In Vivo eenbeoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in een Rat Model van ischemische beroerte

Samenvatting

Het algemene doel van deze procedure is bedoeld als een zeer reproduceerbaar techniek voor in vivo beoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in rat modellen van ischemische beroerte.

Samenvatting

Ischemische beroerte leidt tot vasogenic hersenoedeem en latere primaire hersenletsel, dat is bemiddeld door vernietiging van de bloed - hersenbarrière (BBB). Ratten met geïnduceerde ischemische beroerte werden opgericht en gebruikt als in vivo modellen te onderzoeken van de functionele integriteit van de BBB. Spectrofotometrische detectie van Evans blauw (EB) in de hersenen monsters met ischemische schade kon betrouwbare overleggen voor onderzoek en ontwikkeling van nieuwe therapeutische modaliteiten. Deze methode reproduceerbare resultaten oplevert, en is van toepassing in een laboratorium zonder de behoefte aan speciale apparatuur. Hier presenteren we een gevisualiseerde en technische richtsnoer op de detectie van de extravasation van EB na inductie van ischemische beroerte bij ratten.

Inleiding

Vasogenic oedeem van de hersenen als gevolg van verstoring van de bloed - hersenbarrière (BBB) blijft een belangrijke complicatie van de ischemische beroerte en een belangrijke determinant van de overlevingskansen in de beroerte patiënten^1,2. De bloed - hersenbarrière (BBB), die is gevormd door hersenen capillaire endotheliale cellen (BCECs) en bestaat uit verschillende neurovasculaire componenten (BV, strakke kruispunten tussen BCECs, pericytes, astroglial en neuronale cellen³), biedt een gespecialiseerde en dynamische interface tussen het centrale zenuwstelsel (CNS) en perifere bloed-circulatie^4,5. Beledigingen zoals ischemie-reperfusie verwondingen kon de functionele integriteit van de BBB verstoren en leiden tot verdere penetratie van circulerende leukocyten in de hersenen parenchym die uiteindelijk leiden tot cerebrale ontsteking en primaire hersenletsel ^{6 , 7}. dierlijke modellen nodig zijn voor de exacte detectie van de dysfunctie van BBB na optreden van een beroerte. Dergelijke modellen zijn van groot belang voor het bestuderen van de onderliggende pathofysiologische mechanismen en de invoering van nieuwe neuroprotectieve strategieën. In vitro cel cultuur gebaseerde modellen van de BBB zijn sterk ontwikkeld en gebruikt voor moleculaire studie van de BBB fysiopathologie^8,9,10. In vivo diermodellen, die ischemische schade van de BBB vergelijkbaar met menselijke klinische omstandigheden produceren, zijn echter ook zeer de moeite waard in dit opzicht. Kwantitatieve detectie van de extravasation van Evans blauw (EB) is een goed aanvaard en gevoelige techniek die is gebruikt voor beoordeling van de BBB integriteit en functie in neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van ischemische beroerte^{11, 12 , 13 , 14}. deze methode is kosteneffectief, haalbaar, reproduceerbaar, en volledig toepasbaar in een experimenteel laboratorium. De uitvoering ervan vereist geen geavanceerde apparatuur, zoals radioactieve tracers¹⁵ of magnetische resonantie beeldvorming (MRI)¹⁶, dat zijn voorwaarden voor andere methoden. In dit artikel tonen we uitvoerig elementaire technische processen van BBB beoordeling EB extravasation met rat modellen van ischemische beroerte.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van Ardabil University of Medical Sciences Research Council voor het uitvoeren van dierproeven (ethische id-nummer: IR. ARONSKELKEN. REC.1394.08). In deze gevisualiseerde studie, gebruikten we volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten (300-350 g) verkregen uit grasland Instituut (Teheran, Iran).

