Methodenartikel

Confocale microscopie onthult cel oppervlakte Receptor aggregatie via afbeelding correlatie spectroscopie

DOI:

10.3791/57164

⸱

2 augustus 2018

 ,  ,  , 
1Tumour Targeting Laboratory, Olivia Newton-John Cancer Research Institute, 2School of Cancer Medicine, La Trobe University, 3Centre for Micro-Photonics, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology, 4LIMS Bioimaging Facility, La Trobe Institute for Molecular Science, La Trobe University, 5Department of Medical Oncology, Olivia Newton-John Cancer and Wellnes Centre, Austin Health, 6Department of Medicine, University of Melbourne, 7Department of Molecular Imaging and Therapy, Austin Health

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antilichamen die zich aan target receptoren van het celoppervlak binden kunnen verlenen bevleesdheid en clustering wijzigingen. Deze dynamische veranderingen hebben gevolgen voor het karakteriseren van Geneesmiddelenontwikkeling in de doelcellen. Dit protocol maakt gebruik van de confocal microscopie en afbeelding correlatie spectroscopie via ImageJ/FIJI te kwantificeren van de omvang van de receptor clustering op het celoppervlak.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Confocale microscopie biedt een toegankelijke methode om vast te leggen van cruciaal belang voor de karakterisering en de verdere ontwikkeling van pre-klinische agenten gelabeld met de fluorescerende sondes sub cellulaire interacties. Met de recente vooruitgang in antilichaam gebaseerd cytotoxische drug is levering systemen, inzicht in de wijzigingen veroorzaakt door deze agenten binnen het domein van de receptor aggregatie en internalisering van cruciaal belang. Dit protocol borduurt voort op de gevestigde methodologie van fluorescerende immunocytochemie en de verdeling van de opensource-FIJI voor ImageJ, met zijn ingebouwde autocorrelatie en de afbeelding wiskundige functies, voor het uitvoeren van ruimtelijke beeld correlatie spectroscopie (ICS). Dit protocol kwantificeert de fluorescerende intensiteit van gelabelde receptoren als een functie van de ruimte van de lichtbundel van de confocal microscoop. Dit biedt een kwantitatieve meting van de Braziliaanse deelstaat doel molecuul aggregatie op het celoppervlak. Deze methode is gericht op de karakterisatie van statische cellen met potentieel uit te breiden in temporele onderzoeken van receptor aggregatie. Dit protocol biedt een toegankelijk methodologie om een kwantificering van clustering van gebeurtenissen die plaatsvinden op het celoppervlak, technieken en niet-gespecialiseerde beeldvormende apparatuur met behulp van goed gevestigd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van therapeutische antistoffen heeft aangetoond opmerkelijke succes in de behandeling van meerdere tumor type1. De recente ontwikkelingen op het gebied van geconjugeerde (ADC) van de antilichaam-drug oppervlakte zoals uitvoeringsmechanismen voor cytotoxische stoffen heeft de eisen voor het begrip van de dynamiek van antilichaam: receptor interakties bij de cel uitgebreid2. Na de succesvolle targeting op van een antilichaam aan de cel-oppervlakte receptor, kunnen deze complexen veroorzaken vergelijkbare aggregatie patronen die waargenomen in ligand: antilichaam interacties3. Wijzigingen in de receptor aggregatie kunnen leiden tot wijzigingen in het membraan en het resultaat in de internalisering van de receptor en de verwijdering van het celoppervlak. In het kader van een geconjugeerde antilichaam-drug vrij dit proces vervolgens de cytotoxische nettolading in verinnerlijkte Endosomen en vervolgens het cytoplasma, resulterend in effectieve cel doden.

Confocale microscopie heeft een doeltreffend middel voor het visualiseren van deze belangrijke interacties van antilichamen en hun doel receptoren4verstrekt. Voor het verkennen van de veranderingen van de samenvoeging van de doelmolecule op het celoppervlak dit protocol maakt gebruik van nabewerking van confocale microscopie beelden via een ruimtelijk beeld correlatie spectroscopie (ICS) techniek 5,6,7 .

