Herconfigureerbare Microfluidic kanaal met zijwanden Pin-discretized

Samenvatting

Een microfluidic-kanaal met vervormbare zijwanden biedt datatransportbesturing, deeltje handling, aanpassing van de dimensie van het kanaal en andere reconfigurations terwijl in gebruik. Beschrijven we een methode voor het fabriceren van een microfluidic-kanaal met zijwanden gemaakt van een matrix van spelden waarmee hun vorm te wijzigen.

Samenvatting

Microfluidic onderdelen moeten verschillende vormen te realiseren van verschillende belangrijke microfluidic functies zoals mengen, scheiding, deeltje overlapping of reacties. Een microfluidic-kanaal dat zelfs na fabricage vervormt met behoud van de vorm van het kanaal kan hoge Spatio herconfigureerbaar. Deze herconfigureerbaar is vereist in zulke belangrijke microfluidic functies die moeilijk te bereiken in bestaande "herconfigureerbare" of "geïntegreerde" microfluidic systemen. Beschrijven we een methode voor de fabrikatie van een microfluidic-kanaal met een vervormbare zijwand die bestaat uit een lateraal uitgelijnde matrix van de uiteinden van de rechthoekige pinnen. Bedieningsrichting, de pennen in hun lengterichting richtingen verandert de pinnen eind posities, en dus de vorm van discretized kanaal zijwanden. Pin gaten kunnen leiden tot ongewenste lekkage of hechting op aangrenzende pinnen veroorzaakt door troepen van de meniscus. Tot slot de pin gaten hebben we geïntroduceerd koolwaterstof-fluorpolymeer schorsing gebaseerde kloof vuller vergezeld van een elastomere barrière. Dit apparaat herconfigureerbare microfluidic sterke tijdelijke verplaatsing van de in-het-kanaal flow kan genereren, of de stroom in elk gebied van het kanaal kunt stoppen. Deze functie zal vergemakkelijken, op aanvraag, de behandeling van de cellen, viskeuze vloeistoffen, gasbellen en niet-vloeistoffen, zelfs als hun bestaan of gedrag onbekend op het moment van de fabricage is.

Inleiding

Microfluidic apparaten - micro-formaat waarmee kleine hoeveelheden vloeistof en hun stromen - bieden miniaturisatie van biomedische procedures in een "chip"-formaat met grotere draagbaarheid en, vaak, betaalbaarheid. Zoals beschreven in een recente beoordeling¹, zijn verschillende microfluidic componenten bestaande uit spaties en positieve kenmerken ontwikkeld voor het realiseren van fundamentele en belangrijkste fluidic functies zoals mengen, scheiding, deeltje overlapping of reacties.

Terwijl het gedrag van veel microfluidic apparaten is bepaald in de ontwerpfase, kunnen sommige soorten microfluidic apparaten na fabricage wijzigingen van hun structuur of gedrag. Hier verwijzen we naar deze functie als "herconfigureerbaar". De herconfigureerbaar van microfluidic systemen in het algemeen vermindert de tijd en de kosten die nodig zijn voor het ontwerpen van een apparaat, en/of aanpassing van de indeling van de microfluidic of de functies na verloop van tijd in staat stelt.

Eerder beschreven herconfigureerbare microfluidic apparaten in de volgende drie categorieën worden ingedeeld. In de eerste kunt vervorming van elastomere kanalen stroomsnelheid en richtingen worden gewijzigd tijdens het gebruik. Om te krijgen herconfigureerbaar, zijn elastomere kanalen vervormd door verschillende externe en beheersbare krachten zoals pneumatische druk bronnen², Braille actuatoren³of compressie afdichten van⁴. In de tweede herconfigureerbare apparaten afhankelijk modulaire ontwerpen, zoals multi-layer fluidic circuits, modulaire kanalen met magnetische telefoniebronnen met elkaar verbindt, en buis gebaseerde microfluidics⁵. In de derde inning het apparaat zelf is niet herconfigureerbare, maar microdroplet vervoer op elektrode matrices (vaak aangeduid als digitale microfluidics)^6,7 en hangende microfluidic daling-gebaseerde apparaten⁸ inschakelen op aanvraag schakelen van de stroom of de route van vloeistof.

Veel van deze reconfigurations zijn echter beperkt de topologische en macroscopische niveau. Bijvoorbeeld, veel geïntegreerde microfluidic apparaten stroom stoppen of wijzigen van de stroomrichting door instortende microchannels in vooraf gedefinieerde regio's. De positie en het aantal regio's moet worden samengevouwen zijn echter niet herconfigureerbare. Hoewel de digitale microfluidics een scala aan mogelijkheden voor vloeistofbehandeling heeft, moeten mogelijk stromen grotendeels worden beperkt door het volume van elke druppel. Bovendien, wanneer cellen worden gekweekt in dergelijke druppels van cel cultuurmedia, is extra inspanning nodig ter voorkoming van verdamping en gas dissipatie van druppels en Vermijd osmolaliteit schokken en plotselinge pH verandering.

