Een uitgebreide Procedure voor de evaluatie van de prestaties In Vitro van de vermeende Hemangioblastoma Neovascularization met behulp van de kiemen Assay sferoïde

Summary

Dit artikel presenteert een uitgebreide procedure om te evalueren in vitro of klassieke tumor angiogenese in hemangioblastomas (HBs) en haar rol in de HBs bestaat. De resultaten wijzen op de complexiteit van de HB-neovascularization en suggereren dat deze gemeenschappelijke vorm van angiogenese slechts een aanvullende mechanisme in de HB-neovascularization is.

Abstract

De inactivering van het von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gen speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van de hemangioblastomas (HBs) binnen het menselijk zenuwstelsel (CNS). Echter zowel de cytologische oorsprong en het evolutieproces van HBs (inclusief neovascularization) blijven omstreden, en anti-angiogenese voor VHL-HBs, gebaseerd op de klassieke HB angiogenese, teleurstellende resultaten in de klinische proeven hebben opgeleverd. Een belangrijke belemmering voor de succesvolle klinische vertaling van anti-vasculaire behandeling is het ontbreken van een grondige kennis van neovascularization in deze vasculaire tumor. In dit artikel presenteren we een uitgebreide procedure om te evalueren in vitro of klassieke tumor angiogenese in HBs, evenals zijn rol in de HBs bestaat. Met deze procedure, kunnen onderzoekers nauwkeurig begrijpen de complexiteit van HB neovascularization en identificeren van de functie van deze gemeenschappelijke vorm van angiogenese in HBs. Deze protocollen kunnen worden gebruikt om de meest veelbelovende anti-vasculaire therapie voor tumoren, die hoge translationeel potentieel tumoren behandeling of heeft voor medeplichtigheid in de optimalisatie van de anti-angiogenic behandeling van HBs voortaan vertalingen evalueren. De resultaten wijzen op de complexiteit van HB neovascularization en suggereren dat dit gemeenschappelijk formulier angiogenese slechts een aanvullende mechanisme in HB neovascularization is.

Introduction

Hemangioblastomas (HBs) zijn goedaardige vasculaire tumoren die uitsluitend binnen het menselijk zenuwstelsel (CNS) worden gevonden. Zij ontwikkelen bij patiënten met de ziekte van von Hippel-Lindau (VHL) of sporadische laesies. VHL-HBs zijn moeilijk te genezen door middel van de chirurgische behandeling als gevolg van de frequente herhaling en meerdere letsels die het gevolg zijn van deze genetische wanorde¹. Hoewel de inactivering van het VHL tumor suppressor gen is beschouwd als de oorzaak van de tumorigenesis van VHL-HBs, blijven de cytologische oorsprong (met inbegrip van neovascularization) en het evolutieproces van HBs grotendeels controversiële². Dus, een beter begrip van HB-neovascular biologische mechanismen kan voorzien nuttige inzichten in de strategieën van de meest veelbelovende anti-vasculaire VHL-HBs.

Recent onderzoek heeft gesuggereerd dat HB-neovascularization vergelijkbaar met de embryologic vasculogenese^{3,4,5 is}. Klassieke vasculaire endotheliale-groeifactor (VEGF)-gemedieerde angiogenese die afkomstig is van het vasculaire endotheel en die wordt aangestuurd door VHL verlies van functie resulteerde in proliferatie en neovascular formatie, die is⁶uitgedaagd. In 1965, Cancilla en Zimmerman gevonden, met behulp van elektronenmicroscopie, die HBs afkomstig van het endotheel-^{7 zijn}. Later bleek dat stromale cellen zijn afgeleid van vasoformative element⁸. In 1982 vonden Jurco et al. dat stromale cellen van endothelial oorsprong⁹. Dus veronderstelde we dat menselijke vasculaire endotheliale cellen de oorspronkelijke cellen van HB-neovascularization^{10 zijn}. Hoewel het is beter om het gebruik van de primaire culturen uit HB-cellen afgeleid van VHL patiënten chirurgische ingrepen, onze vorige onderzoek aangegeven dat primaire culturen van HB niet stabiel zijn, en cellijnen gevestigde³niet kon worden. Bovendien, de primaire culturen in de 3D-omgeving kunnen niet identificeren de cytologische oorsprong van HB-neovascularization omdat zij de progenitoren van HB-vasculaire ingrediënten^{10,11 omvatten}. Daarom, als een primitieve en klassieke model van endotheliale cellen, kunnen menselijke vasculaire endotheliale cellen (HUVEC) dienen als een alternatief cellulaire model voor HBs.

