Variaties op negatieve vlek elektronenmicroscopie methoden: Tools voor de aanpak van de uitdagende systemen

Summary

Negatieve vlek EM is een krachtige techniek voor het visualiseren van macromoleculaire structuur, maar verschillende kleuring technieken wisselende resultaten kunnen produceren in een monster afhankelijke wijze. Hier zijn verschillende negatieve kleuring benaderingen in detail te bieden een eerste workflow voor het aanpakken van de visualisatie van uitdagende systemen beschreven.

Abstract

Negatieve vlek elektronenmicroscopie (EM) kunnen relatief eenvoudig en snel observatie van macromoleculen en macromoleculaire complexen met behulp van contrast verbetering van vlek reagens. Hoewel beperkt in resolutie tot een maximum van ~ 18-20 Å, negatieve vlek EM is handig voor een verscheidenheid van biologische problemen en biedt ook een snelle middel om de beoordeling monsters voor cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM). De negatieve vlek workflow is eenvoudige methode; het monster is geadsorbeerd op een substraat, dan een vlek is toegepast, uitgewist, en gedroogd om het produceren van een dunne laag van dichte vlek elektron waarin de deeltjes zijn ingesloten. Afzonderlijke monsters kunnen echter zich gedragen in sterk verschillende manieren onder variërende kleuring voorwaarden. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van een grote verscheidenheid van substraat voorbereiding technieken, negatieve kleuring van reagentia en raster wassen en technieken te bevlekken. Bepalen van de meest geschikte techniek voor elke individuele monster moet gebeuren op een case-by-case basis en een microscopist moet toegang hebben tot een scala aan verschillende technieken om de hoogste kwaliteit negatieve vlek resultaten te bereiken. Gedetailleerde protocollen voor twee verschillende substraat bereidingswijzen en drie verschillende Bevlekkende technieken worden aangeboden, en ziet u een voorbeeld van een monster dat sterk verschillende resultaten, afhankelijk van de gebruikte methode toont. Daarnaast is de voorbereiding van enkele gemeenschappelijke negatieve kleuring reagentia, en twee nieuwe Lanthanide gebaseerde vlekken, beschreven met de discussie over het gebruik van elk.

Introduction

Ondanks de recente aandacht voor de resolutie vlek revolutie die voortvloeien uit de aanzienlijke vooruitgang in cryo-Elektron microscopie¹ (cryo-EM), negatieve EM blijft een krachtige techniek en een essentieel onderdeel van de electron microscopists' toolbox. Negatieve kleuring nog steeds de beste methode voor snelle beoordeling van een monster voor het optimaliseren van de cryo-raster voorwaarden². De hoge contrast en de snelheid van raster voorbereiding van negatief gekleurd monsters maakt het ideaal voor de beoordeling van de zuiverheid van de steekproef, concentratie, heterogeniteit en conformationele flexibiliteit³. Vele biologisch informatieve structuren hebben geleid van negatieve vlek reconstructies, ondanks de techniek de resolutie beperkt tot 18 ~ Å resolutie^4,5,6, en sommige monsters betere resultaten opleveren in de vlek dan cryo-EM voor een verscheidenheid van redenen⁷.

In negatieve vlek EM, is het deeltje van belang geadsorbeerd op het oppervlak van een EM-raster en omgeven door een amorfe matrix van elektron dichte vlek samengestelde. Een hoge relatieve contrast wordt tussen de achtergrond en het deeltje van belang, met het deeltje wordt minder dan de omliggende vlek⁸dichte elektron geproduceerd. De deeltjes worden weergegeven als lichtpartijen vanwege hun lage elektron verstrooiing macht ten opzichte van de dichte omliggende vlek, die de elektronen meer verstrooit en donkerder. Substructural kenmerken van deeltjes kunnen worden afgeleid uit het gedetailleerde onderzoek van de resulterende afbeeldingen als vlek zal in een spleet doordringen en onregelmatige contrast detail⁹produceren.

Het negatieve kleuring proces begint met de voorbereiding van een substraat van de steun waarop de monster-deeltjes zijn gevangen, en de laag van gedroogde vlek ondersteund. Het meest gebruikte ondersteuning substraat is een laag van amorfe koolstof, soms ondersteund door een dun laagje van polyvinyl (bijvoorbeeld Formvar) of nitrocellulose (bijvoorbeeld Collodium) polymeer. Deze substraten kunnen worden ingekocht commercieel of bereid in-house met behulp van de protocollen die hieronder worden beschreven.

