Verzameling en verwerking van lymfklieren uit grote dieren RNA p.a.: lymfeklier Transcriptomic Studies van grote diersoorten voorbereiden

Samenvatting

Dit protocol biedt een overzicht van de procedures voor de isolatie van RNA voor de profilering van de transcriptomic van de lymfeklier weefsels van grote dieren, met inbegrip van de stappen in de identificatie en de besnijdenis van lymfeklieren van vee en wilde dieren, bemonstering benaderingen te leveren consistentie in meerdere dieren, en overwegingen plus representatieve resultaten voor de post collectie bewaring en verwerking ten behoeve van RNA analyse.

Samenvatting

Grote dieren (vee en wild) dienen als belangrijk reservoirs van zoönotische pathogenen, met inbegrip van Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonellaen E. coli, en zijn nuttig voor de studie van de pathogenese en/of verspreiding van de bacteriën in natuurlijke gastheren. Met de belangrijkste functie van de lymfklieren in de immuunrespons van de gastheer dienen lymfeklier weefsels als een potentiële bron van RNA voor downstream transcriptomic analyses, teneinde de tijdelijke wijzigingen in genexpressie in cellen in de loop van een infectie. Dit artikel geeft een overzicht van het proces van de lymfeklier collectie, bemonstering van weefsel en downstream RNA verwerking in vee, van runderen (Bos taurus) als een model, met extra voorbeelden van de Amerikaanse bison (Bison bison ). Het protocol bevat informatie over de locatie, identificatie en verwijdering van lymfeklieren van meerdere belangrijke plaatsen in het lichaam. Bovendien wordt een biopsie bemonsteringsmethode gepresenteerd dat voorziet in een consistentie van bemonstering over meerdere dieren. Verscheidene overwegingen voor behoud van de steekproef worden besproken, met inbegrip van de generatie van RNA geschikt voor downstream methodologieën zoals RNA-sequencing en RT-PCR. Vanwege de lange vertragingen die inherent zijn aan grote dierlijke vs. muis tijd cursus studies, worden representatieve resultaten van bison en boviene lymfeklier weefsels voorgesteld om te beschrijven van het tijdsverloop van de degradatie in dit weefseltype, in het kader van een herziening van vorige methodologische werkzaamheden op aantasting van het RNA in andere weefsels. Over het geheel genomen zal dit protocol nuttig aan beide veterinaire onderzoekers beginnen transcriptome projecten op grote dieren monsters en moleculaire biologen geïnteresseerd in het leren van technieken voor in vivo weefsel bemonstering en in vitro verwerking zijn.

Inleiding

RNA-sequencing analyse van transcriptome lymfklieren biedt de mogelijkheid om het karakteriseren van de immuunrespons van dieren aan een verscheidenheid van pathogenen. Terwijl deze methodologie is gebruikt uitgebreid in muizen, analyses hebben onlangs geweest zich uitbreiden naar grotere zoogdieren^1,2. Dieren/grote dierlijke lymfeklieren kan worden gebruikt voor het karakteriseren van host reacties op een infectie, niet alleen voor hun gebruik in het vaccin of genetische studies en voor de identificatie van doelen voor Geneesmiddelenontwikkeling, maar ook als modelsystemen voor menselijke studies op zoönotische ziekten. Bijvoorbeeld in het geval van brucellose (een zoönotische bacteriële ziekte dat effecten een half miljoen mensen over de hele wereld elk jaar), ondanks aanzienlijk hogere kosten, studies in schapen of geiten meer relevant zijn voor de menselijke infectie en menselijk vaccin ontwikkeling dan laboratorium diermodellen. Infectie Muismodellen recapituleren de reticuloendotheliaal systeem infectie maar niet de karakteristieke klinische symptomen³_.

In grote dierproeven ten opzichte van dierproeven laboratorium bestaat het proces van weefsel oogsten noodzakelijkerwijs uit een langere vertraging tussen de euthanasie en de weefsel-collectie, die een potentiële uitdaging voor het behoud van kwalitatief hoogwaardige RNA. Intact RNA is essentieel voor de generatie van biologisch relevante transcriptomic gegevens. De generatie van kwalitatief hoogwaardige RNA van weefselmonsters is bijzonder kritisch voor grote dieren pathogen studies uitgevoerd in insluiting faciliteiten. Dergelijke studies zijn inherent moeilijker uit te voeren zoals ze niet alleen goedgekeurde voorzieningen en hoogst opgeleid personeel vereisen, maar ook aanzienlijke financiële kosten, die, afhankelijk van het werk voeren, van tientallen tot honderden duizenden dollars variëren kunnen. Deze soorten studies ook betrekking hebben op een interdisciplinaire samenwerking en multidisciplinaire kennis ten behoeve van hun voltooiing, toe te voegen aan hun complexiteit. Daarom, training op, ontwikkeling van en aanhankelijkheid aan een gestroomlijnd systeem voor de sample collectie en het behoud biedt aanzienlijke voordelen voor downstream moleculaire studies van weefsels van besmette dieren.