De gekiemde assay sferoïde is een nieuw model in weefsel engineering^12,13. In deze paper, een 3D collageen gebaseerde coculture systeem in vitro met behulp van de sferoïde kiemen assay werd ontwikkeld, met een algemene doelstelling om te evalueren of klassieke tumor angiogenese in HBs, evenals zijn rol in de HBs bestaat.

Protocol

Deze methode werd uitgevoerd overeenkomstig de goedgekeurde richtsnoeren en voorschriften van het onderzoek ethisch comité van Huashan ziekenhuis, Fudan Universiteit. Bijbehorende standaard veiligheidsmaatregelen werden gevolgd in elke stap. Voor een schematische presentatie, Zie Figuur 1.

1. cel cultuur en plasmide Construct

1. Regelmatig onderhouden de menselijke navelstreng ader endothelial cel (HUVEC) in Dulbecco gewijzigd van Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 100 eenheid/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine in een bevochtigde 5% CO₂ incubator bij 37 ° C.
2. PLKO.1 van de Digest plasmide met ApaI en EcoRI voor de synthese van shRNA fragment. Zorg ervoor dat de volgorde van oligonucleotide van VHL shRNA vector CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG¹⁴.
3. Meng vervolgens 20 µΜ systeem met voorwaartse 5 µL van oligo, 5 µL van omgekeerde oligo, 5 µL van 10 x NEB buffer en 35 µL van ddH₂O samen (het totale volume is 50 µL). Verwarm het mengsel bij 98 ° C gedurende 4 min, en langzaam laat afkoelen tot kamertemperatuur in een paar uur.
4. Het afbinden van de ontharde oligos en PLKO.1 plasmide samen met T4 ligase bij 4 ° C voor overnachting. 16 h later toevoegen 5 µL van afbinding mix in 25 µL bevoegde DH5α cellen. Vervolgens scherm de met succes ligaturen plasmiden, en controleer of het ingevoegde fragment door sequentiebepaling.

2. lentivirus pakket en infectie

1. Meng 10 µg van de PLKO.1-shVHL of PLKO.1-shScramble-vector, 7,5 µg plasmide psPAX2 verpakking en 2,5 µg envelop plasmide pMD2.G in 500 µL van de DMEM media zonder foetale runderserum (FBS) gedurende 25 minuten in totaal.
2. 7 mLDMEM zonder FBS aan de oplossing bereid hierboven toevoegen.
3. Cultuur 293FT cellen in de DMEM zonder FBS in een 10-cm doorsnede weefselkweek gerechten. Zorg ervoor dat het aantal 293FT cellen 1 x 10⁷ met behulp van een cel-teller.
4. Voeg 1 mL van de oplossing bereid boven aan het medium van 293FT cellen voor Transfectie.
   Opmerking: De cellijn 293FT is afgeleid van de cellijn van 293F en stabiel express het SV40 grote T antigeen. Daarom is het een geschikte gastheer voor de productie van de lentivirale.
5. Het kweekmedium vervangen door de DMEM met 10% FBS na 6 uur.
6. De media met behulp van een precisiepipet in 48 h na de Transfectie te verzamelen.
   Opmerking: Het virus bestaat in de DMEM met 10% FBS. De dode cellen drijven op het medium. Steriele membraan van 0,45 µm gebruiken voor het filteren van de dode cellen en onzuiverheden. In het algemeen is er geen behoefte om te controleren van de veelheid van infectie (MOI). Dit is om een stabiele cellen-lijn. Bij de laatste stap, zal alle levende cellen zonder succesvolle infectie sterven door puromycin. De shScramble group en de HUVEC cellen zijn de controlegroep. Zorg ervoor dat alle HUVEC cellen met de concentratie van de gebruikte puromycin door 72 h sterven. Elke goed heeft hetzelfde aantal cellen.
7. Cultuur van de HUVEC cellen in de lentivirale media voor 72 uur. Dan, voeg puromycin aan de media van de HUVEC cellen in een concentratie van 2 µg/mL voor 24 h. gebruik HUVEC cellen zonder behandeling als de controlegroep. Ervoor zorgen dat alle controle cellen sterven door deze tijd.
   Opmerking: De levende cellen, vormen een stabiele cellijn van VHL vechtpartij cellen en shSramble cellen. De plating-dichtheid is 5.000 per putje in 96-wells-platen.

