Een snel zilver kleuring Protocol inschakelen eenvoudig en efficiënte detectie van SSR markeringen met behulp van een niet-denaturering Polyacrylamide-Gel

Samenvatting

Wij rapporteren hier een eenvoudige en goedkope silver kleuring protocol dat vereist slechts drie reagentia en 7 min van verwerking, en is geschikt voor snelle generatie voor kwalitatief hoogwaardige SSR data in de genetische analyse.

Samenvatting

Eenvoudige opeenvolging herhaalt (SSR) is één van de meest effectieve markers in plantaardige en dierlijke genetische onderzoek en moleculaire veredeling programma's gebruikt. Zilveren kleuring is een veel gebruikte methode voor het detecteren van SSR merkers in een polyacrylamide-gel. Conventionele protocollen voor Zilveren kleuring zijn echter technisch veeleisende en tijdrovende. Net als veel andere biologische laboratorium zijn technieken, zilveren kleuring protocollen gestaag geoptimaliseerd om detectie efficiëntie te verbeteren. Wij rapporteren hier een vereenvoudigde silver kleuring methode die aanzienlijk vermindert reagens kosten en verbetert de opsporing resolutie en afbeelding duidelijkheid. De nieuwe methode vereist twee hoofdstappen (bevruchting en ontwikkeling) en drie reagentia (zilvernitraat, natriumhydroxide en formaldehyde) en slechts 7 min van verwerking voor een niet-denaturering polyacrylamide-gel. Vergeleken met de eerder gemelde protocollen, deze nieuwe methode is gemakkelijker, sneller en gebruikt minder chemische reagentia voor SSR detectie. Deze eenvoudige, goedkope en effectieve zilver kleuring protocol profiteert dus, genetische kartering en marker-assisted breeding door een snelle generatie van SSR marker gegevens.

Inleiding

De ontwikkeling van PCR-gebaseerde markers heeft een revolutie teweeggebracht in de wetenschap van plantengenetica en fokken¹. Eenvoudige opeenvolging herhaalt (SSR) markeringen behoren tot de meest gebruikte en meest veelzijdige DNA-merkers. Hun brede genoom dekking, overvloed, genoom specificiteit en herhaalbaarheid zijn enkele van de verdiensten van SSR markeringen naast hun codominant erfenis voor de detectie van heterozygoot genotypen². Verschillende studies hebben SSR markeringen gebruikt om te onderzoeken van genetische diversiteit, bijhouden van afkomst, genetische koppeling kaarten bouwen, en genen voor economisch belangrijke traits^3,4.

PCR producten van SSR markers worden vaak gescheiden met behulp van agarose of polyacrylamide-gel-elektroforese en vervolgens gevisualiseerd met zilveren kleuring of onder UV-licht na kleuring met ethidiumbromide. Zilveren kleuring van DNA fragmenten in polyacrylamide gels is gevoeliger dan het andere kleuring methoden^5,6 en is wijd verbeid gebruikt om DNA-fragmenten zoals SSR markeringen⁷detecteren.

Zoals vele biologische laboratoriumtechnieken verbeterd zilveren kleuring van polyacrylamide gels gestaag is sinds haar eerste worden gerapporteerd als een fragment visualisatie techniek in 1979⁸. De techniek werd in eerste instantie voor de opsporing van DNA-fragmenten gewijzigd door Bassam et al. ⁶ in 1991 en vervolgens verbeterd door Sanguinetti en collega's⁹ in 1994. De methode heeft verder geoptimaliseerd in de laatste paar decennia^{6,7,9,10,11,12,13,14 , 15}. de meeste van deze bijgewerkte versies van de protocollen hebben echter nog steeds enkele nadelen zoals hoge technische vraag en lange verwerkingstijd voor fixatie en montage⁶, die de toepassing van deze protocollen^{7beperken, 11}. Een optimale protocol dat goedkope met een hoog rendement van DNA fragment detectie combineert is dringend nodig voor routinematige toepassing van zilver kleuring in biologisch onderzoek.

Daarnaast polyacrylamidegel kan worden onderverdeeld in denatureren en niet-denaturering polyacrylamide gels en allebei kunnen worden gebruikt voor het detecteren van merkers van de SSR met behulp van de methode kleuring zilver. Het effect en de resolutie die niet aanzienlijk van elkaar verschillen, maar niet-denaturering polyacrylamide gels zijn gemakkelijker te proces en nemen minder tijd¹⁶.