De Stichting voor beeld correlatie spectroscopie is de waarneming dat schommelingen van de intensiteit van de ruimtelijke fluorescentie een relatie met de dichtheid en de aggregatie-staat van de gelabelde structuren delen. Deze relatie komt tot stand na de berekening van de autocorrelatiefunctie van een ruimtelijke van een opname-5.

Alle varianten van afbeelding correlatie spectroscopie vereisen de berekening van de autocorrelatie van een afbeelding. Dit wordt gevolgd door het aanbrengen van deze functie een tweedimensionale Gauss-curve voor de extractie van kwantitatieve aggregatie-staat parameters opgenomen binnen het besturingselement image. In eenvoudige termen de berekening van de autocorrelatie van een afbeelding gaat vergelijken alle de mogelijke pixel paren deel uitmaakt van een afbeelding en het berekenen van de kans dat beide even zo helder als elkaar. Dit is als een functie van de afstand en richting van pixel scheiding8gevisualiseerd.

Het theoretisch kader voor de afbeelding correlatie spectroscopie werd vastgesteld en gedefinieerd door Petersen en Wiseman et al. 5 , 6. in dit protocol, de autocorrelatie berekeningen worden uitgevoerd in Fiji/ImageJ evenals een spreadsheetprogramma, de basis voor de intensiteit schommelingen ruimtelijke autocorrelatiefunctie kan worden omschreven als (Eq 1):

figure-introduction-1     

waar F vertegenwoordigt de Fourier-transformatie; F−1 de inverse Fourier transform; F * de complex geconjugeerde; en de ruimtelijke lag variabelen ε en η. In ruimtelijke ICS, zoals beschreven in dit protocol, kan de autocorrelatiefunctie worden berekend met behulp van een 2D snelle Fourier transform algoritme7,9. De autocorrelatiefunctie op nul ruimtelijke scheiding ook wel bekend als nul-lag, g11(0,0), biedt het omgekeerde gemiddelde aantal deeltjes per oppervlakte-straal van de Microscoop aanwezig. Het kan worden verkregen door het aanbrengen van de ruimtelijke autocorrelatiefunctie naar een tweedimensionale Gauss functie (Eq 2):

figure-introduction-2     

Als de pixels gevangen binnen een afbeelding binnen een set gebied zijn opgenomen en deze metingen niet uit te tot in het oneindige breiden doen, wordt de term g∞ gebruikt als een compensatie voor lange-afstands ruimtelijke correlaties die deel uitmaakt van de afbeelding. Voor moleculaire en middelgrote aggregaten, ω is de functie van de punt-spread van de Microscoop en beschreven door de volle breedte op half-maximale van de ruimtelijk autocorrelatiefunctie. Het gebied dat deel uitmaakt van het punt verspreiden-functie van het instrument kan worden gekalibreerd met behulp van sub resolutie fluorescerende kralen.

Voor de afbeelding correlatie spectroscopie protocol hierin beschreven, worden de autocorrelatie en wiskundige functies vereist voor het voltooien van de Internet-verbinding delen uitgevoerd met behulp van de open-sourceplatform imaging-verwerking, Fiji10, een verdeling van de ImageJ programma11,12. Fiji/ImageJ maakt gebruik van de vooraf geïnstalleerde snelle Fourier-transformatie in de FFT Math-functie. Deze functie vermindert de compute tijd die nodig is voor deze berekening door vermindering van het gegevensbereik met een factor twee in elke dimensie13. Zoals de 2D autocorrelatiefunctie ongeveer symmetrisch in x, y-as is kan een enkellijns profiel perceel door het beeld van de autocorrelatie worden gebruikt voor het meten van de ruwe autocorrelatie als een functie van de ruimtelijke lag. Geen nul-lag-geluid wordt verwijderd voorafgaand aan verdere berekening, met de daaruit voortvloeiende autocorrelatie amplitude (piekwaarde, g(0)T) gecorrigeerd voor de achtergrond met de expressie (Eq-3):