Om te beseffen kanaal functie-niveau herconfigureerbaar, voorgesteld hebben wij een microfluidic-apparaat met beweegbare zijwanden die bestond van arrays van machine-elementen dynamisch configureren wanneer in gebruik⁹. Om een vervormbare zijwand, kleine rechthoekige pinnen stonden zodat elk uiteinde van de pinnen gedefinieerd een segment van de zijkant aangegeven spanningsindex. De pinnen glijden toegestaan de vervorming van de zijkant waardoor vervoer of patronen van cellen, bubbles, en deeltjes in het kanaal. Dood volume minimaliseren en maximaliseren herconfigureerbaar, moest de afstand tussen de aangrenzende pennen worden geminimaliseerd. Echter sterke capillair actie op de kleine hiaten tussen pinnen verbinden binnen en buiten de microchannel veroorzaakt lekkage van iedere vloeistof invoeren van de pin-kloof, waardoor media verdamping, bacteriële of cytotoxische verontreiniging en uiteindelijk cel dood. Daarom hebben we lekvrije discretized zijwand-type herconfigureerbare microfluidic kanalen die weerstaan cyclische pin acties en op de lange termijn cel cultuur¹⁰ontwikkeld.

In dit artikel geven wij een protocol om te bouwen microfluidic cel cultuur apparaat met een discretized van de zijkant aangegeven spanningsindex die na de geleidelijke stijging van de cel cultuur gebied kan worden geconfigureerd. Schopvorm van de zijwanden van de discrete kanaal is getest met behulp van fluorescentie imaging. De celcultuur compatibiliteit en het vermogen van de cel patronen worden geëvalueerd aan de hand van de op de chip celkweek.

Dit microfluidic systeem is geschikt wanneer passende Kanaalweergave kan niet vooraf worden bepaald en moet worden gewijzigd op aanvraag. Bijvoorbeeld dit systeem kan worden gebruikt, de kanaal-breedte en flow-snelheid op basis van de celgroei of migratie, naar stroom of val actief aaltjes of andere kleine voorwerpen die zich onverwacht in het kanaal gedragen, aanpassen of accepteren diverse ruwe monsters of bioproducten die waren nog niet bedacht op het tijdstip van ontwerp.

Protocol

1. de etsen van Pins (Figuur 2)

1. Ontvetten rechthoekige pinnen door onderdompeling in aceton.
2. Passivate van de pinnen door onder te dompelen in 4 mL salpeterzuur 10%, dan Verwarm de oplossing bij 65 ° C gedurende 30 minuten in een oven.
3. Bewerk ultrasone trillingen ten de pinnen in gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten droog met een papieren handdoek te verwijderen van de resterende zuur. Dompel de pennen van 0,5 mL van schimmel release agent voor 2 h.Sonicate de pinnen in gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten.
4. Het fabriceren van een ETS schotel (Figuur 2C).
   1. Teken of twee parallelle lijnen graveren met een gat van 4 mm op een glasplaatje met behulp van een liniaal.
   2. Breng een chemisch bestendige en lage viscositeit kleefstof op een oppervlak van twee rechthoekig gesneden coverglasses.
   3. Bond van de twee gesneden coverglasses op het glasplaatje op een kloof van 4 mm. De parallelle lijn gebruiken als een gids.
5. Afzien van twee lijnen van siliconen lijm op de etsen-schotel (Zie Figuur 2C voor de positie en de grootte van de omtrek).
   Opmerking: Een 3D-gedrukte sjabloon (een STL-modelbestand is opgenomen als een aanvullend materiaal) zal helpen trekken lijnen gemakkelijk en nauwkeurig.
6. Zet de pinnen op de etsen-schotel zodat de 2 mm lang tips op hun rechte uiteinden worden ondergedompeld in de zelfklevende lijnpatroon. Afzien van de lijm weer om ervoor te zorgen dat de pinnen volledig gedekt zijn en tot het opstellen van een contour. De etsen-schotel overbrengen in een bevochtigde gister verwarmd tot 38 ° C. Wachten 's nachts om te genezen van de lijm.
7. 0,2 mL 0,5 M salpeterzuur aan 0,2 mL 5.0 M zoutzuur langzaam in een glazen ampul toevoegen.
   Let op: Het mengsel, ook bekend als Aqua regia, is zeer corrosief en ontploffingsgevaar. Zuurbestendig rubber handschoenen en veiligheidsbril dragen, en extreem voorzichtig te zijn bij de behandeling van zuren. Nooit slaan de oplossing. Verminderen salpeterzuur mogelijk om te verlagen zijn agressiviteit.
8. Zet de schotel etsen op een kookplaat verwarmd tot 65 ° C. 0.4 mL van het zure mengsel giet de ongedekte regio van de pinnen. Wacht 10 minuten en het zuur overbrengen in een bekerglas.
9. Neutraliseer het resterende zuur met inbegrip van de geëtste regio van de pinnen met 5 mL van 0,8 M natriumbicarbonaat oplossing in gedeïoniseerd water.
10. Verwijder de pennen uit de etsen-schotel door te trekken van de pinnen lengterichting met een pincet. Bewerk ultrasone trillingen ten de pinnen in gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten, gevolgd door ultrasoonapparaat in aceton voor 5 min.
11. Passivate de geëtste regio van de pinnen zoals in stap 1.2.
12. Controleer de breedte van de geëtste pinnen met een Microscoop winkel met een dradenkruis. Aanpassen van de tijd van de etsen in 1.7 beschreven, zodat de breedte van de geëtste regio 0,2 bedraagt ± 0,02 mm.
13. De pinnen overbrengen in een glazen ampul met 5 ml 70% ethanol. De flacon brengen een laminaire kap. Pak de pinnen uit de flacon en laten drogen.