De collectie van grotere lymfklieren presenteert extra uitdagingen voor de collectie van weefsel ten opzichte van de vergelijkbare bemonstering van lymfkliertest lymfklieren. De voorbereiding voor de steekproef besnijdenis vereist een basiskennis van de anatomie van de lymfeklier, met inbegrip van de relevante interne structuren. De structuur van een lymfeklier bestaat uit lymfoïde melkklieren omgeven door sinussen gevuld met lymfe. Deze structuren zijn ingesloten in een harde, vezelige capsule. ⁴ een lymfoïde lobule is de "fundamentele anatomische en functionele eenheid van de lymfeklier" en bestaat uit een diep corticale eenheid, en Wallenberg koorden, follikels en sinussen⁴ (figuur 1A). B en T-lymfocyten zijn de thuisbasis van de follikels en diep corticale eenheden, respectievelijk. Deze structuren bieden een 3D steiger en faciliteren van de interactie tussen de lymfocyten en antigeen of antigeen presentatie van cellen.

Grove, follikels en diep corticale eenheden kunnen worden geïdentificeerd op het snijvlak geconstateerd als ze een dichtere reticulaire gevlochten bevatten en donkerder dan de sinussen, die bestaan uit een meer delicate reticulaire gevlochten en lichter weergegeven (figuur 1B). Door conventie verwijzen pathologen naar de regio's van de lymfeknopen zoals de oppervlakkige cortex (follikels), de paracortex (diep corticale eenheden) en de medulla (Wallenberg koorden en sinussen). Een nauwkeurig onderzoek van de drie gewesten werd geacht als beste praktijk routine pathologisch onderzoek richtsnoeren voor lymfklieren⁵. Merk op dat er een aanzienlijke variatie in de consistentie, grootte en kleur van de lymfeknopen, zelfs binnen een enkel dier. Naarmate de dieren ouder, hun lymfklieren zal meestal kleiner en worden steviger dan die van jongere dieren, meestal als gevolg van een toename van hun bindweefsel en een vermindering van de normale lymfoïde structuur^6,7.

Figuur 1. Anatomie van de lymfeklier. (A) deze cartoon afbeelding toont de anatomie van de lymfeklier, beeltenis van belangrijke structuren. (B) dit nog beeld toont een boviene lymfeklier gesneden in doorsnede. De relevante structuren/lagen die zichtbaar met het blote oog zijn worden gemarkeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Afhankelijk van de experimentele vraag zullen verschillende lymfklieren van belang zijn voor het verzamelen en analyseren. Perifere lymfklieren zijn gelegen diep in het onderhuidse weefsel. Bij runderen, perifere of oppervlakkige lymfklieren vaak gebruikt in de klinische en experimentele praktijk omvatten parotide, submandibulaire retrofaryngeale, prescapulares, prefemoral (precrural) en de oppervlakkige inguïnale (uier worden bij vrouwtjes, scrotum bij mannen) () Figuur 2). In tabel 1, worden de eigenschappen van de belangrijkste oppervlakkige lymfklieren, zoals beschreven in de vee-systeem⁸, schetste. Hieronder worden enkele potentiële lymfeklier collectie plannen voor bacteriële infectieziekten van runderen gepresenteerd als een uitgangspunt voor het onderzoek.

Brucella abortus/Brucella melitensis: standaard necropsies voor B. abortus-besmet vee en B. melitensis-besmette geiten aan het National dier ziekte Center herstellen uier worden, prescapular en oorspeeksellymfklieren lymfeklier weefsel , zowel voor het slijpen voor de bacteriële opsomming alsmede voor de bereiding van het RNA voor de host RNA expressie profilering. B. abortus kunnen regelmatig worden hersteld in elk van deze lymfeklieren in experimenteel geïnfecteerde runderen⁹_. De aanwezigheid van bacteriën in elk van deze typen lymfeklier kan worden opgespoord in B. melitensis-besmet geiten tot ten minste negen maanden na infectie met behulp van de methoden voor RNA gebaseerde uit onze studies (Boggiatto et al., onuitgegeven). Salmonella sp.: de prescapular, subiliac (prefemorale), en de mesenterische lymfklieren zinvol zijn geweest tijdens de profilering van runderkarkassen voor een Salmonella prevalentie^10,11,12 en zou van potentieel belang voor transcriptomic studies. E. coli O157:H7: mesenterische lymfklieren (op de middelste dunne darm en distale dunne darm locaties) kunnen de sites van een occasionele herstel van de bacteriën in geïnfecteerde kalveren (maar niet in geïnfecteerde volwassen runderen)¹³. Leptospirose (Leptospira sp.): een chronische persistentie van de bacteriën is waargenomen in de lymfeknopen aftappen van de melkklier¹⁴. Mycobacterium bovis : Bij runderen, zijn de bacteriën herstelde na experimentele infectie van de lymfeknopen mediastinale en tracheobronchial van kalveren¹⁵geweest. Bovendien is lymfeklier RNA te onderzoeken dieren talloze reacties op virussen, zoals de varkens reproductieve en respiratoir syndroom virus²gebruikt. Figuur 2 toont de locatie van een subset van deze grote lymfeklieren in het lichaam van vee.

Figuur 2: Cartoon beeltenis van geselecteerde lymfeklier locaties in Bos taurus . De genummerde lymfeklieren zijn geannoteerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

In dit document en de bijbehorende video presenteren wij een protocol voor de isolatie van grote dieren lymfklieren voor RNA studies, ontworpen als informatief voor moleculaire biologen die betrokken zijn bij transcriptomic studies van grote dierlijke infecties. Eerst, wij bieden een overzicht van de isolatie-procedure voor de lymfeknopen, met behulp van bemonstering van weefsels van runderen en bison als voorbeelden. Gekoppeld aan deze demonstratie, zoals weergegeven in de video, is een werkstroom voor een reproduceerbare weefsel bemonstering voor RNA isolatie. Vervolgens beschrijven we belangrijke overwegingen voor de verwerking van een geïnfecteerde lymfe-knooppunt, met een focus op veiligheid, consistentie en kwaliteit van RNA.