Nadat het substraat ondersteuning is voorbereid, het monster kan worden toegepast, en de overtollige oplossing uitgewist af. Monsters moeten worden opgeschort in een geschikte buffer voor negatieve-kleuring. Het is het beste om te voorkomen dat het gebruik van fosfaatbuffer en hoge zout concentraties, die aanleiding kunnen geven tot kristallijne precipitaten dat het specimen kunnen verdoezelen. Reductoren, detergentia, sacharose, glycerol en hoge concentraties van nucleotide moeten ook worden vermeden aangezien zij ook invloed hebben op vlek kwaliteit⁴. Wanneer de buffer samenstelling kan niet worden gewijzigd, het oppervlak van het EM-raster met water wassen, of een meer geschikte buffer na adsorptie en voorafgaand aan kleuring kan verminderen de vorming van buffer gerelateerde artefacten en de achtergrond van de vlek in het algemeen te verbeteren. Als buffer artefacten worden verdacht, kan het informatieve om een buffer-alleen raster om te bepalen als de buffer-componenten de bron van de waargenomen artefacten zijn vlek.

Nadat het monster is geadsorbeerd, uitgewist en gewassen indien nodig, wordt een kleuring reagens toegepast. Een verscheidenheid van reagentia bleken te worden effectieve negatieve vlekken (tabel 1), maar de vlek moet worden gekozen aan de steekproef. Een 'halo' van vlek vormen rond het deeltje als gevolg van zowel de verplaatsing van de vlek moleculen door de hydrofobe regio's van de eiwitten en afkeer door betalen groepen. Dus, de vlek moet zodanig worden gekozen dat de Protonering staat van potentiële geladen groepen op de proteïne hetzelfde als de vlek met een pH van de werken is. Tegenover de kosten op het oppervlak van het eiwit kunnen bijdragen aan een positieve kleuring uit te voeren, die hoewel een nuttige techniek in eigen juiste¹⁰ niet in het toepassingsgebied van dit document. De meest gebruikte negatieve kleuring reagentia zijn uranyl acetaat en uranyl formate. Deze vlekken hebben een relatief fijne korrelgrootte (4-5 Å)⁹ en resolutiebeelden met een hogere over andere vlekken zoals phospho-tungstates (8-9 Å korrelgrootte)^9,11, ammonium molybdaat¹¹, en sommige bieden lanthanide gebaseerde vlekken van¹². Uranyl acetaat en formate ook fungeren als een fixeer, behoud van veel eiwit-eiwitinteractie op een milliseconde tijd schaal¹³, hoewel de lage pH van de vlek en haar neiging te precipiteren bij fysiologische pH schadelijk voor sommige monsters^{14 zijn kan} . Ondanks hun nut geven de uranyl-zouten ook logistieke uitdagingen als ze zijn zowel giftige als mild radioactieve, waarvoor speciale hantering, opslag, kan en verwijdering eisen, waardoor sommige gebruikers niet-radioactieve alternatieven te zoeken.

Er zijn een groot aantal methoden beschreven voor de voorbereiding van de ondergrond, de voorbeeldtoepassing, en vlekken van EM rasters. De meest geschikte methode kan is monster afhankelijk en moeilijk om na te gaan bij het aanpakken van een nieuw systeem. Dit manuscript beschrijft twee methoden voor de bereiding van het substraat en drie Bevlekkende methoden; kant bevlekken flicking⁵en snelle afboeken van¹⁵. Zijde-bevlekken is de eenvoudigste van de beschreven methoden. Zowel de flicking methode en de snelle Afboekingsmethode zijn moeilijker te implementeren, maar beperken de contacttijd van het monster met de film van de steun voor fixatie en is aangetoond dat de vorming van vlek artefacten voor sommige monsters⁵verzachten. Het doel van dit manuscript is dus te bieden een eerste workflow voor het aanpakken van de visualisatie van uitdagende systemen door negatieve-vlek EM.