2. fabricage van siliconen slab met Reservoirs en een ruimte voor pinnen.

1. Het fabriceren van een mal voor een ruimte voor pinnen en een vaste zijwand door typische lithografische processen.
   1. Jas een ontvette glasplaatje met 1 mL negatieve epoxy fotoresist met behulp van een draai-coater bij 1000 omwentelingen per minuut. Droog de fotoresist op een warmhoudplaat 95 ° C gedurende 15 minuten Herhaal deze stap eenmaal.
   2. Spin jas de derde laag van de dezelfde fotoresist op 2.000 rpm op het glasplaatje met gecoate fotoresist. Droog de fotoresist op een kookplaat van 95 ° C gedurende 30 minuten.
   3. Bloot de fotoresist laag 450 mJ/cm² van 365 nm ultraviolet licht van een UV spot lichtbron door middel van een photoplotted film. Bak de blootgestelde fotoresist op een kookplaat van 95 ° C gedurende 15 minuten ontwikkelen de fotoresist door het spuiten van een oplosmiddel (2-methoxy-1-methylethylacetaat) met behulp van een sproeier van de hand, en föhnen met stikstofgas.
   4. Plaats het glasplaatje met gedessineerde fotoresist onderin een kunststof schotel.
2. Giet prepolymeren van Polydimethylsiloxaan (PDMS) op de mal met een dikte van 3 mm. Debubble de PDMS prepolymeren in een vacuüm exsiccator bij-800 kPa gedurende 10 minuten.
3. Genezen het PDMS prepolymeren in een oven bij 65 ° C gedurende 1 h. Demold de gedeeltelijk uitgeharde PDMS slab met behulp van een scalpel. Volledig genezen het PDMS in een oven op 120° C gedurende 1 uur.
4. Langs het richtsnoer patroon, trim weg onregelmatige randen van het PDMS slab met de dezelfde scalpel. Maak zo nauwkeurig en schoon een verlaging mogelijk, met name aan de oppervlakte die de invoersleuf (Zie Figuur 1A) voor de pinnen definieert.
5. Perforate 2 mm diameter gaten voor de inlaat/uitlaat in de uiteinden van het belangrijkste kanaal van het PDMS slab met behulp van de biopsie stoten. Evenzo perforate 1 mm-dimeter gaten aan de uiteinden van het luchtkanaal. Zie Figuur 1A voor de lay-out van het kanaal en de positie van deze gaten.

3. assemblage van het apparaat met ter plaatse fabricage van Gap vuller en barrière.

