Een snel zilver kleuring Protocol inschakelen eenvoudig en efficiënte detectie van SSR markeringen met behulp van een niet-denaturering Polyacrylamide-Gel

Summary

Wij rapporteren hier een eenvoudige en goedkope silver kleuring protocol dat vereist slechts drie reagentia en 7 min van verwerking, en is geschikt voor snelle generatie voor kwalitatief hoogwaardige SSR data in de genetische analyse.

Abstract

Eenvoudige opeenvolging herhaalt (SSR) is één van de meest effectieve markers in plantaardige en dierlijke genetische onderzoek en moleculaire veredeling programma's gebruikt. Zilveren kleuring is een veel gebruikte methode voor het detecteren van SSR merkers in een polyacrylamide-gel. Conventionele protocollen voor Zilveren kleuring zijn echter technisch veeleisende en tijdrovende. Net als veel andere biologische laboratorium zijn technieken, zilveren kleuring protocollen gestaag geoptimaliseerd om detectie efficiëntie te verbeteren. Wij rapporteren hier een vereenvoudigde silver kleuring methode die aanzienlijk vermindert reagens kosten en verbetert de opsporing resolutie en afbeelding duidelijkheid. De nieuwe methode vereist twee hoofdstappen (bevruchting en ontwikkeling) en drie reagentia (zilvernitraat, natriumhydroxide en formaldehyde) en slechts 7 min van verwerking voor een niet-denaturering polyacrylamide-gel. Vergeleken met de eerder gemelde protocollen, deze nieuwe methode is gemakkelijker, sneller en gebruikt minder chemische reagentia voor SSR detectie. Deze eenvoudige, goedkope en effectieve zilver kleuring protocol profiteert dus, genetische kartering en marker-assisted breeding door een snelle generatie van SSR marker gegevens.

Introduction

De ontwikkeling van PCR-gebaseerde markers heeft een revolutie teweeggebracht in de wetenschap van plantengenetica en fokken¹. Eenvoudige opeenvolging herhaalt (SSR) markeringen behoren tot de meest gebruikte en meest veelzijdige DNA-merkers. Hun brede genoom dekking, overvloed, genoom specificiteit en herhaalbaarheid zijn enkele van de verdiensten van SSR markeringen naast hun codominant erfenis voor de detectie van heterozygoot genotypen². Verschillende studies hebben SSR markeringen gebruikt om te onderzoeken van genetische diversiteit, bijhouden van afkomst, genetische koppeling kaarten bouwen, en genen voor economis....

Protocol

1. bereiding van PCR producten van SSR Markers

1. Alle chemische stoffen en reagentia voorbereiden met PCR reacties, met inbegrip van sjabloon DNA (30 ng/µL), 2 × PCR master mix (met 2 × PCR buffer, 0,4 mM voor elke dNTP, 3 mM van MgCl₂, 0.1 U/µL van de polymerase van DNA Taq en kleurstoffen), 10 µM van elk vooruit en achteruit inleidingen , en gedestilleerd of gedeïoniseerd water (dH₂van O).
   Opmerking: De markeringen van de SSR gebruikt in de huidige studie werden PT51333 (toekomen primer volgorde: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' en omgekeerde primer volgorde: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') en PT50903 (toekomen primer volgorde: 5....

Results

De PCR waarbij werden geproduceerd met behulp van de bijbehorende SSR primerparen bloeiende Chinese kool en tabak. Na elektroforese, waren de gels van polyacrylamide gekleurd met behulp van de bovenstaande zilver kleuring protocol, dat ondubbelzinnig de banding patronen van SSR markers (Figuur 1 ontdekt).

Om te vergelijken de efficiëntie van de detectie van verschillende zilver kleuring van protocol.......

Discussion

Het wassen van gel na bevruchting is een cruciale stap. Onvoldoende wassen tijd en water volume kan leiden tot de onvolledige verwijdering van bevruchting oplossing op het oppervlak van de plaat en de gel, en resulteren in een donkere achtergrond. De passende ontwikkeling tijd is een andere belangrijke stap, overmatige ontwikkeling kan resulteren in een donker-bruine achtergrond met laag contrast foto van DNA-fragmenten. Bovendien heeft de bevruchting stap aanzienlijk invloed op kleuring efficiëntie van DNA-fragmenten. H.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR master mix (Green Taq Mix)	Vazyme Biotech Co. Ltd, China	#P131-03
50-2000 bp DNA Ladder	Bio-Rad, USA	#170-8200
DL500 DNA marker	Takara Bio Inc., Japan	#3590A
Tris base	Sangon Biotech Shanghai, China	#77-86-1
Boric acid	Sangon Biotech Shanghai, China	#10043-35-3
EDTA-Na2	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#6381-92-6
Acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#79-06-1
N,N'-methylene-bis-acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-26-9
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-18-9
Ammonium persulfate	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7727-54-0
Bind-silane	Solarbio Beijing, China	#B8150
AgNO3	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#7761-88-8
Formaldehyde	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#50-00-0
NaOH	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#1310-73-2
Acetic acid	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-19-7
Na2CO3	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#497-19-8
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-17-5
HNO3	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7697-37-2
Na2S2O3.5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#10102-17-7
Eriochrome black T(EBT)	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#1787-61-7
Plastic tray	Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China	-
TS-1 Shaker	Qilinbeter JiangSu, China	-
BenQ M800 Scanner	BenQ, China	-
DYY-6C Power supply	Beijing Liuyi Instrument Factory, China	-
High throughout vertical gel systems, JY-SCZF	Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China	-