De voorbereiding van RNA van het weefsel met een aangezuurde fenol-guanidine isothiocyanaat reagens is gebaseerd op de originele methode van Chomczynski en Sacchi^16,17, met een zuivering over silica gebaseerde spin kolommen in aanwezigheid van chaotropic agenten op basis van het oorspronkelijke werk van Vogelstein en Gillespie¹⁸. We onderzoeken ook de mogelijkheden voor het herstel van RNA voor transcriptomics van vee lymfklieren geconserveerd door toepassing van alternatieve methoden. Ten slotte onderzoeken we de invloed van de variabele van de tijd op de kwaliteit van de RNA in grote dierlijke necropsies, met inbegrip van een representatieve experiment beeltenis van het effect van een toename van de tijd tussen de euthanasie en de bemonstering op de herstelde RNA-Profiel van bison en boviene lymfklieren. Dit artikel zal nuttig zijn niet alleen voor moleculaire biologen maar ook aan veterinaire onderzoekers vanaf transcriptomic studies zijn.

Protocol

De hier afgebeelde dier necropsie-procedures vallen onder de goedgekeurde IACUC protocollen bij het National dier ziekte Center, Ames, IA Alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de goedgekeurde richtsnoeren voor dierlijke zorg en welzijn.

1. pre-planning voordat necropsie

1. Voordat hij de necropsie, stelt u de volgende materialen voor transport naar de necropsie suite:
   1. 1.5 of 2 mL microcentrifuge buizen gevuld met ~ 1,0 mL van RNA behoud oplossing, in een rek of transport container. Zorg ervoor dat richtlijnen te volgen van de fabrikant voor de verhouding tussen het volume van de oplossing voor behoud aan het volume van het weefsel.
   2. Wegwerp scalpels en schone, gesteriliseerde met autoclaaf pincet: één set voor het ontleden van de huid en een andere set voor het verzamelen van de lymfeklieren (één voor elke lymfeklier, per dier), waardoor een cross-besmetting van de huid en de milieu flora met de lymfeklier weefsels.
   3. 3 punch mm biopsie tools, necropsie messen, een slijpsel container voor de gebruikte scalpels en hulpmiddelen voor biopsie en snijplanken of wegwerp trays voor gebruik in de lymfeklier dissectie.
   4. Gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen, met inbegrip van PPE nodig voor werk op het passende niveau van BSL voor het systeem.
   5. Autoclaaf herbruikbare metalen instrumenten, met inbegrip van de verlostang, in metalen pannen vóór de necropsie, met behulp van het gereedschap/drogeladingvaart instellen.

2. identificatie en monsterneming van lymfklieren in vee en Bison

Figuur 3 . Lymfeklieren van de boviene hoofd en nek. (A) deze cartoon afbeelding toont geselecteerde lymfeknopen van het hoofd en de nek van het Bos taurus. (B) dit beeld toont de oorspeeksellymfklieren lymfeklier in dwarsdoorsnede (links) in vergelijking met de oorspeeksellymfklieren speekselklier in dwarsdoorsnede (rechts). Let op het verschil in structuren tussen de twee weefseltypes (HLA). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