1. narcose en flowmetrie

1. Anesthesie met 4% Isofluraan induceren en onderhouden met Isofluraan (1-1,5%) in een mengsel van lachgas (70% v/v) en zuurstof (30% v/v) voor de duur van de operatie.
2. Plaats een verdoofd dier in de naar voren gebogen houding op een feed-back gecontroleerde verwarming deken en handhaven van de lichaamstemperatuur op 37±0.5 ° C door middel van een rectale sonde verbonden aan deze verwarming eenheid.
3. Breng een kleine hoeveelheid van oogheelkundige zalf op beide ogen om te voorkomen dat droogte.
4. Scheren het chirurgische gebied aan de linkerzijde van de schedel met elektrische tondeuse. Gebruik betadine oplossing met een gaas-zeem desinfecteren van de huid. Deze regio met een steriele pad met 70% ethanol afspoelen en herhaal beide stappen voor drie cycli¹⁷.
5. Voor Analgesie, injecteren 0,2 mL 0,5% bupivacaine subcutaan de operatie regio¹⁷.
6. Maken van een incisie van 1 cm lange huid op de schedel (verlenging van de laterale canthus van het linker oog aan de basis van het linker oor) en de linker temporalis spier om bloot van de schedel te ontleden. Maak vervolgens een kleine burr gat 5 mm lateral aan en 1 mm posterieure aan de bregma¹⁸ tot en met de plaatsing van het gemak van het uiteinde van de sonde Doppler debietmeter potlood.
7. Draai de rat uit de gevoelig liggende positie, en zet dan de laser potlood sonde in het eerder geboorde schedel blind-gat te controleren van de regionale cerebrale doorbloeding (rCBF).
8. Opnemen van elk dier basislijn rCBF en beschouwen dit als 100%. Met name wordt midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) gestart wanneer een afname van de rCBF van meer dan 80% gedetecteerde^{19,20 is}.

2. de inductie van de focale Cerebra ischemie

1. Scheren van de nek regio en desinfecteren van de huid met betadine oplossing en 70% ethanol. Injecteren van 0,2 mL 0,5% bupivacaine subcutaan in chirurgie site voor analgesie¹⁷.
2. Maak een lange chirurgische incisie van 2 cm in het ventrale oppervlak van de nek tot de linker gemeenschappelijke halsslagader (LCCA). De LCCA van de naburige fascia en de nervus vagus om toegang bifurcatie voor de externe halsslagader (ECA) en de interne halsslagader (ICA) te isoleren.
3. Afbinden permanent LCCA of de ECA met een 5-0 zijde hechtdraad en ontleden ICA gratis tot het niveau van pterygopalatine slagader.
4. Losjes plaats een stand van 5-0 zijde hechtdraad rond LCCA, en vervolgens tijdelijk ICA klem met een vasculaire micro-clip.
5. Maken van een kleine incisie op de LCCA voorafgaand aan de eerder geplaatste losse stropdas, een 4-0 silicium-gecoat nylon hechtdraad invoegen in de luminal ruimte van ICA en aanscherping van de hechtdraad rond de LCCA voor de beveiliging van de nylon hechtdraad en voorkomen dat bloed lekt.
6. Verwijder de vasculaire micro-clip uit de ICA. Verder dan een silicium gecoate intraluminale gloeidraad tot het observeren van een sterke daling van rCBF die occlusie van de MCA-oorsprong aangeeft. Aan het einde van ischemische periode (90 min), start u reperfusie door het intrekken van de intraluminale hechtdraad²¹.

3. de halsslagader Cannulation en Evans blauw (EB) injectie

1. Maak een longitudinale incisie van 1 cm in de nek tot de linkerkant van de middellijn en vervolgens bot ontleden weg oppervlakkige fascia voor toegang tot de externe tak van de linker halsslagader (LGV). Vervolgens, afbinden permanent de craniale einde van de LGV met 5-0 zijde hechtdraad. Losjes plaats twee banden rond de ader, en vervolgens klem tijdelijk het cardiale einde van de LGV met een vasculaire micro-klem.
2. Maak een kleine incisie op de LGV tussen twee hechtingen, en vervolgens invoegen EDTA serum gevuld katheter in de luminal ruimte van de LGV en verder het ongeveer 10 mm. daarna, draai de ligaturen rond de ader voor de beveiliging van de katheter en voorkomen bloeden. Het injecteren van kleine hoeveelheden van serum om te voorkomen dat de ader samen te vouwen.
3. Aan het begin van de periode reperfusie, injecteren langzaam EB kleurstof (1 mL/kg van 2% EB-oplossing in een zoutoplossing) over een periode van 5 min. Vervolgens wassen de canule door injectie van 0,5 mL normale zout en trekken de canule injectie uit de ader^12,22.
4. Tot slot, suture van de nek en hoofd insnijdingen en injecteren van 0,05 mg/kg buprenorfine intraperitoneally (IP) en herhaal de injectie elke 6-8 h voor postoperatieve analgesie¹⁷periode reperfusie.
5. Injecteren van 5 mL voorverwarmde saline(IP) zodat de hydratatie van de herstel kooi¹⁷.
6. Plaats het dier in een speciale herstel kooi uitgerust met temperatuur en airconditioning controle en controleren van de terugwinning van het dier uit de narcose.

