Hierin presenteren wij een snelle, facile en goedkope methode voor het fabriceren van aangepaste Polydimethylsiloxaan mallen die kunnen worden gebruikt voor de productie van hydrogel gebaseerde gemodificeerde weefsels met complexe geometrieën. Daarnaast beschrijven we resultaten van mechanische en histologische evaluaties uitgevoerd op gemanipuleerde cardiale weefsels geproduceerd met behulp van deze techniek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Aangepaste ontworpen weefselkweek mallen van Laser-geëtst meesters
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Zoals het gebied van weefselengineering heeft voortgezet om te rijpen, is er toegenomen belangstelling voor een breed scala van weefsel parameters, met inbegrip van weefsel vorm. Manipuleren van weefsel vorm op de micrometer tot centimeter schaal kan direct Celuitlijning, effectieve mechanische eigenschappen wijzigen en beperkingen met betrekking tot de verspreiding van voedingsstoffen te pakken. Daarnaast kan het vaartuig waarop een weefsel is voorbereid mechanische beperkingen op het weefsel, wat resulteert in stress-velden die verder zowel de cel als de matrix structuur beïnvloeden kunnen geven. Gevormde weefsels met zeer reproduceerbaar afmetingen hebben ook utility voor in vitro testen in welke steekproef afmetingen kritisch, zoals hele weefsel mechanische analyse zijn.
Dit manuscript wordt een alternatieve fabricage methode met behulp van negatieve master mallen bereid uit laser geëtst acryl beschreven: deze mallen voeren goed met Polydimethylsiloxaan (PDMS), ontwerpen met afmetingen op de schaal van de centimeter en functie toestaan maten kleiner dan 25 µm, en kunnen snel ontworpen en gefabriceerd tegen lage kosten en met minimale deskundigheid. De minimale tijd en kosten eisen toestaan voor laser geëtst mallen te snel worden herhaald op tot een optimaal ontwerp is vastgesteld en te gemakkelijk aangepast worden aan een kwantitatieve analyse van belang, met inbegrip van die buiten het gebied van weefselengineering.
Inleiding
In de afgelopen twee decennia, is zachte litho gebruikt uitgebreid als een fabricage techniek ter ondersteuning van wetenschappelijk onderzoek, met name op het gebied van microfluidics, materiaalonderzoek en weefsel engineering1,2, 3. Replica molding, waarin een object met een gewenste vorm wordt gemaakt van een negatieve master mold, biedt een handige en goedkope methode voor het produceren van positieve dat PDMS repliceert die kan worden gebruikt voor het gieten vormige hydrogels. Echter de vereiste negatieve master mallen zijn meestal geproduceerd met behulp van microfabrication-technieken die zijn duur, tijdrovend, beperkt in omvang, en vereisen cleanroom ruimte en geavanceerde apparatuur. Hoewel 3D printen een mogelijke alternatief biedt, is het nut ervan enigszins beperkt vanwege de beperkte resolutie van goedkopere printers en de chemische interacties tussen gemeenschappelijke 3D printer polymeren en PDMS die genezen remmen kan.
Laser cutter systemen die kunnen zowel knippen en etsen van materialen zoals kunststof, hout, glas en metaal geworden onlangs drastisch minder duur en dus toegankelijker voor het fabriceren van onderzoekgereedschappen. Commerciële grade laser scharen zijn geschikt voor het fabriceren van objecten op de schaal van de centimeter met minimale functies kleiner dan 25 µm, en verder vereist minimale opleiding, expertise en tijd om te gebruiken. Terwijl laser ablatie van PDMS eerder in de fabricage van microfluidics apparaten gebruikt is, om onze kennis heeft geen manuscript beschreven een proces door welke millimeter en centimeter schaal mallen kunnen worden vervaardigd uit laser gesneden negatieve master mallen4 .