Protocol

1. bereiding van EM rasters

1. Carbon blad methode
   1. Een vers gekloofd mica blad voor te bereiden.
      1. Voorzichtig een naald van de spuit precisie of een scheermesje invoegen op een hoek van het mica blad, een paar mm tussen de lagen. Steekt u het gereedschap als dicht bij de verticale centrum van het blad mogelijk zijn voor de productie van twee stukken van ongeveer gelijke dikte.
      2. Zorgvuldig prise apart de twee helften van het blad mica. Dit kan doen met het blote oog of onder een Microscoop ontleden.
      3. Een van de hoeken van elk van de bladen nieuw gekloofd mica afgesneden. In het geval dat het blad in de verdamper van koolstof tijdens vacuüm release draait, kan de koolstof coated kant van het blad worden geïdentificeerd.
   2. Plaats de gekloofd mica blad/s in de kamer van een koolstof verdamper, met het vers-gekloofd oppervlak naar boven.
   3. Zorg ervoor dat de koolstof verdamper set-up correct met een goed voorbereide koolstof-elektrode.
      Opmerking: De methode van de voorbereiding van de koolstof-staven zal variëren afhankelijk van de specificaties van de koolstof-verdamper. Een protocol voor één instrument is als volgt tot stap 1.1.5.
      1. Verscherpen een carbon staaf met een puntenslijper hebben een scherpe tip en vervolgens het Pools met een papieren handdoek te verwijderen van alle ruwe bramen.
      2. Met behulp van fijn schuurpapier afvlakken van het einde van een tweede staaf en poets het weer glad met een papieren handdoek.
      3. Plaats de twee koolstof staven in de verdamper volgens de instructies van de fabrikant. Zorg ervoor dat het aangescherpte einde op de eerste staaf maakt stevig contact met het platte gezicht van de tweede staaf.
   4. Plaats een kleine hoeveelheid schone, droge filtreerpapier gedeeltelijk onder de mica als de dikte van de koolstof is gonna visueel worden gemeten. U kunt ook plaats een witte matte microscoopglaasje met een kleine schar van vacuüm vet naast de mica te meten van de dikte van de koolstof.
   5. Kluisje koolstof op de mica volgens de instructies van de fabrikant.
      1. De vacuüm pomp naar beneden en wacht totdat het is op 10^-5 mbar. De spanning van de elektrode ingesteld op 4.0 V (maximaal 5 V kan worden afhankelijk van de staaf koolstofbron vereist).
      2. Uitvoeren van meerdere korte pulsen van ongeveer 3,5 s in duur tot de elektrode te storten van 1-2 nm dikke skvoznyak van koolstof op het oppervlak van mica.
         Opmerking: Als stroom wordt toegepast op de koolstof-staaf zal gloeien rood en vervolgens wit. Niet staren op het heldere licht als dit schade aan uw ogen veroorzaken kan.
      3. Toestaan dat de koolstof te storten op de mica totdat de gewenste dikte is bereikt, zoals gemeten door de koolstof verdamper van laagdiktemeter of door visuele waarneming van de koolstof gestort op het filtreerpapier of microscoopglaasje. Zorg ervoor dat de laatste koolstof laag 5-10 nm dik.
         1. Als de dikte van de koolstof is afgemeten visueel zal vergelijken de berijpte deel van het microscoopglaasje bekleed met vacuüm vet naar de blootgestelde gebied, donkerder als meer koolstof wordt gestort.
            Opmerking: Er is geen kwantitatieve methode om te bepalen van koolstof dikte wanneer using zulks werkwijze.
   6. De Vacuuemcel vent en verwijder de koolstof beklede mica van de koolstof-verdamper.
      Opmerking: De koolstof beklede mica kan worden overgelaten regelen 's nachts voordat u verdergaat met de volgende stappen
   7. Gebruik een van de twee watercontainers te zweven van de koolstof-film op de EM-rasters: een container met een afvoer klep aan de onderkant zodat water kan worden afgevoerd uit en de koolstof laag verlaagd naar de wachten op rasters of een hijs tuig dat de rasters kunnen worden ingesteld op onder water oppervlak, die vervolgens de rasters aan de koolstof-film op het wateroppervlak kunt verhogen.
   8. Vul de container met ultrazuiver gedestilleerd water, zodat het oppervlak van het water ongeveer 5 mm van de bovenkant is. Reinig het oppervlak van water door een blad of twee van lens weefsel te slepen over het oppervlak te verwijderen van elke zwevende deeltjes.
   9. Plaats een stuk van schone roestvrij-stalen gaas (1 inch door 2,5 inch is een passende omvang) onder de oppervlakte van het water.
   10. Met behulp van een paar fijne pincet, schone, droge EM rasters gezicht-omhoog (volgens de fabrikant beschrijving) op de roestvrij stalen gaas leggen. Pak zo strak mogelijk samen de rasters, maar doen niet laten overlappen.