1. Fabriceren een microchannel-vergadering.
   1. Het onderdompelen van een 10 × 20 mm nr.4 dekglaasje in een schoonmaak oplossing verwarmd tot 60 ° C gedurende 10 minuten.
   2. Tweemaal de coverglasses met gedeïoniseerd water spoelen en drogen bij 120 ° C gedurende 10 minuten.
   3. Plasma-bond het PDMS plaat naar een dekglaasje:
      1. Plaats de PDMS plaat (kanaal functie kant omhoog) en de schoongemaakte 10 × 20 mm nr.4 dekglaasje in de Vacuuemcel van een sputter coater.
      2. Start pompen beneden de zaal tot 60 Pa. genereren lucht vacuum plasma (20 mA) voor 30 s.
      3. Onmiddellijk het luchten van de kamer. Bond de kanaal functie kant van het PDMS slab om het dekglaasje met de randen is uitgelijnd.
      4. Plaats de gelijmde lagen in een oven van 65 ° C gedurende 10 minuten.
   4. Breng de gelijmde lagen aan een laminaire kap met behulp van een steriele container. Steriliseren hen met UV-licht voor 30 min.
   5. In de vlakke motorkap, plaats u de pinnen in de sleuf zodat hun uiteinden de andere zijkant van de microchannel vormen. Aangrenzende pinnen moeten afwijken in lengte tot Vermijd contact van beide verticale uiteinden (Zie Figuur 1B). Grote afstand tussen de verticale uiteinden verdient de voorkeur. Een ruimte van (N-1) × (pin breedte) is mogelijk wanneer er N soort pinnen met de pin van verschillende lengten (L in Figuur 2) worden opgesteld.
2. Het fabriceren van een base ( Figuur 2B).
   1. Maken of lezen van een bestand deel van de basis en twee numerieke besturing (NC)-bestanden (die toolpaths bevatten; opgenomen als aanvullend materiaal) met behulp van CAD/CAM software. Het eerste bestand voor aanvullende NC gebruikt een 4 mm diameter einde molen en de tweede een 1 mm-diameter einde molen.
   2. Klem een 3 mm dik helder polymethylmethacrylaat (PMMA) bord op een CNC mill.
   3. Open het eerste NC-bestand op de domeincontroller van een computer NC (CNC) molen. Installeren van een 4 mm einde molen naar de molen CNC en zoek deel nul door het aanraken van de molen van de einde aan het PMMA-bestuur. Voer de code NC te snijden van de Raad van bestuur.
      Opmerking: Blazen af en toe het einde molen puntje met perslucht voor koeling en chip verwijderen.
   4. Herhaal 3.2.3 met behulp van de tweede NC-bestand en een 1 mm einde molen.
   5. Ontvet de machinaal bewerkte onderdelen met afwasmiddel en drogen met een papieren handdoek. Spray de delen met 70% ethanol en breng ze naar een laminaire kap.
3. Het fabriceren van een pin gat vuller en elastomere barrière:
   Opmerking: Stappen 3.3.1 - 3.3.7 moeten aseptisch uitgevoerd worden in een laminar kap.
   1. Bereid kloof vuller door het mengen van witte petrolatum en polytetrafluorethyleen poeder op een 2:1-verhouding van het gewicht. Meng het mengsel met behulp van een ultrasoon homogenizer.
   2. Giet kloof vuller in een dispenser spuit. Invoegen van een zuiger en duw te vullen het puntje van de spuit. Hechten van een naald en duw de plunjer opnieuw tot het uiteinde van de naald is gevuld. Op dezelfde manier bereiden een dispenser spuit met een zuiger en een naald, en vul met siliconen lijm.
   3. Elke injectiespuit verbinden met een pneumatische kitspuit met behulp van een adapter-buis. Aanpassen van de doseer-druk siliconen lijm en vulmiddel tot 250 kPa en 280 kPa.
   4. Afzien van siliconen lijm aan de rand van een zak van de base. Plaats van een 10 × 20 mm No.4 dekglaasje op de zak en druk er stevig aan de band.
   5. Afzien van siliconen lijm tot een diepte van ongeveer 1 mm tot twee segmenten tekenen langs twee buitenste "slots" van de basis. Afzien kloof vuller tot een diepte van ongeveer 1 mm, om de segmenten langs de andere sleuf tekenen.
   6. Siliconen lijm aan de rand van een andere zak afzien. Plaats een microchannel-vergadering (3.1) op de zak en druk er stevig aan de band.
   7. Herhaal 3.3.5 om ervoor te zorgen dat zowel kloof vuller en siliconen lijm volledig de pinnen insluiten en dat er geen opening aan de "slots".
   8. Zet het apparaat in een steriele container zoals een roestvrij stalen doos met deksel. De container overbrengen in een bevochtigde gister verwarmd tot 38 ° C. In de vlakke motorkap, genezen de elastomere barrière voor één dag.
   9. Elk pin tot 1 mm langs aangrenzende pinnen om vrij de pinnen van de uitgeharde elastomere barrière te verplaatsen
   10. Steriliseren van het apparaat met UV-licht voor 30 min.