4. beoordeling van de bloed-Brain barrière-permeabiliteit

1. Na 24u van reperfusie, anesthetize diep het dier met thiopental natrium. Open vervolgens de borstholte door een klein gaatje onder het borstbeen.
2. Maken van een kleine opening in de juiste atrium en 250 mL voorverwarmde 0,9% zoutoplossing (37 ˚C) bij een druk van 110 mmHg door middel van het linkerventrikel voor 15 min te wassen EB weg van het verkeer totdat de normale zoute uitgangen van het atrium wordt kleurloos²³te injecteren.
3. Onmiddellijk verwijderen van de hersenen van de schedel en plaats deze in de hersenen-matrix. Ontleden van de bulbus olfactorius en cerebellum, en vervolgens met behulp van een schone scheermesje, scheiden de rechter hersenhelft van de hersenen van links (Lesioned), langs de middellijn.
4. Wegen van elk halfrond en meng ze apart in 2.5 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing, en meng dit met 2,5 mL trichloorazijnzuuroplossing (60%) gedurende 2 minuten met behulp van een vortex-machine.
5. Hersenen monsters gedurende 30 minuten bij 1,322 x g centrifugeren en laat de monsters om af te koelen in de koelkast 4 ° C gedurende 10 minuten.
6. Gebruik het supernatant de EB-extinctie door een spectrofotometer bij 610 nm²³.
7. EB concentraties tegen een standaard curve en uitdrukkelijke resultaten als µg/g van het hersenweefsel berekenen.

5. de productie van de EB standaard Curve

1. 10 monsteroplossingen van EB met een concentratie van 1-10 µg EB in 5 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing bereiden.
2. Meten van de extinctie-waarden van elk monster bij 610 nm met behulp van een spectrofotometer.
3. Het maken van een spreidingsdiagram met behulp van een werkblad en huidige EB concentraties op de X-as en de extinctie waarden op de Y-as (Figuur 1).
4. Definieer een lineaire trendlijn voor de curve met bijbehorende vergelijking. Gebruik vervolgens het verkrijgen van de EB-concentratie van monsters.
5. De eindresultaten van EB extravasation melden als µg/g van de hersenen weefsel gewicht.

6. sham operatie

1. Uitvoeren van de dezelfde chirurgische proces met ratten in sham bediende groep (inclusief waardoor een sneetje in de hals regio en EB injectie) maar uitsluiten van de MCAO.

Resultaten

Er was geen significant verschil in EB niveaus in de rechter hersenhelft ten opzichte van de linker hemisfeer van de sham bediende rats (1.06 ± 0,1 µg/g en 1,1 ± 0.09 µg/g, respectievelijk). Zoals in figuren 2A-2B, inductie van voorbijgaande ischemie (90 min ischemie / reperfusie 24u) veroorzaakt een significant verschil in EB niveaus (10.41 ± 0.84 µg/g, p < 0.001) in de linker hemisfeer van ischemische ratten, ten opzichte van de respectieve halfrond in de rats ...

Discussie

Tot nu toe diverse methoden zoals autoradiografie en opsporing van de radioactieve tracers^24,25, immunofluorescentie microscopie^26,27, en EB extravasation techniek^{20, 23} zijn gebruikt voor het evalueren van de schade van de bloed - hersenbarrière. EB kleurstof vermag sterk binden aan de serumalbumine en wordt gebruikt als een tracer voor vasculai...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Isofluraan	Piramal	AWN 34041100	20 - 25 °C
2,3,5-Trifenyltetrazoliumchloride (TTC)	Molekula	31216368	4 jaar
Sprague–Dawley ratten	Pasture Institute (Teheran, Iran)		300-350g
Evans Blauw	Sigma-Aldrich	314-13-6
Trichloroazijnzuur	Sigma-Aldrich	76-03-9	2 jaar
Bupivacaïne HCl (0,5%)	Delpharm Tours		onder 25 °C
Buprenorfine	Exir (Iran)
Natriumcarbonaat	Sigma-Aldrich	497-19-8
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Di-natriumwaterstoffosfaat	EMD Millipore	231-448-7
Kaliumchloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
silicone(Xantopren)	Heraeus	EN ISO 4823
Activator universeel plus	Heraeus	66037445
Micro-dissectiepincet	Stoelting	52100-41
Veerscheerscharen	Stoelting	52130-00
Operatiescheren	Roboz	52140-70
Hersenmatrix	Stoelting	51390
Anesthesieapparaat voor kleine dieren |	Kent Scientific	SS-01
Power Lab systeem	AD Instruments	ML880
Laser Doppler flowmeter	AD Instruments	ML191
Verwarmingsfeedbacksysteem	Harvard Appratus	72-7560
Vasculair microklem	FineScience Tools	18055-03
Zijdedraad 5-0	Ethicon	682G
Ethilon 4-0 hechtdraad	Ethicon	EH6740G