   11. Zodra de rasters zijn gerangschikt, greep stevig de koolstof gecoate mica blad in een paar pincet of film ontwikkelen Tang.
   12. Introduceren het mica blad in het water. Ervoor zorgen dat dit bij een zeer ondiepe hoek (~ 10 graden gebeurt).
       Opmerking: De mica moet doorbreken van het wateroppervlak en dompelen, terwijl de koolstof-film moet van de mica scheiden en op het wateroppervlak drijven. Deze stap moet niet worden uitgevoerd direct boven de rasters, om te voorkomen dat schade en/of besmetting.
       1. U wilt minimaliseren de mogelijkheid van de koolstof film wil niet scheiden van het blad mica, score rond de rand van het blad mica met een scheermesje of een hoek afgesneden met kleine schaar vóór de invoering ervan in het water.
   13. Zodra de film van de koolstof heeft losgemaakt, het mica blad verwijderen of laten vallen aan de onderkant van de container.
   14. Met behulp van fijn omver te werpen pincet, zeer zachte druk uitoefenen en met trage bewegingen begeleiden de koolstof-film over de bovenkant van de rasters.
   15. Breng het blad van de koolstof in contact met het oppervlak van de rasters hetzij door langzaam drainage van het water of het verhogen van de hijs ring, afhankelijk van het soort apparatuur wordt gebruikt.
   16. Trek voorzichtig de roestvrij staal gaas (nu met koolstof-gecoate rasters) van de apparatuur en de wick weg sommige van het overtollige water met behulp van een stukje filtreerpapier. Ervoor zorgen dat dit gebeurt door het aanraken van het koffiefilter tot aan de rand van het stalen gaas maar komt niet in contact met de rasters of koolstof film.
   17. Plaats de maaswijdte van rasters in een petrischaal met een droog stuk filtreerpapier en laat het droge volledig.
       Opmerking: Dit wordt best beïnvloed door 's nachts drogen bij kamertemperatuur, maar de stap kan worden versneld door het plaatsen van de rasters in een oven op ongeveer 60 ° C.
2. Float en vacht (directe carbon afzetting). Deze methode is eerder in detail beschreven¹⁶
   1. Volledig vullen een kom schoon groot glas tot de rand met gedestilleerd water zodat een meniscus aan de bovenkant vormt.
   2. Een enkele druppel Collodium oplossing (nitrocellulose in amyl acetaat) van toepassing op het oppervlak van het water met behulp van een schone Pipet van pasteur, toestaan de druppel verspreid en volledig drogen. Eenmaal droog is een dun laagje Collodium drijven op de top van het wateroppervlak is zichtbaar.
   3. Verwijder voorzichtig de Collodium laag met een tandenstoker te verwijderen van stof of andere vervuiling van het oppervlak van het water.
   4. Een tweede Collodium droplet van toepassing op het water en laat ze uitgespreid en droog voor 2-3 minuten.
      Let op: Herhaal de stappen 1.2.3-1.2.4 een flat en rimpel gratis vel Collodium wordt verkregen.
   5. Met behulp van een paar fijne pincet plaats EM rasters naar beneden (volgens de fabrikant beschrijving) op de zwevende Collodium blad. Pak de rasters samen strak in een zeshoekig matrix, maar doen niet laten overlappen.
      Opmerking: Als een raster is misplaatst of ondersteboven geplaatst het is over het algemeen best te verlaten in plaats in plaats van riskeer schadelijk het collodium blad wanneer het proberen om het te verplaatsen.
   6. Wanneer alle van de rasters zijn geplaatst, zachtjes Leg een vel filtreerpapier overheen. Laat het papier te verzadigd raken door capillaire werking.
      Opmerking: Elke grootte of de dikte van filtreerpapier is geschikt als het volledig de rasters bedekt.
   7. Gebruik een tandenstoker te verwijderen elke Collodium film die verder reikt dan het koffiefilter.
   8. Grip van het koffiefilter aan de rand en het schil van het wateroppervlak.
      Opmerking: De rasters moeten blijven op het papier gekleefd.
   9. Plaats het papier plat en Collodium-face up in een petrischaal en laat het volledig drogen.
   10. Breng het filter met de rasters in de kamer van een koolstof verdamper met een goed voorbereide koolstof-elektrode als gedetailleerde in 1.1.2.
   11. De procedure koolstof verdamping zoals beschreven voor de methode blad koolstof in
3. Laat enkele seconden tussen pulsen om oververhitting en beschadiging van het nitrocellulose blad te voorkomen.
   Opmerking: Indien gewenst de polymeer laag kan worden verwijderd nadat de rasters koolstof bekleed, zijn hoewel deze stap zelden nodig is. Plaats van de rasters koolstof kant omhoog op een nieuw stuk filtreerpapier en zet enkele druppels van aceton op het papier in de buurt van, maar niet op, de rasters. Laat de aceton verspreid onder de rasters en ontbinden en absorberen van de polymeer laag.