4. evaluatie van het Microfluidic-apparaat

1. Sporen van lekkage met behulp van fluorescentie
   1. Open de microchannel met een fijn gereedschap of een bureaublad robot. De breedte van het kanaal als consequent door het kanaal mogelijk te maken.
   2. Verdun een groen fluorescente kleurstof met gedeïoniseerd water op 10 µM om fluorescentie oplossing te maken.
   3. Fluorescentie oplossing toevoegen aan een van de poorten van het einde van de microchannel met een micropipettor. Deze stap zal vullen het kanaal met de oplossing.
   4. Zet de microfluidic apparaat en twee stuks absorberend papier nat met gedeïoniseerd water in een grote kunststof schotel. Incubeer de schotel op 37 ° C en 5% CO₂ gedurende ten minste 24 uur.
   5. Groene fluorescentie beelden van de microchannel met een omgekeerde fluorescente microscoop met een Microscoop camera registreren.
   6. Open de fluorescerende afbeeldingen met een passende afbeelding analysesoftware en bevestig dat er is geen lekkage (groene fluorescentie) op het raakvlak van de vuller van de kloof en de pinnen.
2. Zaad-cellen aan de microchannel.
   1. Een cel cultuur vaartuig met 70-80% confluente cellen (afhankelijk van de celtypes) voor te bereiden. Loskoppelen en het opschorten van de cellen in groeimedium.
   2. Centrifugeer de cellen (de snelheid en de tijd afhankelijk celtypes) en het medium gecombineerd.
   3. Resuspendeer de cellen met een kleine hoeveelheid van medium. De cellen met de teller van een cel tellen en aanpassen van de celdichtheid van 1,5 × 10-⁶ tot 1,5 × 10⁷ cellen/mL.
   4. Open de microchannel met een fijn gereedschap of een bureaublad robot (Figuur 1B) om een kanaaloproep rechtstreeks 400-µm-wide. Pin positie zodat de zijwand als platte gedurende het kanaal mogelijk aanpassen. Celsuspensie toevoegt aan een van de haven van het einde van de microchannel en vul het kanaal.
   5. Zoek één van de pinnen die definieert de zijwand van de regio om te beginnen met cultuur. Sluit de twee aangrenzende pinnen om omsluiten cellen in de cel cultuur regio onder een omgekeerde Microscoop.
   6. Sluit alle pinnen uit in volgorde van inner naar buitenste tot uitzetting van alle cellen van het kanaal. Zachtjes gecombineerd van schorsing van de einde-poorten, en voeg medium aan hen.
   7. Incubeer het apparaat zoals beschreven in 4.1.4. Wanneer cellen zijn ongeveer 70-80% confluente, langzaam open een pincode om te verbreden het gebied van cultuur.

Resultaten

De bouw van de herconfigureerbare microchannel is afgebeeld in Figuur 1. Meerdere rechthoekige pennen werden geplaatst op een glazen substraat en werden opgesteld zodat de lange kant van de pinnen in contact waren. Een PDMS blad met geperforeerd gaten en een uitsparing van de dezelfde diepte als de hoogte van de pin bedekt de uiteinden van de pinnen te vormen van het kanaal inlaat/uitlaat reservoirs, kanaal, plafond, en een andere zijwand tegenover de kanaal muur die bestond uit de pinnen. De regio daaromheen pinnen, een muur (een van de gezichten van het PDMS blad) en het glas-substraat vormen één microfluidic kanaal.

Zoals eerder is beschreven, wordt de herconfigureerbaar van het voorgestelde microfluidic systeem bereikt door vele kleine pinnen geplaatst in parallel met zeer klein, maar niet-nulzijnde hiaten. Het probleem in eerdere verslagen was de sterke stroom gegenereerd via de lacunes door de capillaire werking. Om dit probleem te verhelpen, werden eerst de gaten gevuld met een kloof vulmiddel. In dit protocol werd een disperse mengsel van viskeuze koolwaterstof en fluorpolymeer poeder gebruikt als een vuller kloof. Echter, de kloof vuller zelf is ook onderworpen aan de capillaire werking. Daarom, zoals aangegeven in Figuur 1, heeft de resulterende herconfigureerbare microchannel zowel koolwaterstof/fluorpolymeer kloof vuller en een elastomere barrière gevormd rond de buitenste rand van de kloof filler. Uitdunnen van het midden van de pennen is nodig voor een voldoende hoeveelheid kloof vuller om ervoor te zorgen de dikte en sterkte van de elastomere barrière tussen twee pinnen.

Figuur 2 A toont een tekening van een pin die een zijwand segment vormt. RVS kwaliteit 316L werd geselecteerd als het materiaal vanwege zijn corrosiebestendig en lage uitloging van eigenschappen. Er was echter een extra passivering proces vereist de cultuur van de cel van de pinnen om compatibel te maken. Een pincode moet beschikken over een juist rechthoekige tip zonder bramen met succes vormen een zijwand-segment. Een pincode moet bovendien een "handle" zodat de pin kan gemakkelijk worden verplaatst door het indrukken van de handgreep. Omdat elke pin een smalle midden heeft, was de dikte van elastomeer tussen pinnen genoeg om het schuintrekken veroorzaakt door pin verkeer weerstaan. In tegenstelling tot andere delen bestaande uit het apparaat, moet de fabricage van pins, behalve de middelste dunner worden, worden besteld bij een bedrijf dat zich specialiseert in elektrische ontlading machinale bewerking (EDM) omdat het een van de meest nauwkeurige en kosteneffectieve methoden voor het verspanen van kleine onderdelen gemaakt van harde metalen. Uitvoeren van middelste uitdunnen door ETS zelf vermindert de kosten van de bewerking en het risico van buigen of breken tijdens het verspanen.