Op basis van het vorige onderzoek¹⁵is het doel van de huidige studie om te beschrijven van een geoptimaliseerde zilver protocol in detail voor snelle, gemakkelijke en goedkope detecteren van SSR merkers in een niet-denaturering polyacrylamidegel kleuring.

Protocol

1. bereiding van PCR producten van SSR Markers

1. Alle chemische stoffen en reagentia voorbereiden met PCR reacties, met inbegrip van sjabloon DNA (30 ng/µL), 2 × PCR master mix (met 2 × PCR buffer, 0,4 mM voor elke dNTP, 3 mM van MgCl₂, 0.1 U/µL van de polymerase van DNA Taq en kleurstoffen), 10 µM van elk vooruit en achteruit inleidingen , en gedestilleerd of gedeïoniseerd water (dH₂van O).
   Opmerking: De markeringen van de SSR gebruikt in de huidige studie werden PT51333 (toekomen primer volgorde: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' en omgekeerde primer volgorde: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') en PT50903 (toekomen primer volgorde: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' en omkeren van de volgorde van de primer: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') voor tabak en CX-43 (toekomen primer volgorde: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' en reverse primer volgorde: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') en CX-157 (toekomen primer volgorde: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' en het omkeren van de volgorde van de primer: 5 '- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') voor bloeiende Chinese kool.
2. Versterking 10 µL van het PCR-mix voorbereiden door toevoeging van 2 µL van sjabloon DNA, 5 µL van 2 × PCR master mix, 0.2 µL van elke voorwaartse primer en omgekeerde primer en 2.6 µL dH₂O.
3. Uitvoeren van PCR versterking reactie in een thermocycler met een eerste stap van 94 ° C gedurende 5 minuten, te volgen door 38 cycli van 45 bij 94 ° C voor denaturatie, 45 s s bij 55 ° C voor primer gloeien en 1 min bij 72 ° C voor uitbreiding, en een stap van de uiteindelijke uitbreiding van 10 minuten bij 72 ° C; Sla PCR producten bij 4 ° C voor later gebruik.

2. voorbereiding van de oplossingen van Polyacrylamide Gels gieten

1. 1 L 5 × TBE buffer bereiden door ontbinding van 54 g Tris basis en 27.5 g boorzuur in dH,₂O, het toevoegen van 20 mL EDTA 0.5 M (pH 8.0) en het aanpassen van de oplossing voor een eindvolume van 1 000 mL met dH₂O.
   Opmerking: TBE buffer kan worden opgeslagen op kamertemperatuur voor maanden.
2. 2 L van 0,5 × TBE buffer door toevoeging van 200 mL 5 × TBE buffer dH₂O tot een eindvolume van 2 L bereiden en bewaren bij kamertemperatuur.
3. Bereid een 6% niet-denaturering polyacrylamidegel oplossing door ontbinding 29 g van moleculaire biologie rang acrylamide en 1 g van moleculaire biologie rang N, N'-methylenebisacrylamide in 0,5 × TBE buffer tot een eindvolume van 500 mL. Betrekking hebben op de fles van de oplossing met aluminiumfolie en bewaren bij 4 ° C voor later gebruik.
   Let op: Acrylamide wordt beschouwd als een krachtig neurotoxine en moet met zorg worden behandeld. Draag altijd handschoenen wanneer wegend poeder en behandeling oplossingen bevatten.
4. Bereid een 20% ammoniumnitraat persulfate (APS)-oplossing door het oplossen van 2 g van APS met dH₂O tot een eindvolume van 10 mL. Het kan worden opgeslagen bij-20 ° C voor maanden.
   Opmerking: Voor het gemak, 10 mL 20% APS oplossing kan worden aliquoted in 1,5 mL of 2 mL centrifuge buizen voor opslag bij-20 ° C. Ontdooien en meng goed vóór gebruik.
5. Bereid een verdunde bind-silane-oplossing door het oplossen van 3 µL van bind-silane in 0.997 mL 95% ethanol bevattende 0,5 of meer gewichtspercenten azijnzuur. Het kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor weken.
   Let op: Bind-silane is giftig, Draag handschoenen bij het verwerken van de oplossing en geventileerde kamer houden.