figure-introduction-3     

waar ikb is de gemiddelde intensiteit van een gebied op de achtergrond met uitzondering van de cel. De cluster densiteit of dichtheid van fluorescente voorwerpen, wordt gedefinieerd door (Eq 4):

figure-introduction-4    

In het protocol hierin beschreven, verder we gewoon de berekening van de dichtheid van het cluster (CD), met de veronderstelling gebaseerd op de observatie dat een genormaliseerde autocorrelatiefunctie zal vergaan op een waarde 1.0 met toenemende ruimtelijke lag naderen. Met maximale ruimtelijke vertraging, er is niet langer een correlatie van fluorescentie intensiteitswaarden en dus zonder een correlatie zijn de berekeningen op deze regio computing de waarde van een intensiteit vermenigvuldigd met deze intensiteit die wordt vervolgens gedeeld door de kwadraat van die intensiteit, die per definitie gelijk is aan 1,0. Dus, kan de cluster dichtheid van een genormaliseerde autocorrelatiefunctie door af te trekken 1.0 van de genormaliseerde autocorrelatiefunctie alvorens de wederkerige (Eq 5)worden berekend:

figure-introduction-5     

Verdere kalibratie van de lichtbundel gebied kan worden uitgevoerd om het kwantificeren van het aantal clusters deel uitmaakt van het gebied van het punt verspreiden-functie van het instrument. Dit moet worden gekalibreerd met behulp van dezelfde optische voorwaarden gebruikt tijdens de beeldanalyse correlatie spectroscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. het zaaien van aanhangend cellijnen voor Imaging-Experiment

  1. Zaad van 10.000 A431 epidermoïde carcinoom cellen per goed overnachting (O/N) in 300 µL van Dulbecco van bewerkt Eagle Medium/nutriënt mengsel F-12 (DMEM/F-12) media bevattende 10 gewichtspercenten foetale runderserum, 1% penicilline-streptomycine en 1% GlutaMAX in een 8 chambered imaging dia geschikt voor hoge resolutie olie-immersie-objectieven (bijvoorbeeld NuncTM Lab-TekTM chambered dekglaasje).
  2. Stimuleren de receptor aggregatie op A431 cellen met toevoeging van 100 ng/mL EGF ligand in de media gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).

2. primair antilichaam-incubatie

  1. Verwijder media en cellen met 300 µL kamertemperatuur (RT) fosfaatgebufferde zoutoplossing (1 x PBS) twee keer wassen.
  2. Herstellen van de cellen met de 200 µL van 4% paraformaldehyde in PBS voor 10 min op RT.
    Opmerking: Om te verkennen de temporele veranderingen van doel aggregatie, deze stap fixatie moet worden weggelaten.
  3. Verwijder PFA en cellen met 300 µL van kamertemperatuur PBS tweemaal wassen.
  4. Incubeer de cellen met 200 µL van PBS met primair antilichaam bij een concentratie van 10 µg/mL gedurende ten minste 2 uur bij 4 ° C.
    Opmerking: Voor de berekeningen van de ICS te gelden, alle receptoren aanwezig op het celoppervlak moeten worden aangeduid met primair antilichaam. Dit vereist voorbereidende experimenten met een verdunningsreeks van elk primair antilichaam (1:10, 1:50, 1:100, 1:200, 1:500 1:1, 000, enz.) moet worden uitgevoerd. Optimale primair antilichaam concentratie wordt bepaald door analyse van de intensiteit van de fluorescentie versus cluster dichtheid. De geselecteerde primaire concentratie treedt op wanneer de cluster dichtheid randplateau met toenemende primair antilichaam concentraties voorafgaand aan een verdere verhoging in cluster dichtheid als gevolg van niet-specifieke antilichaam binding. Het primaire antilichaam kan worden verdund in serum vrije media als een tijdsverloop imaging experiment uitvoert.
  5. Na voltooiing van gewenste incubatietijd, cellen met 300 µL van RT PBS tweemaal te wassen.
  6. Blokkeren van het monster met 5% bovien serumalbumine (BSA) in PBS voor ten minste 2 uur bij 4 ° C.
    Opmerking: Vaste monsters worden routinematig geblokkeerd overnachting (O/N) bij 4 ° C.