2. bereiding van reagentia negatieve kleuring

1. Voorbereiding van Uranyl acetaat
   1. Breng een kleine hoeveelheid ultrazuiver water aan de kook en laat het aan de kook voor 10 min te grondig ontgas. Laat ze lichtjes afkoelen en gebruik het vervolgens te ontbinden uranyl acetaat (UA) op 1-2% (g/v).
      Opmerking: Deze procedure uitvoeren in een zuurkast en passende persoonlijke beschermingsmiddelen.
   2. Nadat de oplossing is afgekoeld, filtreer door een 0,2 µm spuit filter of filtreerpapier.
   3. Bewaar de UA beschermd tegen licht en op 4 ˚C. De oplossing is stabiel voor maximaal 1 jaar.
2. Voorbereiding van Uranyl Formate van poeder. Deze methode is beschreven in Detail eerder⁸
   1. Los 20 mg uranyl formate (UF) poeder in 2 mL gekookt ontgaste ultrazuiver water (zoals in stap 2.1.1) door roeren.
   2. Terwijl steeds roer, voeg 8 µL van 5 M NaOH, de oplossing moet wijzigen in een donkerder gele kleur, maar geen neerslag moet vormen.
   3. Filtreer de oplossing door een filter van de spuit 0,2 µm.
   4. Winkel de UF-vlek beschermd tegen licht. Gooi die de vlek moet als enige neerslag of bruine verkleuring wordt waargenomen. De oplossing is slechts 1-2 dagen stabiel.
3. Voorbereiding van Uranyl Formate van Uranyl acetaat
   1. 1 mL van de 1% (m/v) UA vlek neerslaan door 100 µL van 1 M NaOH toe te voegen.
   2. Centrifugeer het mengsel gedurende 2 minuten op maximale snelheid in een benchtop centrifuge.
   3. Verwijder eventuele supernatant en los het precipitaat op in 100 µL van 5% (v/v) mierenzuur door krachtige vortexing.
   4. Verdun tot een eindvolume van 1 mL met 900 µL ultrazuiver water tot het opleveren van de UF-vlek in mierenzuur van 0,5% (v/v).
   5. Winkel de UF-vlek beschermd tegen licht. Gooi de vlek indien overhaaste of bruine verkleuring wordt waargenomen.
4. Voorbereiding van andere kleuring reagentia
   1. Voorbereiding van Lanthanide acetaat vlekken
      1. Samarium acetaat (SmAc), Gadolinium acetaat (GdAc), Thulium acetaat (TmAc) of Erbium acetaat (ErAc) bij 1-2% (g/v) in ultrazuiver water opgelost.
         Opmerking: Als monsters tonen positieve kleuring of slechte naleving van het raster bij het gebruik van deze vlekken, ze kunnen worden aangezuurde met maximaal 0,5% (v/v) mierenzuur. Kleuring van de positieve resultaten in de steekproef verschijnen als een donker object omgeven door een witte halo. Slechte naleving van de grid zal resulteren in minder moleculen dan verwachte nageleefd op de grid.
   2. Voorbereiding van ammoniummolybdaat en natrium Phosphotungstate
      1. Los van de vlek op 1-3% (m/v) in ultrazuiver water. Breng de pH op 7.0 met 5 M NaOH indien gewenst.