3. bereiding van Polyacrylamide Gels voor elektroforese

1. Een set van glazen platen en afstandhouders met wasmiddel wassen in leidingwater, gevolgd door een volledige spoelen met dH₂O. Air droog de platen door ze in een bord Droogrek.
2. 1 mL van bind-silane oplossing op de binnenzijde van een rechthoekige glasplaat, en droog zijn voor 5 min te verspreiden.
   Opmerking: Als de bind-silane oplossing is niet gelijkmatig verspreid over het oppervlak van de plaat, de gel kan worden losgemaakt tijdens kleuring en leiden tot een onbevredigende verkleurende effect.
3. Verspreiden van 1 mL af te weren-silane op de binnenzijde van een ingekeepte glasplaat met een doekje, veeg overtollige afstoten-silane met papieren zakdoekje, en lucht droog voor 5 min.
   Opmerking: Als het weer-silane doet de oppervlakte van de glasplaat niet uniform jas, het kan schade aan de gel door het gedeeltelijk strippen.
4. Monteren van de glazen platen met afstandhouders met de ingekeepte plaat op bovenkant en klem van beide zijden van de vergadering met het gieten van klemmen.
5. Giet passende hoeveelheid (40 mL) 6% niet-denaturering polyacrylamidegel oplossing in een bekerglas voor de plaat set met 33 cm breedte × 10 cm hoogte en spacer dikte van 1,5 mm, Voeg 20 µL van tetramethylethylenediamine (TEMED) en 200 µLfresh 20% APS en meng voorzichtig.
   Opmerking: De juiste hoeveelheid (40 mL) gel oplossing was berekend op basis van de binnenste omvang van de twee platen met een dikte van afstandhouders (30 cm x 8,5 cm × 0,15 cm). Wat betreft de hoeveelheid TEMED en APS voor gel polymerisatie is er een standaard verhouding van gel oplossing voor TEMED en APS gebaseerd op de referentie-¹⁷. De gel-oplossing hierboven beschreven wordt opgeslagen bij 4° C. Als gel oplossing is bewaard bij kamertemperatuur, 20 µL van TEMED en 100 µL van 20% APS moet worden gebruikt. Zachtjes roer het mengsel van gel oplossing met een glas stok om luchtbellen in de oplossing.
6. Giet de oplossing onmiddellijk en zorgvuldig in de gemonteerde glazen platen langs de rand van de ingekeepte plaat, vullen de ruimte bijna naar de top en voeg de kam. Voeg een kleine hoeveelheid gel oplossing over de kam.
   Opmerking: Houd de glasplaten horizontale om te voorkomen dat de gel lekt. Verwijder alle bubbels met een zeepbel haak, indien nodig.
7. Laat de gel om in te stellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   Opmerking: De tijd voor de polymerisatie kan veranderen met temperaturen van gel oplossing en milieu.
8. Nadat de gel volledig polymerisatie is, verwijder de gieten-klemmen en positie van de collectie van de plaat in de elektroforese tank eenheid met de ingekeepte plaat naar de richting van het bovenste buffer reservoir, en gebruik grote klemmen te koppelen van de plaat ingesteld op de tank-eenheid.
9. Giet 1 L van 0,5 × TBE buffer in elk van de bovenste en de onderste kamers. Verwijder de kam en al de putten, spoel met buffer met behulp van een pipet of injectiespuit.
   Opmerking: Zorg ervoor dat de gel sandwich aan de onderkant van de plaat volledig is gedrenkt in buffer zonder alle bubbels.

4. running Gels

1. Ongeveer 1 µL van het PCR-product in elk putje van de polyacrylamidegel laden. Het laden van een ladder grootte DNA aan beide zijden van de gel samen met monsters van PCR producten. De dekking van de veiligheid vast aan de bovenste buffer kamer.
2. De leads verbinden met de voeding, de gekleurde bijpassende rood voor rood en zwart naar zwart. De gel wordt op een constante spanning van 110 V uitvoeren totdat de kleurstof een bepaald standpunt, gewoonlijk voor ~ 70 min bereikt.
   Opmerking: De spanning en de lopende tijd kan worden aangepast volgens de grootte van de PCR producten.