3. secundair antilichaam-incubatie

  1. Bereiden een 10 µg/mL voorraad van fluorescently gelabeld secundair antilichaam (b.v. Alexa Fluor 488 IgG) in PBS. 2 µg/mL Hoechst 33342 kunnen worden opgenomen in deze verdunning te voorzien in verbeterde monster ontdekking op de Microscoop.
    Opmerking: Voor time-lapse experimenten, PBS kan worden ingewisseld voor serum vrije media.
  2. Verwijderen van 5% BSA/PBS uit de cellen en incubeer met de secundair antilichaam oplossing gedurende 2 uur bij 4 ° C, terwijl de bescherming van de monsters van omgevingslicht.
  3. Na voltooiing van secundair antilichaam-incubatietijd, wassen van de cellen met 300 µL van PBS (tweemaal) en bewaren bij 4 ° C, beschermen tegen omgevingslicht.
  4. Om te voorkomen dat verdamping, wikkel de randen van de kamer-dia met parafilm.

4. confocale microscopie van monsters

Opmerking: De instellingen die worden gebruikt voor analyse van de confocal zal verschillen afhankelijk van de apparatuur en fluorophores gebruikt in de individuele experiment. Moderne confocal instrumenten bieden mechanismen voor het opslaan van alle imaging parameters die worden gebruikt in het experiment in de bestandsindeling van de native beeld van het instrument. Het is belangrijk dat deze instellingen worden vastgelegd om te voorzien in passende replicatie van experimentele omstandigheden over verschillende periodes van data-acquisitie.

  1. Tijdens de beeldvorming van fluorescerende signalen, Vermijd overmatige verzadiging. Gebruik van een opzoeken met afbeelding van de tabel die een kleurenweergave van de valse van pixel verzadiging biedt en verminderen detector winst en laser macht dienovereenkomstig. Meest confocal middelen omvatten met name een "bereik indicator" instelling of soortgelijke optie in de acquisitie software hiervoor.
  2. Het minimaliseren van de blootstelling van fluorophore van belang zijn voor laser power. Het gebruik van een DNA-labeling vlek zoals Hoechst 33342 biedt een eenvoudig mechanisme om te detecteren en plaatsen van het monster in het gezichtsveld voor de collectie.
  3. De eerste scans van het monster met een lage resolutie uitvoeren en als software een snelle laat scansnelheid. Hiermee beperkt u de mogelijke photobleaching van het monster.
  4. Verhoog de resolutie vastleggen en verlaag de snelheid van de scan als u klaar bent voor het verzamelen van afbeeldingsgegevens.
  5. Als de confocal instrument dat toelaat, verzamelen van gegevens met behulp van een foton tellen modus.
    Opmerking: Als het foton tellen is niet beschikbaar op het instrument: zorgen grijze niveaus zijn lineaire tijdens Beeldacquisitie.
  6. Stel het gaatje voor elke regel van de laser gebruikt om 1 luchtige eenheid (AU).
  7. Gebruik lijn of frame gemiddeld tijdens Beeldacquisitie (x4) om de detector verbonden lawaai.
    Opmerking: In deze variant van ICS als slechts één tijdstip is vastgelegd Acquisitietijd is niet experimentele factor te beperken.
  8. Voor foto collectie selecteren een hoge vergroting, hoog numerieke diafragma doelstelling, zoals een doelstelling van het Plan-Apochromat, zodat de maximale resolutie en correctie voor sferische en chromatische aberraties (voorbeelden zijn Plan-Apochromat 100 X of 63 X /1.40 Olie doelstellingen).
  9. Oversample de grootte van de gevangen pixels in de afbeelding. Het is aangeraden elke pixel vangen een 50 x 50 nm regio. Voor effectieve ICS moet pixelformaat minder dan 0.1 x 0.1 µm2 per pixel. Dit wordt bereikt door een combinatie van inzoomen om het scannen van een relatief klein gebied en een relatief grote beeldformaat (bijvoorbeeld 1024 x 1024 of 2048 x 2048 pixels) selecteren.
  10. Focus op het apicale of basale oppervlak van de cel aan een regio zo plat mogelijk. Meerdere cellen kunnen worden verzameld in één beeld en regio's van belang afzonderlijk verwerkt tijdens de ICS-analyse.
  11. Vastleggen van een cel gratis achtergrond regio met dezelfde instellingen instrument moet worden gebruikt voor de normalisatie van de steekproef.

