Speekselklier hypofunction is een frequente gevolg van auto-immune ziekte en straling therapie. Reproduceerbaar evaluatie van speekselklier functie in muismodellen van deze ziekten is een technische uitdaging. Hier wordt een eenvoudige methode voor nauwkeurige en reproduceerbare meting van speeksel productie in muizen beschreven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een methode voor het meten van speekselklier functie in muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Patiënten met het syndroom van Sjögren, een auto-immune ziekte die de exocrine klieren, ontsteking van de speekselklier ontwikkelen en speeksel productie is gedaald. Ook is speeksel productie ernstig aangetast in patiënten die radiotherapie voor kanker van het hoofd en de nek. Knaagdier modellen, ontwikkeld om deze klinische omstandigheden, nabootsen vergemakkelijken van een goed begrip van de pathogenese van de ziekte en toestaan voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën. Daarom is de mogelijkheid om nauwkeurig, reproducibly en herhaaldelijk meten speekselklier functie in diermodellen is kritisch. Voortbouwend op de procedures die zijn beschreven in de literatuur, een methode ontwikkeld die aan deze criteria voldoet en werd gebruikt om de functie van de speekselklier bij muizen wordt geëvalueerd. Een bijkomend voordeel van deze nieuwe methode is dat het is gemakkelijk onder de knie, en weinig variatie tussen exploitant heeft. Speekselklier functie wordt geëvalueerd als de hoeveelheid (gewicht of volume) of een percentage (mL/min) speeksel in reactie op pilocarpine stimulatie geproduceerd. De verzamelde speeksel is een goede bron voor de analyses van het gehalte aan andere melkeiwitten, immunoglobulin concentraties en andere biomoleculen.
Inleiding
De speekselklieren produceren speeksel in reactie op een verscheidenheid van neurologische en mechanische stimuli1. De prikkels zijn uitgevoerd door het sympathische en parasympathische zenuwstelsel aan de adrenergic en cholinerge receptoren in de klier. Pilocarpine is een cholinerge, para-sympathomimetic agent die voornamelijk op muscarinerge receptoren fungeert. In de speekselklier induceert het de productie van speeksel door te handelen op de muscarinerge acetylcholine receptor M31. Productie van speeksel na toediening van de pilocarpine is een indicator van het vermogen van de speekselklieren te reageren op de stimulatie en wordt vaak gebruikt als een maatregel van speekselklier functie.
Nauwkeurige meting van het speeksel productie is van cruciaal belang in de studie van speekselklier ziekten met inbegrip van Sjögren syndroom2 en straling schade na van hoofd en nek kanker behandeling3. Verschillende methoden zijn ontwikkeld voor het meten van de productie van speeksel in knaagdieren. Deze omvatten directe cannulation van het uitscheidingsmechanisme speeksel buis4, de collectie van speeksel uit de mondholte onder vacuüm5en collectie glazen capillairen6 of een micropipet7,-8, 9. directe cannulation van het speeksel kanaal biedt de meest nauwkeurige en zuiver speeksel. Echter, dit is een technisch uitdagende procedure, en het potentieel voor het veroorzaken van letsel ductaal uitsluit repetitieve speeksel collecties van hetzelfde dier. Het verzamelen van speeksel onder vacuüm kan leiden tot variabele resultaten te wijten aan het drogen van het speeksel uit de buis. Dit verlies is verder overdreven in muizen met verminderde speekselvloed. Glazen capillairen toe de collectie van speeksel voor latere analyses, veranderingen in de viscositeit van het speeksel uitgescheiden in de zieke staat voorkomt echter dat efficiënte vulling van het capillair. Verder kunnen probeert te vegen de mondholte voor het verzamelen van de resterende speeksel leiden tot letsel. De pipet-methode zorgt voor de complete collectie, en voor dezelfde exploitant, het is opmerkelijk consistente tussen experimenten. Om onbekende redenen blijkt deze methode echter aanzienlijke variatie tussen de verschillende exploitanten. Zodat passende vergelijkingen, wordt het daarom noodzakelijk dat dezelfde exploitant alle experimenten gerelateerd aan een specifiek project voert. Duidelijk, vertegenwoordigt dit een groot nadeel voor een laboratorium.
Om te overwinnen van deze problemen, werd een procedure uitgewerkt dat combineert speeksel vergaringsmethoden voor mens en knaagdieren gebruikt. De swab-methode, beschreven hieronder voor het meten van speeksel pilocarpine-geïnduceerde volume is eenvoudig, reproduceerbaar is, niet beïnvloed door de exploitant, en herhaaldelijk kan worden uitgevoerd in hetzelfde dier. Verder staat het verzamelen van het speeksel voor latere analyses van eiwitten, immunoglobulinen, of andere biomoleculen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het protocol hieronder beschreven werd goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité en volgt de ethische richtsnoeren die zijn vastgelegd door de National Institutes of Health. Alle gegevens die in dit verslag werden gegenereerd met behulp van vrouwelijke muizen die 10-12 weken oud waren. De volgende muizenstammen werden gebruikt: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S en (B6XA/J) F1. Alle muizen waren gehuisvest in barrière kooien (5 dieren per kooi) in de voorwaarden van specifieke pathogenen vrije en voeder en water ad libitum verstrekt.