Om te bevestigen dat de vuller van de kloof, de elastomere barrière, en uiteindelijk de waterdichtheid van de herconfigureerbare microchannel goed functioneren, werd lekdetectie door fluorescentie gebruikt. Figuur 3 toont een beeld van de fluorescentie van het gebied in de buurt van de rand van het elastomere blok 3 dagen nadat de microchannel was gevuld met water met fluorescerende tracer kleurstof. Het beeld van de fluorescentie blijkt dat de vloeistof vullen het kanaal bereikt een diepte van ongeveer 200 µm van de zichtbare rand van de elastomere barrière. Echter, de vloeistof haalde niet de kloof vuller. Bovendien, werd geen lekkage van kloof vuller door de elastomere barrière waargenomen. Deze constatering geeft aan dat de strakke pasvorm tussen de smalle midden van de insteeknokken en elastomere barrière de migratie van de vloeistof door de gaten voorkomen.

Ten slotte, we uitgevoerd langetermijnkweek van de cel met het gebied van de cultuur aangepast door de zijkant van het apparaat herconfigureerbare microfluidic zoals weergegeven in Figuur 4Ageleidelijk uit te breiden. Bij 0 d, waren een klein aantal cellen binnen een ruimte die gelijk is aan een pin-breedte en andere cellen werden aanzuiging beperkt. Op 2 d, de cellen werden gekoppeld aan de onderkant en begon prolifererende. Twee pinnen waren ingetrokken, zodat alle cellen duidelijk zichtbaar, waren hoewel de confluentie nog steeds laag was. Bij 5 d, de cellen blijven vermenigvuldigen en de confluentie verhoogd. Op 6 en 9 d, waren twee andere naalden ingetrokken om te houden van de cellen underconfluent. Het effect van de geleidelijke uitbreiding van de ruimte van de cultuur wordt weergegeven in Figuur 4B. Er waren plotselinge veranderingen in de celdichtheid op de dag dat de kegel werden ingetrokken. Echter de groei van het aantal cellen bleef constant, terwijl die gezien in typische celkweek exponentieel is.

Figuur 1 : Herconfigureerbare microfluidic apparaat met één pin-discretized zijkant aangegeven spanningsindex. (A) delen en de bouw van een herconfigureerbare microfluidic apparaat. Het apparaat heeft een rechte kanaal met één zijwand gevormd door de uiteinden van 10 roestvrij stalen pinnen PDMS/glas microchannel functies ingevoegd. Kloof vuller en een elastomere barrière voorkomt vloeistof lekt door de pin gaten. Coverglasses, gap vuller en de elastomeer barrière zijn bevestigd aan een polymethylmethacrylaat (PMMA) basis. (B) automatische pin manipulator. Een einde effector gemaakt van een blad van metaal is bevestigd aan een 3-as desktop robot. Als u wilt verplaatsen van één pin, duwt het einde effector zijn verticale einde. Pinnen met verschillende lengtes worden geplaatst met een tussenpoos van drie keer de breedte van de pin. Het interval zorgt ervoor dat het einde effector stuurlieden één pin tegelijk met voldoende afstand. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Mechanische tekening van machinaal bewerkte onderdelen gebruikt in het protocol. Eenheden worden uitgedrukt in millimeter; R geeft aan een RADIUS-dimensie; de vierkante (□) symbool vierkante functies; t geeft de dikte aan. (A) een 316 L roestvast stalen pin als onderdeel van de zijkant aangegeven spanningsindex. Pinnen kunnen worden besteld en machinaal zoals beschreven. Uitdunnen van de pin midden hond bot-achtige shapes wilt maken wordt niet weerspiegeld in deze tekening omdat dit niet was besteld als onderdeel van de machinale bewerking maar werd uitgevoerd in het kader van het protocol. (B) een basis voor polymethylmethacrylaat (PMMA) die in het bezit van de coverglasses, gap vuller en elastomere barrière in plaats tegen pin beweging. (C) een schotel voor etsen die wordt gebruikt om het midden van pins etch. Om te bouwen van een schotel etsen, zijn vier stukjes glas gebonden met siliconen lijm. Het patroon van een werklast van siliconen lijm wordt op de schotel gevolgd door de plaatsing van de pinnen op de schotel zoals aangegeven in de tekening getekend. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 : Fluorescentie detectie van het laten weglekken van een herconfigureerbare microchannel via pin gaten. Fluorescentie beeld van groene fluorescente kleurstof vullen de herconfigureerbare microchannel heen wordt weergegeven op een fase contrast beeld van de zegel-structuur, die uit een kloof vulmiddel (ondoorzichtig bestaat) en elastomere barrière (doorschijnend). Een rand van de barrière van elastomeer is zichtbaar als de meniscus-achtige functies en wordt aangeduid met een bovenste stippellijn; de interface tussen elastomeer barrière en gap vuller wordt weergegeven als de meniscus-achtige functies die contact maken met het zwarte gebied en wordt aangegeven door de onderste stippellijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 : Progressieve en continu celgroei met variabele cel cultuur gebied in een herconfigureerbare microchannel. (A) COS-7 celgroei in een cel cultuur gebied beperkt door het bewegen van de zijwanden. (B) groei curve en tijd evolutie van de dichtheid van COS-7 cellen opgesloten in variabele grootte cultuur gebieden in de herconfigureerbare microchannel weergegeven in A). Drie verticale pijlen duiden expansie van de cel cultuur gebied in 2, 5 en 6 d, respectievelijk. Naast de cel de graaf, worden cel dichtheden voor dezelfde cultuur gebieden, individueel op elke exponentiële groeicurve gemonteerd en gebruikt om te schatten van de lokale verdubbeling tijd (t_d van [h]) die wordt weergegeven in de frames weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

