Dit protocol biedt een overzicht van de procedures voor de isolatie van RNA voor de profilering van de transcriptomic van de lymfeklier weefsels van grote dieren, met inbegrip van de stappen in de identificatie en de besnijdenis van lymfeklieren van vee en wilde dieren, bemonstering benaderingen te leveren consistentie in meerdere dieren, en overwegingen plus representatieve resultaten voor de post collectie bewaring en verwerking ten behoeve van RNA analyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Verzameling en verwerking van lymfklieren uit grote dieren RNA p.a.: lymfeklier Transcriptomic Studies van grote diersoorten voorbereiden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Grote dieren (vee en wild) dienen als belangrijk reservoirs van zoönotische pathogenen, met inbegrip van Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonellaen E. coli, en zijn nuttig voor de studie van de pathogenese en/of verspreiding van de bacteriën in natuurlijke gastheren. Met de belangrijkste functie van de lymfklieren in de immuunrespons van de gastheer dienen lymfeklier weefsels als een potentiële bron van RNA voor downstream transcriptomic analyses, teneinde de tijdelijke wijzigingen in genexpressie in cellen in de loop van een infectie. Dit artikel geeft een overzicht van het proces van de lymfeklier collectie, bemonstering van weefsel en downstream RNA verwerking in vee, van runderen (Bos taurus) als een model, met extra voorbeelden van de Amerikaanse bison (Bison bison ). Het protocol bevat informatie over de locatie, identificatie en verwijdering van lymfeklieren van meerdere belangrijke plaatsen in het lichaam. Bovendien wordt een biopsie bemonsteringsmethode gepresenteerd dat voorziet in een consistentie van bemonstering over meerdere dieren. Verscheidene overwegingen voor behoud van de steekproef worden besproken, met inbegrip van de generatie van RNA geschikt voor downstream methodologieën zoals RNA-sequencing en RT-PCR. Vanwege de lange vertragingen die inherent zijn aan grote dierlijke vs. muis tijd cursus studies, worden representatieve resultaten van bison en boviene lymfeklier weefsels voorgesteld om te beschrijven van het tijdsverloop van de degradatie in dit weefseltype, in het kader van een herziening van vorige methodologische werkzaamheden op aantasting van het RNA in andere weefsels. Over het geheel genomen zal dit protocol nuttig aan beide veterinaire onderzoekers beginnen transcriptome projecten op grote dieren monsters en moleculaire biologen geïnteresseerd in het leren van technieken voor in vivo weefsel bemonstering en in vitro verwerking zijn.
Inleiding
RNA-sequencing analyse van transcriptome lymfklieren biedt de mogelijkheid om het karakteriseren van de immuunrespons van dieren aan een verscheidenheid van pathogenen. Terwijl deze methodologie is gebruikt uitgebreid in muizen, analyses hebben onlangs geweest zich uitbreiden naar grotere zoogdieren1,2. Dieren/grote dierlijke lymfeklieren kan worden gebruikt voor het karakteriseren van host reacties op een infectie, niet alleen voor hun gebruik in het vaccin of genetische studies en voor de identificatie van doelen voor Geneesmiddelenontwikkeling, maar ook als modelsystemen voor menselijke studies op zoönotisc....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De hier afgebeelde dier necropsie-procedures vallen onder de goedgekeurde IACUC protocollen bij het National dier ziekte Center, Ames, IA Alle experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de goedgekeurde richtsnoeren voor dierlijke zorg en welzijn.
1. pre-planning voordat necropsie
- Voordat hij de necropsie, stelt u de volgende materialen voor transport naar de necropsie suite:
- 1.5 of 2 mL microcentrifuge buizen gevuld met ~ 1,0 mL van RNA behoud oplossing, in een rek of transport container. Zorg ervoor dat richtlijnen te volgen van de fabrikant voor de verhouding tussen het volume van de oplossing voor behoud aan het volu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het gebruik van de overwegingen die in dit artikel (stappen 1-4 van het protocol) gepresenteerd zal helpen bij het herstel van RNA van grote dieren monsters die geschikt is voor een stroomafwaartse analyse in host gen expressie studies. De kwaliteit van de RNA voor downstream toepassingen wordt beoordeeld door meerdere standaard maatregelen. Spectrofotometrie, de verhouding tussen de A260/A280 biedt een zekere mate van besmetting van het eiwit en de A260/A230 verhouding biedt e.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meerderheid van de studies van de transcriptomic en de bijbehorende protocollen richten op muis, rat of post-mortemlaesies menselijke specimens. Onderzoeken in vee en wild bieden echter een breed scala van mogelijkheden voor de karakterisering van de immuunrespons tegen ziekten, zowel als toepassing op geneesmiddelen voor diergeneeskundig gebruik en, met betrekking tot de bestrijding van zoönotische ziekten, om de volksgezondheid. Dit protocol verstrekt een overzicht van de belangrijkste overwegingen bij hoge-integrit.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden. Alle onderzoek is gefinancierd met intramurale middelen uit de U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service. Alle verwijzingen naar specifieke producten worden geleverd met het oog op experimentele reproduceerbaarheid en vertegenwoordigen goedkeuring van deze producten niet door de federale overheid.