3. adsorberend monsters aan de koolstof substraat en kleuring

1. Voorbereiding van het oppervlak van het raster voor de voorbeeldtoepassing door waardoor zij Hydrophilic
   1. Schakel het raster naar boven op een microscoopglaasje in een gloed geen kwijting eenheid.
   2. Behandelen van het raster voor een minimum van 30 bij 10 s mA.
      Opmerking: De exacte methode van gloed kwijting zal afhangen van de specificaties van het bijzondere stuk van apparatuur die wordt gebruikt.
   3. Ook kan dit worden bewerkstelligd door UV-bestraling gedurende 10 minuten met behulp van een benchtop UV lamp⁴.
2. Kant bevlekken methode. Deze methode is beschreven in Detail eerder⁸
   1. De rand van het raster met een negatieve druk pincet greep, en 3-5 µL van monster van toepassing op het oppervlak van de steun.
   2. Het monster aan adsorberen aan de oppervlakte van het raster voor 10 s tot 1 min. optimaliseren de adsorptie-tijd moet voor afzonderlijke monsters.
   3. Aanraking van de rand van het raster een vel filtreerpapier en capillaire toelaten te trekken uit de vloeistof.
   4. Optioneel: Wassen het raster. Plaats 50 µL druppels ultrazuiver water of passende vluchtige bufferoplossing op een vel laboratorium film. Zachtjes aanraken van het oppervlak van de koolstof van het raster aan de daling en til van een kleine druppel op het oppervlak van het raster. Aanraking van de rand van het raster een vel filtreerpapier en capillaire toelaten te trekken uit de vloeistof.
   5. Herhaal deze wassen stap zo vaak als gewenst.
   6. Plaats twee 50 µL druppels kleuring reagens op een vel laboratorium film.
   7. Zachtjes aanraken van het oppervlak van de koolstof van het raster aan de daling en til van een kleine druppel op het bovenste oppervlak van het raster.
      Opmerking: Als de vlek naar migreert de achterkant van de grid dan de grid moet verwijderd.
   8. Aanraking van de rand van het raster een vel filtreerpapier en capillaire toelaten te trekken uit de vloeistof. Deze kleuring stap tweemaal uitvoeren.
   9. Het raster in de lucht droog of droog onder een gloeilamp toegestaan.
3. Flicking methode
   1. De rand van het raster met een negatieve druk pincet greep, en 3-5 µL van monster van toepassing op het oppervlak van de steun.
   2. Houd de pincet in de ene hand, zodat het raster is schuin op ongeveer 45° geconfronteerd weg en snel flick de pols van die hand om 'flick uit"de meerderheid van de druppel die zich boven op het raster.
   3. Optioneel: Met behulp van een glazen pipet van Pasteur een druppel wassen oplossing van toepassing op het oppervlak van de steun en 'flick uit"zoals in 3.2.2. Herhaal indien nodig.
   4. Met behulp van een glazen pipet van Pasteur toepassen een druppel van het reagens op het steun oppervlak kleuring en 'flick uit"zoals in 3.2.2. Herhaal 1 - 3 keer afhankelijk van de diepte van de vlek vereist voor visualisatie voor specimen.
      Opmerking: Dit is niet de enige factor die tot definitieve vlek diepte attributen (zie discussie).
   5. Het verwijderen van overtollige vlek door het aanraken van de gescheurde rand van een vel papier van de filter aan de rand van het raster.
   6. Het raster in de lucht droog of droog onder een gloeilamp toegestaan.
4. Snelle Afboekingsmethode
   1. Tekenen van 30-70 µL van de vlek (1% UA meestal gebruikt) in het puntje van een pipet 200 µL, draai de volume-draaiknop om 5 µL van lucht opstellen, dan stellen wassen/mengen reagens (5-30 µL), indien nodig, gevolgd door een andere kleine luchtspleet en vervolgens 5 µL van monster stellen.
   2. Greep de rand van een raster met een negatieve druk pincet, houden de pincet zodat het raster is schuin op ongeveer 45° geconfronteerd weg van de onderzoeker, uitwerpen de gehele inhoud van de pipet tip over het gezicht van het koolstof-gecoate EM raster.
   3. Het verwijderen van overtollige vlek door het aanraken van de gescheurde rand van een vel papier van de filter aan de rand van het raster.
   4. Het raster in de lucht droog of droog onder een gloeilamp toegestaan.
      Opmerking: Voor alle methoden is het raadzaam te glijden van de gescheurde rand van een vel filtreerpapier langs de pincet totdat zij het raster tot als dit oplossing opgesloten tussen de twee zijden van de verlostang, die het gedroogde raster in de kaken van de verlostang trekken kan als ze eenmaal zijn verwijderd geopend. Het raster in de pincet kan ook worden geplaatst op de rand van een zuurkast te drogen. De constante luchtstroom kan helpen meer produceren zelfs kleuring.

Results

Alle van de kleuring reagentia getest geproduceerd negatieve kleuring tot op zekere hoogte, met UF opbrengst van de monsters met het grootste contrast en de scherpste en meest gedetailleerde deeltjes. Diep ingesloten monsters (Figuur 1) lanthanide gebaseerd vlekken ErAc en TmAc geproduceerd negatieve kleuring van gelijkwaardige kwaliteit aan UA zoals beoordeeld door de schijnbare contrast en de scherpte van de gekleurde deeltjes, produceren met TmAc helderder, meer scherpe beelden dan ErAc. Hoewel de grotere omvang van het graan van TmAc, bij hoge vergroting, blijkt wanneer tabak Mosaic Virus (TMV) deeltjes werden gekleurd met 1% TmAc de ~ 23 Å herhaling van het deeltje TMV¹⁷ was nog steeds duidelijk zichtbaar met het blote oog en als a meridional laag lijn in de Fourier-transformatie van de onbewerkte afbeelding. Geen van de andere lanthanide vlekken getest, ErAc, SmAc, of GdAc, waren kunnen deze functie oplossen. Klasse gemiddelden werden gegenereerd door de winning van overlappende segmenten uit TMV deeltjes waar de spiraalvormige herhaling zichtbaar was. De uitgepakte segmenten werden vervolgens uitgelijnd en ingedeeld aan de hand van RELION¹⁸ te beter visualiseren de periodieke functie (Figuur 2).

Sommige monsters zijn vooral gevoelig voor de methode van kleuring, zoals de spier afgeleid C-proteïne. C-proteïne, die uit een flexibele reeks Ig en Fn-achtige domeinen bestaat, produceert aanzienlijk verschillende beelden door negatieve-vlek EM afhankelijk van de methode van kleuring gebruikt (Figuur 3). Wanneer de methode kant-bevlekken, samengevouwen ring-achtige structuren in acht worden genomen, overwegende dat wanneer gekleurd door de snelle blozen of flicking methoden, C-proteïne wordt waargenomen als een reeks domeinen die lijken op de kralen op een string.