1. Isolatie van prescapulares lymfklieren in vee en bison
   1. Euthanaseren van het dier (vee of bison van elke leeftijd, al naargelang het experiment) gebaseerd op het lokale protocol van de IACUC. Bevestig de dood door specifiek in het institutionele IACUC protocol, met inbegrip van het ontbreken van een hartslag, het ontbreken van de ademhaling en het ontbreken van een hoornvlies reflex beschreven methoden. Verplaats het dier aan de vloer van de necropsie.
      Opmerking: Er zijn verschillende methoden van humane euthanasie gebruikt in de laboratoriumpraktijk van grote dieren. Intraveneuze toediening van pentobarbital natrium en fenytoïne natriumhydroxide-oplossing is echter de meest algemeen goedgekeurd en formulier gebruikt. Raadpleeg de AVMA richtsnoeren voor de euthanasie van dieren. ¹⁹
      Let op: Volg alle relevante bioveiligheid protocollen voor een necropsie aan de gastinstelling, met inbegrip van de richtsnoeren voor de veilige verwijdering van scherpe instrumenten in een punctie-bewijs container, en de decontaminatie van herbruikbare metalen messen en pincet. Dit protocol genereert slijpsel afval van het gebruik van wegwerp scalpels. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen zoals gedicteerd door de institutionele richtsnoeren, met inbegrip van laarzen, overalls, handschoenen en oogbescherming.
   2. 3 deelnemers om te werken op de dierlijke weefsels te identificeren.
      Opmerking: Hier, dissector 1 zal worden belast met de grootschalige segmenteren van de gewenste dierlijke weefsels, dissector 2 zal het herstellen van de lymfklieren van de verschillende dierlijke delen, en dissector 3 zal werken op een afzonderlijke tabel te isoleren van de secties van elk lymfeklier en overbrengen naar de buizen met een conserveermiddel oplossing.
   3. Beginnen door het plaatsen van het dier in de laterale ligcomfort.
   4. De schouder uit te breiden door het bewegen van de voorste ledematen terug op het niveau van de knie (carpus); deze resolutie zal de schouder terug te brengen en zorgen voor een makkelijker palpatie van de lymfeklier. Gevoel voor de aanwezigheid van de lymfeklier "vast".
      Opmerking: Tijdens ziekte voorwaarden, lymfadenopathie aanwezig kan zijn, waardoor de identificatie van lymfklieren gemakkelijker, maar dit proces kan ook invloed hebben op de consistentie, samenstelling en architectuur van de lymfeklier.
   5. Zodra gevonden, en met de schouder nog uitgebreid, gebruik een scalpel of necropsie mes om een huid incisie langs de omtrek van de schouder.
      Opmerking: Niet beperken de grootte van de incisie, zelfs als de lymfeklier gelegen via palpatie is. Een grotere incisie biedt gemakkelijker toegang tot diepere weefsels en vergemakkelijkt voor de dissector van de besnijdenis van de lymfeklier.
   6. Met behulp van een paar pincet, trekken de huid om te onthullen van het punt van de schouder en nek spieren.
      Opmerking: De prescapulares lymfeklier is vaak gevonden in onderhuids vet, met name in overconditioned dieren.
   7. Nogmaals, palperen de locatie van de lymfeklier (figuur 3A).
      Opmerking: In tegenstelling tot het onderhuidse vet, de lymfeklier houdt zijn vorm wanneer gepalpeerd. Lymfeklieren zijn bovendien niet aaneengesloten waren met de omringende weefsel, zoals ze worden omsloten door een dunne vezelig capsule.
   8. Na het lokaliseren van de prescapulares lymfeklier, zorgvuldig uit het subcutane vet, met behulp van een scalpel en pincet, ontleden en isoleren van de lymfeklier.
      1. Kijk voor de aanwezigheid van een thin cellulosehoudende capsule, als afgebeeld in figuur 1B, om deze te onderscheiden van de lymfeklier en adipeus weefsel; lymfeklieren zijn niet aaneengesloten waren met de omringende weefsel.
   9. De lymfeklier overbrengen in de lymfeklier dissectie tabel, met behulp van een kunststof dienblad voor de overdracht van weefsel, voor verdere segmenteren.
      Opmerking: Het uiterlijk van deze lymfeklieren in bison is vergelijkbaar. De bijbehorende video toont het uiterlijk van de prescapulares lymfeklier als ontleed uit de rechterschouder van een Amerikaanse bizon.
2. Isolatie van de oorspeeksellymfklieren lymfklieren in vee en bison
   1. Beginnen door het plaatsen van het dier in de laterale lighouding op de verdieping van de necropsie. Zoek het kaakgewricht (TMJ)-gewricht.
      1. Als dit moeilijk is te vinden, de onderkaak langzaam en bepalen van de locatie waarop de onderkaak met de schedel hecht; Dit is de TMJ.
   2. Met behulp van een scalpel of necropsie mes, zorgvuldig Maak een incisie in de huid. Start de incisie dorsale op het gewricht en breiden het ventrally/verticaal langs de kaaklijn.
   3. Het ontleden van de huid weg te onthullen het subcutane weefsel. De oorspeeksellymfklieren speekselklier zal eerst zichtbaar zijn als gevolg van zijn groot lobulated oppervlak verschijning, en rode kleuring.
   4. Met behulp van Tang en een scalpel, verplaatsen de oorspeeksellymfklieren speekselklier opzij te vinden de oorspeeksellymfklieren lymfeklier zit gewoon craniale en mediale naar de speekselklier (figuur 3A). Het onderzoeken van het weefsel van de oorspeeksellymfklieren lymfeklieren voor textuur vóór verdere verwerking.
      Opmerking: lymfeklieren van het gelaat (oorspeeksellymfklieren en submandibulaire) worden geassocieerd met de speekselklieren, die het isolement van de lymfeklier verwarren kunnen. In vergelijking met de lymfeknopen, speekselklieren zijn veel groter en hebben een lobulated oppervlak uitstraling. Bovendien, op het snijvlak, speekselklieren homogeen in de natuur en geen vertonen de klassieke corticale en Wallenberg architecturale patroon van lymfklieren (figuur 3B).
   5. Accijnzen de klier met een scalpel. Overbrengen naar de lymfeklier dissectie tabel, met behulp van een kunststof dienblad voor de overdracht van weefsel, voor verdere segmenteren.
3. Isolatie van lymfklieren in vrouwelijke runderen en bison
   1. Plaats het dier in de laterale ligcomfort.
   2. Verhoog de achterpoot om de inguïnale regio bloot en zoek de uier.
      Opmerking: In een gezonde, niet-zogende dier, palpatie van deze lymfeklieren niet mogelijk. In een zogende dier, kan deze lymfeklieren zijn voelbaar aan de caudal grens van de basis van de uier.
   3. Met behulp van een scalpel, maken een insnijding net dorsale de uier, loopt langs het bovenbeen, de klieren van de uier worden bloot te stellen.
   4. Ontleden van het subcutane weefsel en vinden de lymfeklier van de uier worden ingebed in een dunne laag van onderhuids vet. Als niet visueel te onderscheiden, palperen het blootgestelde weefsel voor de aanwezigheid van een stevige structuur binnen het subcutane vet.
   5. Zorgvuldig uit de lymfeklier van het vet met behulp van Tang en een scalpel, ontleden. Overbrengen naar de lymfeklier dissectie tabel, met behulp van een kunststof dienblad voor de overdracht van weefsel, voor verdere segmenteren.