Dankbetuigingen
De auteurs wil James Fosse bedanken voor zijn uitstekende werk op alle videografie en video-verwerking; Michael Marti voor zijn uitstekende werk in de generatie van gedigitaliseerde vee beelden; Lilia Walther voor haar hulp bij RNA extractie en Bioanalyzer loopt; Mitch Palmer en Carly Kanipe voor hun nuttige beoordeling en feedback op lymfeklier beelden; verzorging van de dieren en de veterinaire personeel bij de nationale dier ziekte centrum voor al hun harde werk en bijstand met de veehouderij en de voorbereiding voor necropsies.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments) | ThermoFisher | AM7020 | |
| 1.5 ml of 2 ml polypropyleen microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Weggeefschaafjes | Daigger Scientific | EF7281 | |
| Weefseltang, rattental | Fisher Scientific | 12-460-117 | Andere weefseltangen beschikbaar inclusief gebogen punt, taps toelopende rand, enz., afhankelijk van gebruikersvoorkeur |
| 3 mm punchbiopsienaalden | Fisher Scientific | NC9949469 | |
| Container voor scherpe voorwerpen (klein en transportabel voor necropsie) | Stericycle | 8900SA | 1 qt. grootte hier getoond |
| Snijplanken of wegwerpschalen | Fisher Scientific | 09-002-24A | Beschikbaar in verschillende maten, afhankelijk van gebruikersvoorkeur |
| Persoonlijke beschermingsuitrusting | Varieert met pathogeen (handschoenen, ademhalingsmaskers, veiligheidsbrillen, enz.) | ||
| Fenol-gebaseerd RNA-extractiereagens (we gebruikten TRIzol Reagent voor alle experimenten) | ThermoFisher | 15596026 | |
| Silica kolom-gebaseerde RNA-extractiekit (we gebruikten de PureLink RNA Mini kit voor alle experimenten) | ThermoFisher | 12183018A | Ontworpen voor maximaal 100 mg weefsel |
| 100% Ethanol (200 proof voor moleculaire biologie) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Weefselhomogenisator met ingesloten homogenisatiebuizen (we gebruikten de gentleMACS dissociator voor alle experimenten) | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Agarose (Algemeen, voor gelelektroforese) | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| 1X TBE | Fisher Scientific | BP24301 | Kan ook vanaf nul worden gemaakt in het laboratorium |
| Degeïoniseerd formamide | EMD Millipore | S4117 | |
| Natriumdodecylsulfaat | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Broomfenolblauw | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Xyleen cyanaal | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| EDTA (Ethyleendiaminetetraazijnzuur) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UV-Vis Spectrofotometer (we gebruikten de NanoDrop Spectrofotometer) | ThermoFisher | ND-2000 | |
| Apparaat voor kwantitatieve RNA-beoordeling (we gebruikten de Bioanalyzer, met bijbehorende componenten en protocollen) | Agilent | G2939BA | |
| FFPE RNA-extractiekit (we gebruikten de RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue) | ThermoFisher | AM1975 | |
| Kunststof verspreider (L-vormige verspreider) | Fisher Scientific | 14-665-231 | Alleen nodig voor steriliteitstesten voor monsters van geïnfecteerde dieren |
| Necropsismesjes | Livestock Concepts | WI-0009209 |
Referenties
- Tizioto, P. C., et al. Immunological response to single pathogen challenge with agents of the bovine respiratory disease complex: an RNA-sequence analysis of the bronchial lymph node transcriptome. PLoS One. 10 (6), e0131459(2015).
- Miller, L. C., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