5. berekening van de afbeelding correlatie spectroscopie

Opmerking: De open-source imaging-processing platform, Fiji, een verdeling van de ImageJ program, is vereist voor het uitvoeren van de autocorrelatie en wiskundige functies essentieel voor ICS. Deze distributie voor ImageJ wordt aanbevolen omdat hierin talrijke vooraf geïnstalleerde plug-ins en een gemakkelijker bijwerken architectuur die bewerkingen op meerdere beeldvorming experimenten uitvoeren kunt.

  1. Het programmainstalleren Fiji (http://fiji.sc/Downloads).
  2. Laden van de verworven datasets.
  3. Identificeer de apicale of basale cel oppervlakte membraan regio van belang en duplicaat pixelgrootte van 2n (128 x 128, 256 x 256, 64 x 64). "Menu: afbeelding > dupliceren..."
  4. Berekenen van de gemiddelde intensiteit van de bijgesneden gebied van belang "Menu: Analyse > metingen."
  5. Identificeren van een gebied op de achtergrond en dupliceren naar de dezelfde pixelgrootte van de celmembraan oppervlakte vangen (2n: 256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). "Menu: afbeelding > dupliceren..."
  6. Bereken de gemiddelde intensiteit van de achtergrond bijgesneden gebied van belang. "Menu: Analyse > metingen."
  7. Aftrekken van de gemiddelde intensiteit van de achtergrond van de afbeelding met de regio van belang. "Proces > beeld Calculator > aftrekken."
  8. Berekening van de autocorrelatiefunctie. Deze berekening is vervat in de menustructuur: "proces > FTT > FD Math."
    1. In de wiskunde FD dialoogvenster Selecteer: afbeelding 1: bijgesneden afbeelding naam, werking als correlatie, afbeelding 2: de naam van de afbeelding bijgesneden, Inverse transformatie op.
  9. Normaliseren het resulterende beeld door te delen door het totale aantal pixels. "Menu: proces > wiskunde > verdelen..." (dat wil zeggen: 64 x 64 pixels = 4096)
  10. Normaliseren opnieuw door te delen door de gemiddelde intensiteit van de genormaliseerde bijgesneden gebied kwadraat. "Menu: proces > wiskunde > verdelen..."
    Opmerking: Dit kan worden bereikt door het delen van de afbeelding door de intensiteitswaarde van de gemiddelde tweemaal.
  11. Teken een lijn via de functie van het punt verspreiden.
  12. Het profiel van deze regel voor de berekening van de piekwaarde worden uitgezet. "Menu: analyseren > Plot profiel."
  13. De clusters per bundel oppervlakte berekenen door de overdracht van de piekwaarde (resultaat van 5.12) naar een werkblad en voer de volgende berekening (Eq 6):
    figure-protocol-1

6. batch-verwerking van ICS datasets

Opmerking: De oprichting van een FIJI/ImageJ macro wordt aanbevolen voor het repliceren van de procedures die zijn beschreven in het bovenstaande protocol. Dit zorgt voor de consistente en snelle analyse van meerdere afbeeldingsbestanden tijdens beeldanalyse correlatie spectroscopie.