3. afdelen en opslag van lymfklieren

1. Passeren de geïsoleerde lymfeklieren van dissector 2 te dissector 3 aan een dissectie tafel grenzend aan de belangrijkste necropsie ruimte. Plaats elke lymfeklier op een verse gedeelte van een snijplank. Label vooraf de snijplanken in secties door lymfeklier, ter vergemakkelijking van de ontvangst van meerdere lymfklieren achter elkaar. Gebruik wegwerp trays voor infectieuze monsters.
2. Met behulp van Tang en een wegwerp scalpel of necropsie mes, verwijder een sectie van de lymfeklier. Maak met een scherp mes een Sagittaal knippen openstellen van de lymfeklier.
3. Het interieur van de lymfeklier, met name in specimens van besmette dieren te onderzoeken, op zoek naar asymmetrie, laesies, kleurverschillen, etc. opnemen de opmerkingen.
4. (Optie 1) Kleine weefselsecties
   1. Gebruik wegwerp scalpels accijnzen stukken van elke lymfeklier die minder dan 5 mm in dikte en elk stuk overbrengen in een buis met een RNA behoud oplossing met schone pincet.
5. (Optie 2) Lymfeklier biopsie of segmenteren methodologieën
   Opmerking: Biopsieën of vectorafbeeldingsbestanden methoden, wanneer toegepast op parallelle lymfeklier secties over verschillende knooppunten en dieren, bieden consistentie van gesamplede weefsel voor een bulk RNA analyse.
   1. Wig afdelen methode
      1. Na bestudering van de Sagittaal sectie voor het opvangen van cellen in het profiel van de lymfeklier, accijnzen een taart-vormige wig uit de lymfeklier, vanuit het midden naar de buitenste capsule. Voor een knooppunt 2 cm in breedte (standaardformaat; Zie tabel 1), een wig op het centrum dat is 4 mm in de buitenste booglengte gesneden en 5 mm in dikte krijgen een versgewicht van ~ 100 mg.
      2. Met behulp van de scalpel, snijd de wig in kleine stukjes, niet dikker dan 5 mm, en ongeveer 50-100 mg elke in vochtige tissues gewicht.
         Opmerking: Voor consistentie, verwerken alle wig stukken uit een enkele lymfeklier in één batch of in afzonderlijke buizen gevolgd door RNA bundelen om een representatieve RNA-Profiel van de lymfeklier van belang.
      3. Leg de stukjes van weefsel met een tang in buizen met ten minste 10 systeemvolumes van RNA behoud oplossing, in vergelijking met het volume van het weefsel.
   2. Punch biopsie methode
      1. Selecteer een gereedschap van de biopsie punch als het doel is het verzamelen van specifieke secties, zoals specifieke follikels van het knooppunt. Selecteer een gereedschap in overeenstemming met de omvang van de steekproef gewenst voor collectie. Punch biopsie tools zijn beschikbaar in een waaier van formaten, van 1 tot 8 mm in diameter.
      2. Visueel zoeken de regio's van belang zijn voor het monster in de lymfeklier.
      3. Gebruik het gereedschap van de biopsie punch accijnzen van de secties van belang op te drukken en het omdraaien van het werktuig in het weefsel te creëren van de kern. Overbrengen in het stuk weefsel met een tang een buis met ten minste 10 systeemvolumes van RNA behoud oplossing. Als dikker dan 5 mm, gebruik pincet en een scalpel om verder het weefsel in kleinere stukjes te verdelen.
6. Zodra de monsters zijn overgedragen aan behoud oplossing (bijv., RNALater), vervoer ze terug naar het laboratorium bij kamertemperatuur.
7. Opslaan van de monsters bij 4 ° C's nachts om weefsel penetratie mogelijk te maken.
8. De volgende dag giet af de overtollige RNA conserveermiddel oplossing en slaan de weefselmonsters bij-80 ° C. Verwijder zoveel conserveringsmiddel mogelijk voordat de bevriezing van de monsters. Gebruik een P1000 en/of P200 micropipet-tip voor een efficiënte RNA conserveermiddel oplossing verwijderen.
   Let op: Gooi de gedecanteerde behoud-oplossing op de juiste manier, op basis van de besmettelijke eigenschappen van het pathogene agens gebruikt evenals de chemische en milieurisico's van de conserveermiddel oplossing zoals opgegeven op het veiligheidsinformatieblad.
   Opmerking: De hier gegeven richtlijnen zijn verstrekt voor de RNA behoud oplossing beschreven in de Tabel van materialen. Raadpleeg de fabrikant richtsnoeren als met behulp van alternatieve behoud oplossingen.

4. verwerking van RNA lymfklieren

Let op: Draag een laboratoriumjas, handschoenen en goede eye protection voor de verwerking stappen.

Opmerking: De fenol gebaseerde reagens gebruikt hier wordt beschreven in de Tabel van de materialen (en het protocol is gebaseerd op de richtlijnen van de fabrikant)²⁰. Het gebruik van alternatieve fenol gebaseerde reagentia kan vergen een wijziging van de procedure, op basis van de aanbevelingen van de fabrikant voor het specifieke product gekocht.