De microchannel pin-discretized is een volledig-gekenmerkte microfluidic kanaal, en wij geloven dat er uiteraard hoge herconfigureerbaar in kanaal vorm ten opzichte van alle bestaande microfluidic kanalen. Het protocol dat wij die hier zullen microfluidic apparaten staat van de cultuur van de cel met het geleidelijk uitbreiden van cel cultuur oppervlakte om te houden van de culturen onder confluentie voor een lange duur. Het apparaat biedt tevens in-het-kanaal patronen van cellen zonder patronen van eiwitten op het substraat vooraf of iedere andere overweging op het tijdstip van ontwerp of fabricage. Bovendien, dit herconfigureerbare microfluidic apparaat genereert gemakkelijk sterke in-het-kanaal verplaatsing stroom, die zou helpen bij het implementeren van de behandeling van dergelijke materialen moeilijk-aan-flow dat zeer weinig bestaande microfluidic apparaten kunnen omgaan. Dit betekent dat de interactie tussen de cellen en andere micro-organismen, gassen en andere niet-vloeistoffen kan worden geëvalueerd met behulp van dit apparaat zonder grote wijzigingen in het ontwerp van het apparaat.

We hebben overwogen Laplace druk of hydrostatische toepassen op één inlaat van het kanaal als externe stroom controlemethoden. Wij adviseren niet duwen vloeistof op een doodlopende weg, omdat het zal het genereren van stroom naar het luchtkanaal door de kloof tussen de pinnen en de plafond/vloer van het kanaal. Veel vloeistof operaties vereisen geen dergelijke pin-operaties. Mengen kan bijvoorbeeld worden bereikt door het Maischen vloeistof door een pin (dat wil zeggen, slechts één pin heen en weer meerdere malen verplaatsen).

De meest kritieke onderdelen van het apparaat zijn de pinnen. Precisie in lengte, parallellisme, perpendicularity en oppervlakkwaliteit zijn vereist voor de pinnen, zoals ze een microchannel vormen moeten soepel bewegen moeten en het verkeer van aangrenzende pinnen moeten begeleiden. Daarom is het raadzaam dat de pinnen moeten worden besteld bij een bedrijf dat zich specialiseert in precisie verspanen door het indienen van een tekening vergelijkbaar met Figuur 2. Er kunnen bedrijven die extra geometrische dimensionering vereisen en expliciete oppervlakteruwheid richtingen. Echter, de pinnen zijn herbruikbare als ze zijn met zorg behandeld en af en toe gepassiveerd met salpeterzuur.

De elastomere barrière is een andere belangrijke functie, en de formatie is de meest kritische stap in de fabricage processen van het apparaat. Een juist machinaal base zal nodig zijn om herhaalbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen. Het plaatsen van de pinnen op de niet-uitgeharde barrière is ook een cruciale stap. De pinnen moeten worden gehouden goed uitgelijnd en ingebed in de vuller van de kloof en de barrière zonder luchtbellen. Volgt voorkomen lekkage via de pinnen, die is een gemeenschappelijk probleem met dit microfluidic apparaat.

Andere veelvoorkomende problemen bij het gebruik van dit apparaat zijn een) frictionally ingetogen pinnen, en b) celdood, en lage groei. Mogelijke oorzaken voor deze in een) omvatten ongelijke (taps toelopende of golvende) etsen van de pin midden, slechte kwaliteit van de geëtst oppervlak en dimensionale buitenbeentje tussen de hoogte van de tip pin en de hoogte van de fotoresist laag op een mal voor siliconen platen. Aanpassing van de formulering van de etchant, temperatuur en agitatie kan helpen verbeteren van de pin-verkeer. Daarnaast zorgt proces zonder gebruik te maken van wax of lijm montage tips voor oplossen naar de werkstuk. Mogelijk factoren in b) zijn van onvoldoende passivering van de pinnen, fouten in de selectie van lijmen voor elastomere belemmeringen en onvolledig uitharden van de lijm. Sommige cellen mogelijk coating binnen de microchannel met fibronectine of andere eiwitten of polymeren die cel adhesie bevorderen. Bovendien zal de optimalisatie in de cel cultuur praktijk zoals trypsinebehandeling en centrifugeren dode cellen in de microchannel afnemen.