3. productie van Endothelial cel spheroïden

1. Trypsinize van de HUVECs cellen en resuspendeer in het medium van de DMEM met 10% FBS. Met een matig aantal cellen in een schaal 10-cm cultuur, voeg 1 mL typsin-EDTA.
2. Het zaad van de cellen in een 3D ronde-96-Wells bodemplaat, bij een celdichtheid van 1 × 10³ cellen per putje. Gebruik een goed geschikt voor een sferoïde van 0,50 µL op te schorten de sferoïde. Cellen tellen met behulp van een cel teller systeem volgens de instructies van de fabrikant.
3. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO₂ voortdurend voor 72 uur. Zorg ervoor dat de zwevende cellen de spheroïden cel automatisch vormen onder deze omstandigheden. Vervang de helft van het kweekmedium na 36 h.

4. in vitro angiogenese Assay

1. Ontdooi de gel-oplossing bij 4 ° C en Verdun het met het medium van de verminderde serum met een onderlinge verdunningsverhouding 1:5.
2. De spheroïden van het DMEM-kweekmedium met een micropipet te zuigen. Na het wassen schorsen de spheroïden met 5 mL van de verminderde serum medium, de spheroïden zachtjes en voorzichtig in de verdunde gel. Ervoor zorgen dat er geen luchtbellen.
3. 300 µL van gemengde vloeistof in een 15-well-plate insluiten. Na incubatie bij 37 ° C en 5% CO₂ voor 1 h, toevoegen 400 µL het verminderde serum medium aan elk putje. Het vullen van steriel water rond de putten voor het genereren van een bevochtigde omgeving om verdamping in de weg staan.
4. Daarna cultuur de plaat bij 37 ° C in 5% CO₂ op 100% vochtigheid gedurende 1 uur.
5. Zorgvuldig de oud medium gecombineerd en vervang deze door 600 µL van verminderde serum medium met 1% endothelial cel groei supplementen in elk putje.
6. Na 12 h of 24 h, nemen beelden onder een omgekeerde licht microscope (40 *).

5. de gegevensanalyse

1. De afbeeldingen uploaden naar een online imago analyse platform om het verkrijgen van gegevens van de lengte van de stronk (Tabel van materialen).
2. Maak een account per e-mail op de webpagina.
3. Vervolgens uploaden de beelden door te klikken op de knop ' uploaden '.
4. Download het resultaat door te klikken op de downloadknop.
   Opmerking: De software genereert u de bewerkte afbeelding en de gegevens. De gegevens bevatten vijf delen: cumulatieve sprout lengte, gemiddelde sprout de lengte, de standaarddeviatie van sprout lengte, sprout gebied en sferoïde gebied. In het verwerkte beeld, wordt elke parameter beschreven in een andere kleur te verlichten identificatie in de bewerkte afbeelding: rode vertegenwoordigt spruiten skelet, het aantal spruiten geel, blauw de stronk structuur, witte stronk einde en oranje sferoïde.

Results

Originele beelden zijn genomen door omgekeerde lichte Microscoop. De typische beelden van de controlegroep en de groep VHL zijn afgebeeld in Figuur 2-A1 en Figuur 2-A2. De gekiemde lengte van de controlegroep is korter dan die van de VHL-groep.

Na het uploaden van de beelden, biedt het online platform rechtstreeks analyseresultaten. De ...

Discussion

Meerdere velden van vasculaire biologie onderzoek werden onlangs, gestimuleerd door de studie van de angiogenic endotheel¹⁵. In dit artikel, ontwikkelden we een endothelial sferoïde kiemen techniek als een experimenteel model om te bestuderen van de vorming van het vaartuig dat afkomstig van het VHL-gen verlies van functie in gemanipuleerde endotheliale cellen is te identificeren van nieuwe kandidaat-moleculen van de angiogenic cascade. Tot de beste van onze kennis is dit het eerste verslag het an...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
human umbilical vein endothelial cell	Fudan IBS Cell Center	FDCC-HXN180
dulbecco’s modified eagle’s medium	Gibco	11995040
fetal bovine serum	Gibco	26400044
PLKO.1-puro vector	Addgene	#8453
packing plasmid psPAX2	Addgene	#12260
envelope plasmid pMD2.G	Addgene	#12259
3D round-bottom 96-well plates	S-Bio	MS-9096M
matrigel	BD Biosciences	354234
Opti-MEM medium	Gibco	31985-070	reduced serum medium
15-well plate	Ibidi	81501	Luchtbellen in de gel kunnen worden verminderd door de μ–Slide angiogenesis voor gebruik de nacht ervoor in de incubator te plaatsen
endothelial cell growth supplements	Sciencell	#1052
10-cm culture dish	Corning	Scipu000813
Puromycin	Gibco	A1113802
typsin-EDTA	Gibco	25200056
Automated Cell Counter System	BioTech
Image Analysis software	Winmasis		http://mywim.wimasis.com