1. voorbereiding
- Ter voorbereiding van een stamoplossing van pilocarpine hydrochloride, Weeg 10 mg van de stof en het ontbinden in 1.776 mL steriele isotonische zoutoplossing door vortexing, om een stamoplossing van 5.63 mg/mL. Er is geen behoefte om deze oplossing te steriliseren. Maar indien gewenst, filtreer het door een 0,2 µM filter. Bewaar deze voorraadoplossing in meerdere porties in een vriezer-80 oC voor maximaal 3 maanden. Elke bevroren voorraad is voor eenmalig gebruik. Eenmaal ontdooid, niet de oplossing pilocarpine refreeze.
- Neem 0,6 mL microfuge buizen en zorgvuldig punch een klein gaatje in de onderkant van elke buis met een verwarmde naald 18-gauge. Zet deze buizen in 2 mL tubes. De buizen moeten niet steriel.
- Met behulp van een scherpe, steriele scheermesje, cilindrische absorberend swabs snij in stukken ongeveer 2 cm in lengte. Knip elke stukje van 2 cm diagonaal om 2 conisch gevormde swabs. Plaats een doekje in elk van de 0,6 mL microfuge buizen.
- Weeg de 0,6 mL microfuge buis met het droge staafje.
- Overdracht van de muizen worden bestudeerd in een nieuwe schone kooi met flessen water. Houd de muizen zonder voedsel voor ten minste 2 uur voor de aanvang van speeksel collectie om te voorkomen dat voedseldeeltjes verontreiniging van het speeksel verzameld.
Opmerking: Het is niet nodig om te houden van 1 muis per kooi voor deze procedure. Echter, het aantal muizen in elke kooi geplaatst is afhankelijk van de instelling van de specifieke regels en voorschriften voor dierlijk gebruik. - Vlak voor het einde van 2 h, bereiden de werkoplossing pilocarpine (0.0563 mg/mL) door verdunning van de stockoplossing 100 x in een steriele zoutoplossing. Het is niet nodig om verdere filter steriliseren van deze oplossing. Houd altijd de werkoplossing pilocarpine op ijs.
Opmerking: Tabel 1 geeft de hoeveelheid pilocarpine ingespoten brandstof voor een scala van muis lichaam gewichten te geven een laatste dosis van 0.375 mg/kg lichaamsgewicht.
2. de procedure
- Weeg elke muis en bepalen van de dosering van de verdoving mix voor elke muis met behulp van tabel 1. Injecteer de eerste muis met het juiste volume van de verdoving mix door de intraperitoneaal route. Instellen van de timer voor 2 min (meeste muis stammen getest in dit protocol gaan slapen door 2 min). Zorg ervoor dat de muis is goed verdoofd door gebrek lopen wanneer geplaatst op een plat oppervlak. Als de muis nog steeds loopt, wachten op extra 2 min voordat u verdergaat met de volgende stap. Een daling van smeermiddel ophthalmic zalf toepassen op beide ogen om te voorkomen dat het drogen.
Opmerking: In tabel 1is de dosis van de verdoving mix 0.007 mL/g lichaamsgewicht. De optimaal bereik voor deze procedure is 0.006 tot 0,008 mL/g lichaamsgewicht. Echter na 4 min., als de muis is nog steeds lopen of schokkerige bewegingen, exposeren consult met de institutionele dierenarts voor het op de juiste manier het verhogen van de dosis van de verdoving. - Bepalen van de dosering van pilocarpine voor de muis met behulp van tabel 1 en injecteren van het passende bedrag door intraperitoneaal route. Instellen van de timer voor 2 min en plaats van de muis in de afdekking tube van 50 mL tot het hoofd en de oren stok uit de gesneden geraken. Plaats de buis in een hoek van 45 graden, met het hoofd naar beneden, en de ventrale oppervlak naar boven gericht. Tape de buis aan het bestuur van de procedure te houden bewegen.
Nota: Tabel 1 verstrekt dosering voor muizen meer dan 17 g, aangezien deze procedure heeft niet geprobeerd bij muizen met een gewicht van minder dan 17 g. - Aan het einde van de 2 min, zachtjes invoegen een gesloten paar micro ontrafeling van pincet in de mond en til de onderkaak naar boven om te openen van de mond. Duw de verlostang 1-2 mm verder in de mond, om ervoor te zorgen dat de tong wordt gezien rusten op de bovenste arm van de verlostang. Met een ander paar van fijne pincet, houden de vooraf gewogen droog doekje dicht bij zijn conisch uiteinde.