Een van de beperkingen van het gepresenteerde fabricage-protocol is dat slechts één van de zijwanden is discretized. De herconfigureerbaar van het kanaal zal verder verbeteren als de beide zijwanden zijn gebouwd door pin matrices. Hoewel het dubbele van het bedrag van pinnen en langere fabricage stappen vereist, is dit een technisch haalbare optie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Oven	Yonezawa	MI-100
10% Nitric Acid	Wako Chemicals	149-06845
Stainless steel pins	Micro Giken	N/A	0.3 mm doorsnede, Grade 316L roestvrij staal, wire-cut EDM
Mold release agent	Fluoro Technology	FG-5093SH
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Shin-Etsu Chemicals	KE-106
Negative epoxy photoresist	Nippon Kayaku	SU-8 3050
Coverglasses (Rechthoekig)	Matsunami Glass	26 x 60mm No.4
Acetone	Kanto Chemicals	01060-79
Glass slides (Groot)	Matsunami Glass	76 x 52mm No.1
Silicone adhesive	Shin-Etsu Chemicals	KE-41
White petrolatum	Nikko Rica	Sun White P-1
Polytetrafluoroethylene (PTFE) powder	Power House Accele	Microfluon II
Clear acrylic plate (3 mm-dik)	Various	N/A
Pneumatic dispenser	Musashi Engineering	ML-5000XII
Hydrochloric acid	Kanto Chemicals	180768-00
Computer numerical control (CNC) mill	Pro Spec Tools	PSF240-CNC
End mill (4 mm diameter)	Mitsubishi Materials	MS2MSD0400
End mill (1 mm diameter)	Mitsubishi Materials	MS2MSD0100
Adhesive (chemisch bestendig en lage viscositeit)	Cotronics	Duralco 4460
Borisilicate glasbuisjes	Various		Om HNO3+HCl oplossing (Aqua regia) voor te bereiden. Kies altijd voor borosilicaatglas.
Sodium bicarbonate	Kanto Chemicals	37116-00
Ultrasoon schuimreiniger	AS ONE	AS12GTU
Ultrasoon boor	Shinoda Tools	SOM-121	Wordt gebruikt als een ultrasone homogenisator.
Spin coater	Active	ACT-220DII
Hotplate	AS ONE	ND-1
Photoplotted film (12,700 dpi)	Unno Giken	N/A	Negatieve afbeelding van de uitsparing aan de onderkant van een PDMS plaat worden geplot.
2-methoxy-1-methylethyl acetate	Wako Chemicals	130-10505
UV spot lichtbron	Hamamatsu	L8327	Ultraviolet bron
Nitrogen	Various	N/A
Vacuum desiccator en pomp	AS ONE	MVD-100, GM-20S
Scalpels	Various	No.11
Biopsy punches (1.0mm en 2.0mm)	Kai Medical	BP-10F(1.0m), BP-20F(2.0mm)
Glas graveerpen	Various	N/A
Reinigingsoplossing	Tama Chemicals	TMSC	Verdun 1:100 met gedeïoniseerd water
Sputter coater	San-yu Electron	SC-708	Voor plasma bonding.
Dispenser spuit (5 ml)	Musashi Engineering	PSY-5E
Plunger	Musashi Engineering	FLP-5E
Blunt naald (21G)	Musashi Engineering	PN-21G-B
Adapterbuis	Musashi Engineering	AT-5E
Fermenter	Japan Kneader	PF100
Groene fluorescerende kleurstof (Alexa Fluor 488 carbonzuur)	Thermo Fisher	A33077
Grote plastic schotel	Greiner bio-one	688161
Absorberend papier	Asahi Kasei	BEMCOT M-1
Inverted microscoop	Leica	DMi8
Microscoop camera	Qimaging	Retiga 2000R
Dulbecco gemodificeerd Eagle medium (DMEM)	GE Health Care	SH30021.01
Antibioticum-antimycotisch oplossing	Thermo Fisher	15240-062
Trypsine/EDTA oplossing	Thermo Fisher	25200-056
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)	GE Health Care	SH30256.01
Foetaal bovien serum (FBS)	Biowest	S1820
Celteller	FPI	OC-C-S02
Celkweekvat	VIOLAMO	VTC-D100
15 ml conische buis	Corning	352095
Shop microscoop	PEAK	2034-20
Hand sproeier	FURUPLA	No.3530
Coverglasses (Rechthoekig)	Matsunami Glass	10 x 20mm No.4
CAD/CAM software	Autodesk	Inventor HSM
Stikstof gasdrukregelaar	AS ONE	GF1-2506-RN-V	Instellen op 0.1 MPa