisher Scientific	08-771-1
VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm	VWR	89107-632
6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100	VWR	89078-446
Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color	Denville Scientific	C2170 (1001002)	Dnase/Rnase vrij
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0236
Wash Bottles	VWR	16650-022	Low-Density Polyethylene, Wide Mouth
Strainer	VWR	470092-440	6.9 cm, fijn gaas
Corssing tank	Aquaneering	ZHCT100	individuele foktank
iSpawn	Techniplast	N/A	grote foktank
FACSAria II	BD biosciences	N/A	celsorteermachine
Wild M5a steromicroscope	Wild Heerbrugg	N/A	dissectiemicroscoop
Qubit 3 Fluorometer	Thermo Scientific	Q33216	kwantitatieve fluorescentie-gebaseerde methode voor het bepalen van DNA-concentratie
Matlab	Mathworks	versie 2017a
Matlab Statistics Toolbox	Mathworks	versie 11.1
Matlab Curve Fitting Toolbox	Mathworks	versie 3.5.5