  1. Een macro ICS workflow stellen door het opnemen van elke menuopdracht in het ICS-protocol
    "Menu: Plugins > macro's > Record...".
  2. Selecteer "Create" voor het genereren van de Macro.
  3. Selecteer "Language > IJ1 Macro."
  4. Sla de Macro.
  5. Dialoogvensters toevoegen aan verschillende stappen van de macro, verstrekken van herinneringen aan exploitanten van elke functie. Dialoogvensters ook dienen als een methode om te pauzeren het analyseproces te voorzien in passende selecties worden gemaakt vóór verdere verwerking (dat wil zeggen, de regio om te snijden)
    1. Code voor het dialoogvenster Macro
      titel = "Dialoogvenster vak titel";
      msg = "Dialog Box/Protocol stap bericht";
      waitForUser (titel, msg);
      Opmerking: Extra efficiëntie kunnen worden vastgesteld door een abonnement op de site update BAR binnen de FIJI Updater (instructies https://imagej.net/BAR). Dit biedt FIJI "een verzameling van breed toepasbare Routines" 14. Één dergelijke routine is zoeken pieken. Menustructuur: "BAR > gegevensanalyse > zoeken pieken." Dit script is dat een snelle hulpmiddel voor de berekening van dat de piekwaarde in het profiel van het punt verspreiden functie.

7. protocol-extensies: Berekening van Beam gebied van Microscoop

Opmerking: De optische overdrachtsfunctie van de Microscoop zorgt ervoor dat zelfs moleculaire middelgrote objecten worden weergegeven als afbeeldingen met een straal van ongeveer 200-300 nm in de x-y-vlak. Het ICS-protocol kunt bepalen van het punt-spread-functie door het uitvoeren van stap 4 en 5 op sub resolutie fluorescerende kralen. Met name:

  1. Mount sub resolutie (d.w.z. < 100 nm diameter) TL kralen op een 8 kamer imaging dia.
  2. Afbeelding kralen per beschreven protocol met behulp van de confocal microscoop gebruikt voor ICS-experimenten.
  3. Bereken de ICS-functie van de resulterende afbeelding per protocol stappen 5.1-5.13.
  4. Bereken de straal van de straal (r) als de volle breedte op de helft van de maximale waarde van de functie Internet-verbinding delen uit het uitgezette profiel.
  5. Het berekenen van de oppervlakte van de lichtbundel (BA) (Eq 7):figure-protocol-2