Reagens	Concentratie	pH	Type
Ammoniummolybdaat	1 - 2%	5-7	Anionogene
Erbium acetaat (ErAc)	1-2%	6	Kationogene
Gadolinium acetaat (GdAc)	1-2%	6	Kationogene
Methylamine wolframaat	2%	6-7	Anionogene
Samarium acetaat (SmAC)	1%	6	Kationogene
Natrium silicotungstate	1 – 5%	5 – 8	Anionogene
Natrium phosphotungstate	1 -3%	5 – 8	Anionogene
Thulium-acetaat (TmAc)	1-2%	6	Kationogene
Uranyl acetaat (UA)	1-3%	3-4	Kationogene
Uranyl Formate (UF)	0,75 – 1%	3-4	Kationogene

Tabel 1: Sommige gemeenschappelijke negatieve kleuring reagentia.

Afbeelding 1: voorbeeld microfoto van tabak Mosaic Virus gekleurd met verschillende negatieve vlek reagentia (A) 1% UF (B) 2,5% TmAc (C) 2,5% ErAc. (D) 1% UA (E) 2,5% GdAc en (F) 2,5% SmAc. Schaal bars zijn 100 nm. Representatieve beelden uit meerdere replicatieonderzoeken met meerdere gebieden beeld per repliceren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: tabak Mosaic Virus kleuring met Thulium acetaat (A) hoge vergroting van de oppervlakte van een opname van TMV gekleurd met 1% TmAc. Schaal bar is 20 nm. (B) klasse gemiddelde van uitgepakte TMV segmenten. (C) Fourier-transformatie van de afbeelding in het deelvenster A weergegeven: laag lijn reflecties op ~ 23 Å. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: effecten van de methode op de gedaante van de C-proteïne te bevlekken. (A) C-proteïne gekleurd met UA kant vlek methode en (B) flicking methode gebruiken. Bovenste deelvenster schaal bar is 50 nm, onderste deelvenster schaal balk is 20 nm. Representatieve beelden uit meerdere replicatieonderzoeken met meerdere gebieden beeld per repliceren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Dit manuscript beschrijft meerdere methoden voor negatieve kleuring van monsters voor elektronenmicroscopie met behulp van een verscheidenheid van kleurstoffen, met inbegrip van twee nieuwe lanthanide reagentia (TmAc en ErAc). Veel van de stappen van het negatieve kleuring proces moeten worden geoptimaliseerd voor afzonderlijke monsters, met inbegrip van de keuze van de vlek, hoeveelheid wassen vereist indien van toepassing, en de Bevlekkende techniek. Dit manuscript vormt dus de basis voor microscopists te ontwikkelen van hun eigen werkstromen voor de aanpak van de negatieve kleuring van uitdagende systemen.

De keuze van de vlek is zeer proeven afhankelijk. Monsters die vooral gevoelig voor lage pH zijn kunnen worden afgebroken door UA en/of UF, ondanks de kleefpoeders eigenschappen van deze vlekken¹⁹. In deze gevallen gebaseerde lanthanide vlekken zoals TmAc of ErAc wellicht meer geschikt, hoewel de totale pH van het preparaat moet worden bewaard onder de elektrisch punt van het monster eiwit om te voorkomen dat positieve kleuring. Dit kan worden bereikt door de vlek met azijnzuur verzurende indien nodig. Voor met name lage pH gevoelig monsters, kunnen anionogene wolframaat of molybdaat vlekken meer effectief zijn. Hoewel deze vlekken zijn bevonden voor het opwekken van de vorming van artefacten in sommige gevallen, zoals de vorming van rouleaux in lipoproteïne monsters²⁰. Nogmaals, de pH van de vlek kan moeten worden aangepast, dit keer naar boven de elektrisch punt van het monster, om te voorkomen dat positieve kleuring.

Wassen van het monster vóór kleuring kan nodig zijn als de buffer waarin het model wordt beheerd een hoog zout- of fosfaat onderdeel heeft zijn. In veel gevallen, wassen kan worden uitgevoerd met ultrazuiver water maar voor gevoeliger monsters, die kunnen worden afgebroken of structurele veranderingen wanneer blootgesteld aan water alleen ondergaan, wellicht wassen met een vluchtige buffer van lage Ionische sterkte⁸uit te voeren. Zelfs onder zorgvuldig gecontroleerde omstandigheden, wassen kan leiden tot enkele structurele omlegging van de koolstof oppervlakte²¹.