5. silver kleuring voor het opsporen van SSR markeringen in een niet-Polyacrylamide-Gel

1. Na elektroforese, afvoer van de buffer van de bovenste kamer in een groot bekerglas via het ventiel. Loskoppelen van de klemmen van de kant, de platen uit het apparaat verwijderen, zorgvuldig de ingekeepte glasplaat langs één kant te scheiden met een spatel en ervoor te zorgen dat de gel blijft gekoppeld aan de andere glasplaat bekleed met bind silane.
2. Vul 1 liter van verse impregnatie oplossing door ontbinding van 1.5 g van AgNO₃ in 1 L dH₂O. bereiden 1 L van verse ontwikkeling oplossing door ontbinding van 10 g NaOH in dH₂O 900 mL, voeg 1 mL van 37% formaldehyde , en aan te passen aan een eindvolume van 1 L met behulp van dH₂O.
   Opmerking: Draag handschoenen en de bovenstaande chemicaliën en oplossingen met zorg behandelen. Het is niet nodig om te houden van de oplossingen en de bijbehorende stappen met de oplossingen in het donker.
3. Spoel zorgvuldig de gel en glas plaat met ruime dH₂O te verwijderen van de elektroforese buffer, dan plaatst u de plaat met de gel naar boven op een kunststof dienblad en dompelen de gel in 1 L van bevruchting oplossing. De lade zetten in een shaker.
4. Schud de lade voorzichtig op 60 r/min gedurende 3-4 minuten.
   Opmerking: Schudden van de tijd kan worden aangepast volgens de dikte van de gel en de concentratie van zilvernitraat in de impregnatie-oplossing.
5. Verplaatsen van de plaat uit impregnatie oplossing en zet het op een andere lade. Spoel de oplossing van de resterende impregnatie af van het oppervlak van de plaat en de ruime dH₂O tweemaal voor elke 3-5 s met gel.
6. De plaat met de gel naar boven op een andere lade plaatsen, onderdompelen van de plaat in 1 liter oplossing van de gegevensbestandontwikkeling, dan schudden van de lade voorzichtig bij 50 r/min voor ~ 3 min. Monitor de vormgeving van DNA fragmenten en de hoogste verhouding van het signaal van DNA fragmenten ontwikkeling vastloopt aan het lawaai van de achtergrond wordt waargenomen (deze stap duurt ~ 3 min).
7. Spoel de plaat en de gel met ruime dH₂O tweemaal, en droog de gel-plaat met een papieren zakdoekje.
8. Scan de gel met behulp van een geschikte scanner. Een resolutie van 300 dpi geeft een duidelijke visualisatie van DNA-fragmenten. De gel kan ook worden gefotografeerd met behulp van een camera.
9. De banding patroon van SSR markers kan worden gescoord gebaseerd op de DNA-fragmenten in de afbeelding.

Resultaten

De PCR waarbij werden geproduceerd met behulp van de bijbehorende SSR primerparen bloeiende Chinese kool en tabak. Na elektroforese, waren de gels van polyacrylamide gekleurd met behulp van de bovenstaande zilver kleuring protocol, dat ondubbelzinnig de banding patronen van SSR markers (Figuur 1 ontdekt).

Om te vergelijken de efficiëntie van de detectie van verschillende zilver kleuring van protocol...

Discussie

Het wassen van gel na bevruchting is een cruciale stap. Onvoldoende wassen tijd en water volume kan leiden tot de onvolledige verwijdering van bevruchting oplossing op het oppervlak van de plaat en de gel, en resulteren in een donkere achtergrond. De passende ontwikkeling tijd is een andere belangrijke stap, overmatige ontwikkeling kan resulteren in een donker-bruine achtergrond met laag contrast foto van DNA-fragmenten. Bovendien heeft de bevruchting stap aanzienlijk invloed op kleuring efficiëntie van DNA-fragmenten. H...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
PCR master mix (Green Taq Mix)	Vazyme Biotech Co. Ltd, China	#P131-03
50-2000 bp DNA Ladder	Bio-Rad, USA	#170-8200
DL500 DNA marker	Takara Bio Inc., Japan	#3590A
Tris base	Sangon Biotech Shanghai, China	#77-86-1
Boric acid	Sangon Biotech Shanghai, China	#10043-35-3
EDTA-Na2	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#6381-92-6
Acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#79-06-1
N,N'-methylene-bis-acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-26-9
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-18-9
Ammonium persulfate	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7727-54-0
Bind-silane	Solarbio Beijing, China	#B8150
AgNO3	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#7761-88-8
Formaldehyde	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#50-00-0
NaOH	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#1310-73-2
Acetic acid	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-19-7
Na2CO3	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#497-19-8
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-17-5
HNO3	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7697-37-2
Na2S2O3.5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#10102-17-7
Eriochrome black T(EBT)	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#1787-61-7
Plastic tray	Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China	-
TS-1 Shaker	Qilinbeter JiangSu, China	-
BenQ M800 Scanner	BenQ, China	-
DYY-6C Power supply	Beijing Liuyi Instrument Factory, China	-
High throughout vertical gel systems, JY-SCZF	Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China	-