8. protocol-extensies: Berekening van Clusters Per oppervlakte-eenheid

  1. Bereken de dichtheid van het cluster (CD) per oppervlakte-eenheid als (Eq 8):
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4
  2. Verdeel de clusters per bundel gebied (resultaat van 5.13) door het gebied van de lichtbundel (resultaat van 7.5).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een succesvolle afbeelding correlatie spectroscopie experiment is afhankelijk van de juiste toepassing van controles van de behandeling. Deze behandeling-groepen zijn het onderzoek van de fluorescentie in geen primair antilichaam en geen secundair antilichaam behandelgroepen. Zodra de optimale confocale laser-instellingen zijn opgegeven voor een experiment, moeten van deze controlegroepen te bevestigen van het gebrek aan niet-specifieke fluorescentie binnen het monster beelden vastleggen....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De techniek van de afbeelding correlatie spectroscopie (ICS) die we in dit protocol beschrijven maakt gebruik van standaard confocal microscopen zonder de behoefte aan gespecialiseerde detectoren. De techniek van de Internet-verbinding delen beschreven maakt gebruik van gevestigde immunocytochemie methoden te voorzien van snelle bemonstering van meerdere behandeling voorwaarden voor verhoogde statistische analyse. Deze methode doet dat met een lichte daling in absolute precisie in vergelijking met alternatieve enkel mole...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Andrew M Scott heeft steun van AbbVie Pharmaceutics, EMD Serono en Daiichi Sankyo Co financiering van onderzoek, en een consultancy en stock eigendom van Life Science farmaceutische producten. De auteurs hebben geen andere relevante voorkeuren of financiële betrokkenheid bij een organisatie of entiteit met een financieel belang in of financiële conflict met het onderwerp of de materialen besproken in het manuscript met uitzondering van die vermeld.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen financiering van de steun van NHMRC (1084178 van de Fellowship en subsidies 1087850, 1030469, 1075898 (AMS)), kanker Australië, Ludwig kankeronderzoek, John T Reid vertrouwt, Cure Brain Cancer Foundation, La Trobe University en het Victoria kanker Agentschap. Financiering van operationele infrastructuur ondersteuning wordt geboden door de Victoriaanse regering, wordt Australië ook erkend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass - 8 wellThermoFisher Scientific155409
DPBS, no calcium, no magnesiumThermoFisher Scientific14190144
Fetal Bovine SerumThermoFisher Scientific10099141
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol redThermoFisher Scientific12604021
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
GlutaMAX SupplementThermoFisher Scientific35050061
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA11013
TetraSpeck Fluorescent Microsphere Standards 0.1µmThermoFisher ScientificT7279
CetuximabMerck Serono3023715501
Parafilm M 38mx100mmMerck MilliporeBRND701605
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solutionProSciTechC004
Recombinant Human EGFR&D System236-EG

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 278-287 (2012).
  2. Parslow, A. C., Parakh, S., Lee, F. -T., Gan, H., Scott, A. Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy. Biomedicines. 4 (3), 14(2016).
  3. Sorkin, A., Waters, C. M. Endocytosis of growth factor receptors. BioEssays. 15 (6), 375-382 (1993).
  4. Pawley, J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , Springer Science & Business Media. (2006).
  5. Petersen, N. O., Höddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophysical Journal. 65 (3), 1135-1146 (1993).
  6. Wiseman, P. W., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. II. Optimization for Ultrasensitive Detection of Preexisting Platelet-Derived Growth Factor-β Receptor Oligomers on Intact Cells. Biophysical Journal. 76 (2), 963-977 (1999).
  7. Costantino, S., Comeau, J. W. D., Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Accuracy and Dynamic Range of Spatial Image Correlation and Cross-Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (2), 1251-1260 (2005).
  8. Claire Robertson, S. C. G. Theory and practical recommendations for autocorrelation-based image correlation spectroscopy. Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 080801(2012).
  9. Ciccotosto, G. D., Kozer, N., Chow, T. T. Y., Chon, J. W. M., Clayton, A. H. A. Aggregation Distributions on Cells Determined by Photobleaching Image Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 104 (5), 1056-1064 (2013).
  10. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  11. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  12. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
  13. Rappaz, B., Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy for measurements of particle densities and colocalization. Current protocols in cell biology. , Chapter 4, Unit 4.27.1-15 (2013).
  14. Ferreira, T., Hiner, M., Rueden, C., Miura, K., Eglinger, J., Chef, B. tferrS. criptsB. A. R. tferr/Scripts: BAR 1.5.1. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/495245 (2017).
  15. Elson, E. L. Fluorescence Correlation Spectroscopy: Past, Present, Future. Biophysical Journal. 101 (12), 2855-2870 (2011).
  16. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Current opinion in chemical biology. 10 (5), 409-416 (2006).
  17. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-Resolution Fluorescence Microscopy. dx.doi.org.ez.library.latrobe.edu.au. 78 (1), 993-1016 (2009).
  18. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  19. Nohe, A., Petersen, N. O. Image Correlation Spectroscopy. Sci. Signal. (417), pl7(2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fluorescent ImmunocytochemistryEGF Receptor ClusteringPoint Spread Function AnalysisFiji ImageJ ProcessingA431 Epidermoid Carcinoma CellsSpatial Intensity QuantificationBeam Area Measurement

Gerelateerde artikelen