1. Voordat het toegang tot van de monsters, pre aliquot het gekoeld (4 ° C) fenol gebaseerde reagens homogenisering buizen (1,5 mL/buis), met behulp van een precisiepipet.
   Let op: Fenol is giftig, bijtend en een gevaar voor de gezondheid. Chloroform is giftig en een gevaar voor de gezondheid. Stappen verwerking 4.1-4.9 in een chemische zuurkast en draag handschoenen om te voorkomen dat elk contact met de chemicaliën. In de Verenigde Staten is chloroform een gevaarlijke afvalstoffen; beschikken over buizen met gevaarlijke afvalstoffen volgens lokale en institutionele richtsnoeren. Proces weefselmonsters van met ziekteverwekkers onder de overeenkomstige BSL-2, BSL-3 of BSL-4 richtsnoeren besmette dieren.
2. Zodra een monster kan worden losgemaakt van de microcentrifuge-buizen met schone pincet, onmiddellijk overdracht ongeveer 50-100 mg van het bewaarde weefsel aan de homogenisering buis met het reagens op basis van fenol.
   1. Beperken het ontdooien voordat de toevoeging aan het reagens op basis van fenol. Opslag op droog ijs gebruiken wanneer meerdere monsters uit de vriezer voor verwerking worden verwijderd.
3. Strak cap van de buis, plaats het op de homogenizer, en meng het monster met een rotor-stator weefsel homogenizer in het reagens op basis van fenol. Voltooi de verwerking bij kamertemperatuur. Wanneer voltooid, Controleer voor een bewolkte verschijning om ervoor te zorgen dat het monster was succesvol gehomogeniseerd; het weefsel moet worden verspreid in een bewolkt schorsing.
   Opmerking: De instelling van een 2 min RNA extractie wordt gebruikt (de voorgeprogrammeerde instelling van de RNA_02_1 voor de homogenizer beschreven in de Tabel van materialen, ontworpen voor bevroren weefsels). De rotor-stator opgegeven in dit protocol (Zie de Tabel van materialen) is groot-toothed en aangepast voor de homogenisering van allerlei weefselsoorten, met inbegrip van vezelig materiaal. De instelling van de RNA_02_01 is ontworpen specifiek voor bevroren (in tegenstelling tot vers) weefsels. Zoals lymfklieren vezelig bindweefsel componenten hebben wordt een evenzo geoptimaliseerde rotor-stator homogenizer aanbevolen om een effectieve dissociatie. Zie de National Institute of Environmental Health Sciences²¹ voor meer informatie over homogenisering aanbevelingen.
   1. Als grote brokken van weefsel na de homogenisering blijven, herhaalt u de procedure homogenisering. Om efficiënt herstellen het RNA, moet het weefsel goed worden losgekoppeld.
   2. Gebruik voor meer vezelige lymfeklier stukken, Tang en schaar te hakken vooraf de lymfeklier stuk in verschillende kleinere stukken vóór de overdracht aan de homogenisering buis. Zoals in de inleiding is beschreven, is er mogelijk lymfeklier weefsels van oudere dieren meer vezelige.
      Opmerking: Indien een dubbele analyse van de gastheer en ziekteverwekker RNA is gewenst, aanvullende behandeling (zoals kraal homogenisering) kan nodig zijn voor het herstel van het bacteriële RNA, vooral als de gram-positieve ziekteverwekkers zijn aanwezig in de weefsels.
4. Onmiddellijk verwijderen van het gehomogeniseerde monster uit de tubes en het overbrengen naar RNase-vrije microcentrifuge buizen (2,0 mL in grootte) met een micropipet P1000.
5. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 12.000 x g bij 4 ° C tot het verwijderen van het puin van een steekproef. Gebruik een P1000 micropipet tip, overbrengen in het supernatant een verse microcentrifuge buis, de pellet achterlatend.
6. De bovendrijvende vloeistof gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Splitsen van elk monster tussen twee 1,5 microcentrifuge buizen.
7. Voeg 0,2 mL chloroform per 1 mL van het reagens op basis van fenol (d.w.z., 0.3 mL voor het monster van een 1,5 mL); omkeren het met de hand voor 1-2 min naar de fasen te mengen, maar niet niet vortex het monster. Incubeer het gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
8. Centrifugeer het gedurende 15 minuten staan bij 12.000 x g bij 4 ° C.
9. Verwijder voorzichtig de bovenste, heldere waterige fase met een micropipet tip (P1000 of P200) die de bovenste laag, zonder het verstoren van de interfase of de rode fenol-chloroformlaag zal vormen. Overbrengen naar een nieuwe microcentrifuge buis.