We hebben deze techniek hoofdzakelijk gebruikt voor het manipuleren van de vorm van gemodificeerde weefsels ter verbetering van de verspreiding van voedingsstoffen, cellulaire uitlijning en mechanische eigenschappen5,6,7. Echter, kan de veelzijdigheid van deze techniek voor het gebruik op elk gebied waar gegoten hydrogels van belang, zoals drug delivery en materiaal wetenschappelijk onderzoek8 zijn. Met toegang tot een laser cutter, PDMS schimmel wordt gerepliceerd kunnen worden gemaakt voor bijna elk meetkunde zonder overhangen (dat zou verwijderen zonder een meerdelige mal, die buiten het bestek van dit manuscript valt remmen) en die past binnen de afmetingen van de laser-bed.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Maak de Vector formaat Master Mold ontwerpen
- Monteren van de geometrie van de gewenste schimmel in vector-formaat met behulp van een vector grafische programma (Zie materialen, uitrusting, en Software tabel). Selecteer bestand | Nieuwe en maak een canvas van passende afmetingen met de kleurindeling RGB. Maak de gewenste geometrie met de vormgereedschappen in het linker deelvenster: Geef de gewenste afmetingen aan de bovenkant van het venster (Klik op de knop omzetten klikt bovenaan als niet in eerste instantie zichtbaar) precies bepalen vorm maten.
Opmerking: Schimmel geometrieën ruimte laten voor ten minste een 6-mm grens tussen de rand van de buitenste functies en de snijlijn zodat trimmen van het PDMS meniscus na mal gieten. Hierdoor zal de afgewerkte mal gelijk met de bodem van een schotel cultuur vast te stellen. Verder, schimmel geometrieën moeten rekening worden overweging beperkingen die zijn gekoppeld aan de laser cutter model dat zal worden gebruikt, met inbegrip van de kerf breedte en minimale grootte. De laser gebruikt voor het werk beschreven hierin (Zie materialen, uitrusting, en Software tabel) featured een breedte van de kerf 0,2 mm en een minimale geëtste grootte van 25 µm (maximale DPI van 1.000). Afmetingen van de schimmel kunnen worden gekozen voor een schip van de gewenste cultuur, zoals een schotel van 10 cm of 6 - of 24-Wells-platen. - Open de Plukker van de kleur in de linker bovenhoek van het venster en definiëren van nieuwe kleurstalen compatibel met de software van de laser cutter.
Opmerking: Wij rood (RGB 255, 0, 0) gebruiken voor het snijden en blauw (RGB 0, 0, 255) voor etsen. Extra stalen kunnen worden gedefinieerd afhankelijk van de eisen voor het ontwerp (bijvoorbeeld, indien meer dan één etsen diepte is gewenst).- Deze staal-kleuren toewijzen aan snijden paden door te selecteren het pad en vervolgens het geslepen staal voor de kleur van de pad en [geen] voor de opvulkleur van de Plukker van de kleur.
- Op dezelfde manier toewijzen staal kleuren ETS paden door te selecteren het object en vervolgens het etsen-pad voor de vulkleur en [geen] voor de pad kleur in de Kleurkiezer.
- Ontwerpen als either.ai or.pdf bestandsindelingen, afhankelijk van de vector graphics programma en laser cutter compatibiliteit (figuur 1A en Aanvullende bestand) opslaan.
2. laser gesneden van de Master acryl mallen
- Selecteer een negatieve master mold-materiaal.
Opmerking: Kwart-inch dik acryl is zeer geschikt voor deze toepassing te wijten aan de verenigbaarheid ervan met lasersnijden, relatief lage kosten, en dikte, die voorziet in functies tot ~ 5,5 mm in hoogte. Echter, andere materialen die voldoen aan de volgende eisen ook mogen worden gebruikt: (i) niet-reactief met het PDMS genezen; (ii) niet-poreuze/sterk lijm uitgeharde PDMS; (iii) snijdt en etsen netjes met een laser cutter; (iv) onderhoudt een glazig staat tot 60 ° C; (v) met een dikte van compatibel met de functie van gewenste maximale hoogte. - De laser cutter voorbereiden snijden volgens specificaties van de fabrikant. Ervoor zorgen dat er voldoende ventilatie is gebruikt en dat de hoogte van het bed is correct gekalibreerd om de gekozen negatieve master mold materiaal dikte.
