Hier presenteren we een protocol om te isoleren en te cultiveren lymfkliertest peritoneale mestcellen. Ook beschrijven we twee protocollen voor hun functionele karakterisering: een fluorescerende beeldvorming van intracellulaire gratis Ca2 + concentratie en een degranulatie kwantitatieve analyse gebaseerd op colorimetrische kwantificering van de vrijgegeven β-hexosaminidase.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van mestcellen buikvlies afkomstige en hun functionele karakterisering met Ca2 +-beeldvorming en degranulatie vitrotests
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mastcellen (MCs), spelen als onderdeel van het immuunsysteem, een belangrijke rol bij de verdediging van de gastheer tegen diverse ziekteverwekkers en in de inleiding van de allergische reactie van het immuunsysteem. De activering van MCs via de cross-linking van oppervlak IgE bij hoge affiniteit IgE-receptor (FcεRI), maar ook via de stimulatie van verschillende andere receptoren gebonden, initieert de opkomst van de vrije intracellulaire Ca2 + niveau ([Ca2 +]ik) dat bevordert de vrijlating van inflammatoire en allergische bemiddelaars/mediators. De identificatie van moleculaire bestanddelen die betrokken zijn bij deze signaalroutes is van cruciaal belang voor het begrijpen van de verordening van MC functie. In dit artikel beschrijven we een protocol voor de isolatie van lymfkliertest bindweefsel type MCs door peritoneale lavage en teelt van peritoneale MCs (PMCs). Culturen van MCs uit verschillende Muismodellen van de knock-out door deze methodologie vertegenwoordigen een nuttige benadering voor de identificatie van eiwitten die betrokken zijn in MC signalering trajecten. Bovendien, we tevens een protocol voor eencellige Fura-2 imaging zoals een belangrijke techniek voor de kwantificering van Ca2 + signalering in MCs. fluorescentie gebaseerde controle voor [Ca2 +]ik een betrouwbare is en veelgebruikte aanpak studie Ca2 + signalering gebeurtenissen, met inbegrip van winkel bediende calcium ingang, die van het grootste belang voor de activering van de MC is. Voor de analyse van MC degranulatie beschrijven we een β-hexosaminidase release assay. Het bedrag van de β-hexosaminidase vrijgegeven in het kweekmedium is beschouwd als een degranulatie marker voor alle drie verschillende secretoire deelverzamelingen beschreven in MCs. β-hexosaminidase kan gemakkelijk worden gekwantificeerd door haar reactie met een substraat van de colorigenic in een microtiterplaat plaat colorimetrische bepaling. Deze zeer reproduceerbaar techniek is kosteneffectief en vereist geen gespecialiseerde apparatuur. Over het geheel genomen het verstrekte protocol blijkt een hoge opbrengst weergeven voor MCs uiting van typische MC oppervlakte markeringen, typische morfologische en fenotypische kenmerken van MCs en demonstreren zeer reproduceerbaar reacties op secretagogues in Ca2 +- beeldvorming en degranulatie testen.
Inleiding
MCs spelen een prominente rol tijdens aangeboren en verworven immuunrespons. Specifiek, MCs deelnemen aan het doden van ziekteverwekkers, zoals bacteriën en parasieten, en ook degraderen potentieel toxische endogene peptiden of componenten van de boosdoeners (voor recensie zie Galli et al. 20081). De fysiologische rol van MCs in aangeboren en adaptieve immuniteit is het onderwerp van een verhit debat. Daarom moeten de talrijke verschillen van de gegevens in de studies met verschillende Muismodellen van de MC-deficiënte systematische herbeoordeling van immunologische functies voor MCs buiten allergie2. Volwassen ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Duitse wetgeving voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (officieel goedgekeurd door de regionale Raad van Karlsruhe).
1. PMC isolatie en teelt door intraperitoneaal Lavage
| 1 | Ijs |
| 2 | 10 mL spuiten |
| 3 | 27 G naalden |
| 4 | 20 G naalden |
| 5 | Piepschuim blok broches en pins |
| 6 | Collectie buizen (50 mL Plastic Centrifuge buizen) |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
PMCs werden geïsoleerd van 3 wild type muizen (C57BL/6N) door intraperitoneaal lavage en verdere gekweekte in RPMI medium aangevuld met 20% FCS en 1% Pen-Strep in aanwezigheid van groeifactoren (IL-3 bij 10 ng/mL) en SCF op 30 ng/mL onder steriele bevochtigde voorwaarden op 37 ° C en 5% CO2. Het medium is gewijzigd op dag 2 en 9 na de isolatie van de cel. De morfologie van de cel werd geanalyseerd via licht DIC beeldvorming (Zie Figuur 1A, .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
MC modellen kunnen met succes worden gebruikt om te studeren MC degranulatie chemotaxis, adhesie, alsmede over de intracellulaire signaaltransductie signaalroutes betrokken bij MC activering verhelderen. Sommige onderzoekers gebruik menselijke MCs modellen, zoals vereeuwigd lijnen (LAD2 en HMC1) of menselijke MCs afgeleid van koord bloed voorlopercellen (CD133 +) en perifeer bloed voorlopercellen (CD34 +). Anderen verkiezen knaagdier MC modellen, zoals vereeuwigd (rat basofiele leukemie RBL - 2H 3 MC lijn) of primaire ge.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs wil erkennen Julia Geminn voor technische bijstand in de mestcel voorbereiding en kweken. Dit werk werd gesteund door de transregionale Collaborative Research Centre (TR-SFB) 152.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
Referenties
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated ce....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