De methode waarmee u een raster in termen van monster adsorptie bereidt, bevlekken en kleuring kan ook grote invloed op wat wordt waargenomen. De meest geschikte methode is dus, nogmaals, zeer proef afhankelijk. C-proteïne, bijvoorbeeld, wordt waargenomen als een bolvormige ring-achtige structuur na kant-vlek-vlekken, maar dit lijkt te worden van een artefact van de kleuring proces, zoals geopenbaard wanneer rasters worden opgesteld door de flicking methode (of door de snelle Afboekingsmethode) (Figuur 3 ). In de flicking en snelle afboekingsmethoden, de tijd die het monster heeft om te interageren met de koolstof ondersteuning oppervlak voor fixatie is geminimaliseerd¹⁵. Het monster ervaringen ook minder troepen uit de teruglopende meniscus op het bevlekken alvorens fixatie. Dit betekent dat de structurele veranderingen in het model die zouden kunnen bij langdurige absorptie tijd op de koolstof-film of via capillair actie optreden zijn geminimaliseerd. De snelle Afboekingsmethode kan ook worden gebruikt voor time-resolved analyse van specimens. Het monster kan worden gemengd met een ligand of toevoegingsmiddel binnen een pipet-tip voor een periode van tijd voordat de vordering bij een raster of slechts tijdelijk op het oppervlak van het raster voor fixatie binnen milliseconden.

De diepte van de vlek moeten verstrekken optimale beelden van een bepaald exemplaar is weer afhankelijk van de monster². Als de vlek te ondiep is, moleculen kunnen worden beschadigd door de elektronenbundel maar als de vlek te dik is structurele kenmerken kunnen verloren gaan. Diepte van de vlek wordt beïnvloed door meerdere factoren zoals de hydrophilicity van het oppervlak van het raster, gelijkmatigheid van de carbon laag, het bedrag van de vlek toegepast op het raster, de lengte van tijd vlek in contact met het raster voorafgaand aan bevlekken is, de omvang van het bevlekken en de tijd het ta Kes voor het raster om volledig droog. Een raster zal hebben nooit een gelijkmatige verdeling van de vlek in zijn geheel en gebieden van het raster geschikt voor imaging moeten zorgvuldig worden geselecteerd. Inderdaad, rasters vaak variëren in kwaliteit zelfs wanneer voorbereid op dezelfde dag onder dezelfde omstandigheden. Een goed voorbeeld van hoe variatie in vlek diepte de vormgeving van moleculen en de diepte van de juiste vlek bepaalt voor imaging wordt verzorgd door Burgess et al.⁵.

Ondanks de negatieve kleuring wordt een zeer veelzijdige, snelle en eenvoudige methode, zijn niet alle biologische monsters vatbaar voor visualisatie door deze methode. Kwetsbare assemblages kunnen samenvouwen of demonteren bij adsorptie, kleuring of drogen op de EM raster²². Negatieve kleuring kan ook leiden tot afvlakking van moleculen en voorkeur oriëntaties van moleculen op de koolstof ondersteuning film⁷induceren.

Negatieve vlek is een waardevol instrument voor de beoordeling van de specimens in zijn eigen recht, en ook vóór de cryo-EM analyse, maar veel van de fysieke krachten die het monster tijdens het tegenkomt slecht worden begrepen. Daarom is de beste aanpak te gebruiken is zeer proef afhankelijk en moet worden bepaald door trial-and-error in plaats van na een vast protocol onderwezen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 mesh copper EM grids	Sigma-Aldrich	G4776-1VL	Other materials and/or mesh sizes can also be used
Ammonium Molybdate	Sigma-Aldrich	277908
Carbon evaporator	Ted Pella Inc.	9620	Cressington 208 or equivalent
Collodion solution 2% in amyl acetate	Sigma-Aldrich	9817
Dumont #5 negative pressure tweezers	World Precision Instruments	501202	Or other tweezers as preferred
Erbium Acetate	Sigma-Aldrich	325570
Gadolinium Acetate	Sigma-Aldrich	325678
Mica Sheets. 75x25x0.15mm.	AGAR Scientific	AGG250-1
Microscope slides, white frosted	Fisher Scientific	12607976	Or equivalent
Parafilm	Fisher Scientific	10018130	Or equivalent
Pasteur pipette (glass)	Fisher Scientific	10343663	Or equivalent
Razor blade	Fisher Scientific	11904325	Or equivalent
Sandpaper	Hardware store		Wet and dry sandpaper with grit finer that 200 (600 suggested)
Samarium Acetate	Sigma-Aldrich	325872
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	1.06462
Sodium Phosphotungstate	Sigma-Aldrich	P6395
Stainless Steel Mesh, 150x150 mm (cut to size).	AGAR Scientific	AGG252
Thulium Acetate	Sigma-Aldrich	367702
Two Step Carbon Rod Sharper, for 1/4" rods	Ted Pella Inc.	57-10	Or equivalent for carbon evaporator used
Ultra pure water
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Uranyl Formate	Electron Microscopy Sciences	22450
Vacuum grease	Fisher Scientific	12719406	Or equivalent
Whatman #1 Filter paper.	Fisher Scientific	1001 090	Or equivalent
Whatman #40 filter paper	Fisher Scientific	10674122	Or equivalent