- Schuif de conische punt van het staafje voorzichtig in de mond. Trekken de verlostang terwijl het verlaten van het puntje van het staafje in de mondholte.
- Pak het bredere einde van het staafje uit te breiden buiten de mond en draaien zodat de maximale oppervlakte van contact met de mond. Houd het staafje in deze positie gedurende 15 minuten.
Opmerking: Dit zorgt ervoor dat het staafje in de mond voor de duur van de collectie blijft. Merk op dat de conische punt van het staafje als een wick en het bredere gedeelte van het staafje fungeert buiten de mond blijft. - Aan het einde van 15 min, zachtjes draaien van het staafje te verzamelen speeksel dat is niet geabsorbeerd en plaats het natte staafje in de 0,6 mL microfuge buis. Sluit de tube en zet deze in de 2 mL-buis geplaatst op ijs.
Opmerking: Op dit moment, de mondelinge mucosa verschijnt helemaal droog. De muis kan nu worden keerde terug naar zijn kooi voor het herstel van de verdoving. - Overdracht van de muis in de kooi. Plaats bevochtigd voedsel pellets in de kooi na speeksel collectie om te helpen sneller rehydratie.
Opmerking: De muizen wakker binnen 10 minuten na het einde van de collectie. Subcutane injectie van 0,2 mL voorverwarmde isotonische zoutoplossing kan ook worden gegeven aan het versnellen van herstel. - Ga verder met de volgende muis. Alle de muizen moeten worden gecontroleerd, totdat zij volledig zijn hersteld en zijn ambulante.
3. metingen
- Aan het einde van alle collecties, wegen de 0,6 mL buisjes met het natte staafje. Bereken het verschil tussen de versgewicht en het droge gewicht te krijgen van het gewicht van speeksel geproduceerd. Plaats de buis 0,6 mL met speeksel terug in de 2-mL-buis.
- De doppen van de 2 ml tubes afgesneden. Centrifugeer dan de 2 mL tubes voor 2 min bij 7500 x g, op 4oC in een micro-centrifuge om te herstellen van het speeksel. Het meten van de hoeveelheid speeksel verkregen met behulp van een micropipet.
- Geef de resultaten als speeksel gewicht (mg)10 meer dan 15 min of als een verhouding van speeksel gewicht (mg) / mouse lichaamsgewicht (g).
Opmerking: Als de hoeveelheid speeksel geëxtraheerd uit het staafje is gemeten, Geefderesultaten de hoeveelheid speeksel hersteld (mL) of de verhouding van speeksel volume (mL) / mouse lichaamsgewicht (g).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In de experimentele muis modelsystemen, wordt het vermogen te produceren speeksel in reactie op pilocarpine stimulatie gebruikt als een indicator van speekselklier functie. Speeksel productie werd gemeten in 11-week-oude C57BL/6 vrouwelijke muizen door de swab-methode. In figuur 1A, worden de resultaten uitgedrukt als de hoeveelheid speeksel (mg) verzamelde toenemende doses van pilocarpine na. Bij de dosis van 1 mg/kg lichaamsgewicht begonnen enkele van de mu...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Speeksel productie is een complex proces en wordt beïnvloed door vele factoren. Meten van speekselklier functie in laboratoriumdieren kan dus een uitdaging. Een extra uitdaging is dat herhaalde metingen van speekselklier functie in hetzelfde dier nodig om de eerste verschijnselen van ziekte of om aan te tonen van herstel na de behandeling zijn.
De in dit verslag beschreven methode van doekje is technisch eenvoudig uit te voeren met meerdere opties zodat de gegevens vertegenwoordigen. De result...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Dankbetuigingen
De studie werd gesteund door een subsidie van de National Institutes of Health, National Institute van tand- en craniofaciale onderzoek (DE025030).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
- The generated text has been blocked by our content filters.
Referenties
- Proctor, G. B. The physiology of salivary secretion. Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).
- Fox, R. I. Sjögren's syndrome. Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).
- Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).
- Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).
- Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device. Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).
- Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome. J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).
- Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function. J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).
- Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. Inflammatory stimuli accelerate Sjögren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice. Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).
- Szczerba, B. M., et al. Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sjögren's syndrome-like disorder in mice. Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).
- Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca Júnior, L., Renzi, A., Menani, J. Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation. J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).
- Yao, C., et al. Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice. Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).
- Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow. Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).
- Kohrs, R., Durieux, M. E. Ketamine: teaching an old drug new tricks. Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).
- Cold Spring Harbor Protocols. Cold Spring Harb Protoc. , Available from: http://cshprotocols.cshlp.org/ (2006).
- Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay. Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