10. Meng het met een gelijk volume van 100% ethanol; Meng het door het omkeren van de buis 4 - 5 keer. De buis verschijnt vaak bewolkt.
11. Met een tip van micropipet, door de vloeistof te overbrengen in een commerciële spin silica gebaseerde kolom, verder te zuiveren en elueer de RNA, na²²instructies van de fabrikant. Elueer de RNA gegenereerd op basis van ~ 50 mg van weefsel in 50-100 µl RNase-gratis water.
    Opmerking: Hoewel de extractie van fenol gebaseerde reagens DNA in de organische fase, voor het stroomafwaarts gebruik van RNA in qRT-PCR en/of RNA-sequencing toepassingen verwijdert, een aanvullende behandeling van RNA monsters met DNase wordt aanbevolen.
12. Aliquot eluted RNA te scheiden van buizen voor gebruik in een kwantificering en kwaliteit beoordeling, om eventuele bevriezen-ontdooien van het belangrijkste RNA-monster. Overdracht van de buizen tot-80 ° C voor opslag.
13. In het geval van lymfeklier monsters afkomstig zijn van dieren die besmet zijn met zoönotische pathogenen, vooral bij het beheersingsniveau BSL-3 valideren de resulterende RNA monster voor de afwezigheid van ziekteverwekkers als het monster zal worden verplaatst naar een lager niveau insluiting gebied van bioveiligheid voor de analyse van de kwaliteit, RT-PCR, en/of RNA-sequencing bibliotheek voorbereiding.
    Opmerking: Het is essentieel dat lokale regelgeving, en in het geval van de CDC (Centers for Disease Control and Prevention) inactivatie richtsnoeren voor werk met select agenten, het is noodzakelijk voor het valideren van alle inactivatie procedures op de lokale site van de onderzoeker.
    1. 1/10^th volume van elk eluted RNA monster uit stap 4.12 (dat wil zeggen, 5 µl van 50 µl van het totale RNA) te verwijderen. Met behulp van een steriele techniek, meng het monster met 100 µl van bacteriële groei Bouillon in een steriele 1,5 mL microcentrifuge buis. Met behulp van een steriele kunststof strooier, verspreid het RNA-Bouillon-mengsel over het oppervlak van een agarplaat.
       Opmerking: Selecteer een bouillon type en agar plaat consistent is met de groei van het pathogene agens waarmee de dieren werden uitgedaagd.
    2. Incubeer de agarplaat onder omstandigheden die specifiek zijn voor de groei van het pathogene agens waarmee de dieren werden uitgedaagd. Het ontbreken van herstelde bacteriën controleren voordat het verwijderen van de monsters van de insluiting van BSL-3.
       Opmerking: De resulterende eluted RNA, na kwantificering en proeven van integriteit, is geschikt voor downstream toepassingen, waaronder een RNA-sequencing en RT-PCR analyse.
14. Het beoordelen van de RNA herstel en zuiverheid met behulp van een spectrofotometer. Laden om te beoordelen van de kwaliteit van RNA, 1-2 µl van het eluted monster van het RNA tot de spectrofotometer voor een analyse. Het opnemen van een spectrum van het monster in het ultraviolette (UV) bereik.
    1. Van het UV-spectrum, het opnemen van de A₂₆₀/A₂₈₀ verhouding, de verhouding tussen de A₂₆₀/A₂₃₀ en de A₂₆₀ waarde voor het monster (A = absorptie).
    2. Als single-stranded RNA bij een concentratie van 40 µg/mL een extinctie van 1.0 op 260 heeft nm, bereken de concentratie van de RNA (µg/mL) vermenigvuldigd met de A₂₆₀ x 40 voor de gezuiverde monsters.
15. Als een snelle methode voor de beoordeling van RNA betrouwbaarheid, om aangetaste monsters uitsluiten van verdere analyse, Meng 2 µl van elk monster RNA met 4 µl van 1,5 x formamide laden kleurstof [95% gedeïoniseerd formamide, 0,025% (m/v) bromophenol blauw, 0,025% (m/v) xyleen cyanol, 5 mM EDTA (pH 8.0), 0,025% (m/v) SDS] in 1,5 mL tubes microcentrifuge^23,24.
16. Verhit de buizen bij 70 ° C gedurende 1 minuut, en breng de buizen aan ijs voor 1 min.
17. Laden van de monsters naar een 1% agarose gel bereid in 1 x TBE (Zie voor een volledige beschrijving van een inheemse agarose gelelektroforese voor RNA, Rio, Ares Jr., Hannon en Nilsen)²⁴. Scheiden van de monsters door standaard gel elektroforese methoden en de aanwezigheid van 28 en 18S ribosomaal RNA bands bevestigen.
18. Follow-up van de Elektroforese van het gel met kwantitatieve analysemethoden voor de bepaling van RNA integriteit [bv, een Bioanalyzer en RIN (RNA Integrity nummer) analyse], zoals beschreven in de Resultaten van de vertegenwoordiger en Mueller, O. et al. ²⁵ en Schroeder, A. et al. ²⁶.

5. alternatieve extractiemethode van formaline-vaste, paraffine-ingebedde (FFPE) weefsels

Opmerking: Hoewel FFPE weefsel behoud niet de meest robuuste wijze van preservatie van nucleic zuur vertegenwoordigt, kan het protocol hieronder zijn een manier om te studeren van sommige transcriptionele veranderingen wanneer andere bewaarde weefsels niet beschikbaar zijn.

1. Formaline reagentia voorbereiden op het behoud van weefsel door verstrekking van formaline in plastic bakjes. Weefsels moeten worden bewaard in formaline met een verhouding van 20:1 formaline: weefsel volume/gewicht, respectievelijk.
   Let op: Formaline is een bekend menselijk carcinogeen en hoewel niet acuut toxisch, chronische blootstelling (meestal door middel van geïnhaleerde rook) kan vertegenwoordigen een aanzienlijk gezondheidsrisico. Goede ventilatie en PPE (dat wil zeggen, het gebruik van nitril handschoenen, worden gewijzigd binnen 15 min na de eerste blootstelling) moeten de gezondheidsrisico's te minimaliseren. Verwijzen naar de OSHA Formaldehyde Standard (29 CFR 1910.1048) voor meer informatie over controle en risico evaluatie van de blootstelling.
   Opmerking: Gebruik van te weinig formaline kan invloed hebben op het vermogen van het weefsel te worden volledig behouden wanneer ondergedompeld in conserveermiddel.
2. Snijd na het isolement van het weefsel van belang, zorgvuldig het weefsel tot minder dan 5 mm in dikte.
   1. Het schoongemaakte weefsel met pincet, zorgvuldig worden dompelen in formaline te minimaliseren elke spatten.
      Opmerking: De weefsels moeten volledig worden ondergedompeld in formaline te voorzien in een volledige vastlegging. Het is van cruciaal belang dat alle oppervlakken van het weefsel volledig zijn bedekt met formaline.
3. Zodra de weefsels hebben is ondergedompeld in formaline, toestaan voor de fixatie van het weefsel optreden gedurende ten minste 24 uur bij kamertemperatuur.
   Opmerking: Formaline doordringt weefsels langzaam, met een snelheid van 1 mm per uur van alle oppervlakken^27,28. Daarom houden de dikte van de weefselsecties tot minder dan 5 mm resultaten in een snelle vastlegging van het hele weefsel.
4. Na de fixatie door de weefsels te overbrengen in een geschikt reagens voor het insluiten van de paraffine.
   Opmerking: bijvoorbeeld de weefsels in dit manuscript onderzocht werden overgedragen aan 70% ethanol voorafgaand aan het insluiten.
5. Het weefsel inbedden in paraffine. ²⁹
6. Afdeling van het weefsel tot 10-80 µm in dikte (gebruik 10-20 µm desgewenst miRNA is moet worden geëxtraheerd)²⁹.
7. Een stuk van 40 mg weefsel van elk monster te worden verwerkt en leg deze in een steriele, nuclease-gratis microfuge buis scalpel en pincet gebruikt, verwijderen.
8. Gebruik maken van een commerciële kit ontworpen voor deparaffinization en nucleïnezuur herstel van FFPE weefselsteekproeven RNA om uit te halen de bewaarde monsters.
   Opmerking: De kit waarnaar wordt verwezen in de Tabel van de materialen maakt gebruik van xyleen en ethanol wast paraffine, een stap van de behandeling protease en een glasvezel filter voor het zuiveren van RNA verwijderen.

Resultaten

Het gebruik van de overwegingen die in dit artikel (stappen 1-4 van het protocol) gepresenteerd zal helpen bij het herstel van RNA van grote dieren monsters die geschikt is voor een stroomafwaartse analyse in host gen expressie studies. De kwaliteit van de RNA voor downstream toepassingen wordt beoordeeld door meerdere standaard maatregelen. Spectrofotometrie, de verhouding tussen de A₂₆₀/A₂₈₀ biedt een zekere mate van besmetting van het eiwit en de A₂₆₀/A₂₃₀ verhouding biedt e...

Discussie

De meerderheid van de studies van de transcriptomic en de bijbehorende protocollen richten op muis, rat of post-mortemlaesies menselijke specimens. Onderzoeken in vee en wild bieden echter een breed scala van mogelijkheden voor de karakterisering van de immuunrespons tegen ziekten, zowel als toepassing op geneesmiddelen voor diergeneeskundig gebruik en, met betrekking tot de bestrijding van zoönotische ziekten, om de volksgezondheid. Dit protocol verstrekt een overzicht van de belangrijkste overwegingen bij hoge-integrit...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments)	ThermoFisher	AM7020
1.5 ml of 2 ml polypropyleen microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
Weggeefschaafjes	Daigger Scientific	EF7281
Weefseltang, rattental	Fisher Scientific	12-460-117	Andere weefseltangen beschikbaar inclusief gebogen punt, taps toelopende rand, enz., afhankelijk van gebruikersvoorkeur
3 mm punchbiopsienaalden	Fisher Scientific	NC9949469
Container voor scherpe voorwerpen (klein en transportabel voor necropsie)	Stericycle	8900SA	1 qt. grootte hier getoond
Snijplanken of wegwerpschalen	Fisher Scientific	09-002-24A	Beschikbaar in verschillende maten, afhankelijk van gebruikersvoorkeur
Persoonlijke beschermingsuitrusting			Varieert met pathogeen (handschoenen, ademhalingsmaskers, veiligheidsbrillen, enz.)
Fenol-gebaseerd RNA-extractiereagens (we gebruikten TRIzol Reagent voor alle experimenten)	ThermoFisher	15596026
Silica kolom-gebaseerde RNA-extractiekit (we gebruikten de PureLink RNA Mini kit voor alle experimenten)	ThermoFisher	12183018A	Ontworpen voor maximaal 100 mg weefsel
100% Ethanol (200 proof voor moleculaire biologie)	Sigma-Aldrich	E7023
Weefselhomogenisator met ingesloten homogenisatiebuizen (we gebruikten de gentleMACS dissociator voor alle experimenten)	Miltenyi Biotec	130-093-235
Agarose (Algemeen, voor gelelektroforese)	Sigma-Aldrich	A9539
1X TBE	Fisher Scientific	BP24301	Kan ook vanaf nul worden gemaakt in het laboratorium
Degeïoniseerd formamide	EMD Millipore	S4117
Natriumdodecylsulfaat	Sigma-Aldrich	L3771
Broomfenolblauw	Sigma-Aldrich	114391
Xyleen cyanaal	Sigma-Aldrich	X4126
EDTA (Ethyleendiaminetetraazijnzuur)	Sigma-Aldrich	EDS
UV-Vis Spectrofotometer (we gebruikten de NanoDrop Spectrofotometer)	ThermoFisher	ND-2000
Apparaat voor kwantitatieve RNA-beoordeling (we gebruikten de Bioanalyzer, met bijbehorende componenten en protocollen)	Agilent	G2939BA
FFPE RNA-extractiekit (we gebruikten de RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue)	ThermoFisher	AM1975
Kunststof verspreider (L-vormige verspreider)	Fisher Scientific	14-665-231	Alleen nodig voor steriliteitstesten voor monsters van geïnfecteerde dieren
Necropsismesjes	Livestock Concepts	WI-0009209