- Het ontwerp-bestand openen in een grafisch programma van vectoren op de computer is verbonden met de laser cutter en klik op bestand | Print. Zorgen dat de laser cutter is ingesteld als de printer en dat "Schaal niet doen" is geselecteerd in de schalen drop-down menu om te voorkomen dat de vervorming van het ontwerp voordat u klikt op de knop Afdrukken onder in het dialoogvenster Afdrukken.
- In de laser cutter afdrukken hulpprogramma, klikt u op de knop instellingen in de rechter benedenhoek. Kracht, snelheid, en pulsen per inch (PPI) instellingen toewijzen aan elk van de eerder gekozen kleuren knippen/etch parameters instellen voor alle ontwerpfuncties.
Opmerking: Hier, de laser cutter uitgerust met een 75 W laser (Zie materialen, uitrusting, en Software tabel), gebruikte instellingen van de volgende handelingen uit: 100% vermogen, snelheid van 1% en 1000 PPI netjes doorsnijdt met ¼" acryl; 100% kracht, 8% snelheid, en 500 PPI etsen tot een diepte van 2,75 mm acryl; en 100% stroom, 5% snelheid, 500 PPI etsen tot een diepte van 3,50 mm in acryl. Indien onbekend voor een laser cutter configuratie of materiaal, kunnen deze parameters empirisch worden bepaald via trial and error met een proefstuk. - Klik op de grote groene knop in de laser cutter software aan laser etch en knippen van de negatieve master mallen.
- De negatieve master mallen voorbereiden door PDMS gieten door het verwijderen van alle resterende snijden puin met kleine borstels en/of perslucht (figuur 1B).
3. bereid de PDMS mallen voor cel- of weefselkweek
- Bereiden een PDMS gieten mix volgens de specificaties van de fabrikant. Bereiden 0.35 mL/cm,2 van master mold; Dit zal variëren op basis van de functies van de schimmel en de hoogte.
- Degas de bereid PDMS in een vacuuemcel aangesloten op een standaard lab vacuüm lijn (< 500 mmHg) gedurende 1 uur, of totdat alle bubbels zijn afgeschaft.
- Tape de buitenrand van de schimmel met vinyl of plakband (gekleurde label tape werkt goed), zodanig dat de tape doorloopt > 3 mm boven de geëtste gezicht van de negatieve meester mal. Druk op de tape stevig tegen de kant van de mal te lekken later voorkomen.
Opmerking: Als de acryl meester mal functies via-gaten, het kan noodzakelijk zijn toe te passen van tape naar de onderkant van de schimmel zo goed (Figuur 1 c). - De ontgaste PDMS giet de geëtste gezicht van de negatieve meester mal.
Opmerking: Het doel PDMS dikte van de toepassing, afhangen zal hoewel dikke PDMS schimmel bodems kunt aanbrengen imaging uitdagend. Een minimale dikte van ~ 1,5 mm een goed evenwicht tussen imaging overwegingen en het gemak van verwijdering van de schimmel. - Plaats de PDMS beklede negatieve meester mal in een vacuuemcel en ontgas opnieuw gedurende 1 uur, of totdat alle bubbels zijn afgeschaft.
- De ontgaste PDMS beklede negatieve meester mal plaats in een oven van 60 ° C te genezen voor ten minste 6 h. Zorg ervoor dat de oven shelf niveau is. Anderzijds laat de PDMS te genezen bij 37 ° C's nachts of bij kamertemperatuur voor ~ 72 h.
- Als meerdere mallen werden geworpen op de dezelfde negatieve meester mal, gebruikt u een razorblade te snijden deze mallen uit elkaar terwijl ze nog op de negatieve meester mal. Schil vervolgens elke PDMS schimmel off van de negatieve meester mal. Zorgen dat PDMS mallen zijn geïnd, langzaam en zorgvuldig om te voorkomen dat schimmel functie scheuren tijdens collectie.
- Met een scheermesje, trim uit regio's met de meniscus van gieten, zou die voorkomen dat de schimmel uit liggen plat, evenals ieder overtollig materiaal of puin (Figuur 1 d).
- Indien nodig, bereid mallen voor het gieten van de cellen/weefsels in autoclaaf.
4. Zet de collageen en fibrine Hydrogel weefsels
Opmerking: Gebruik een goede aseptische procedure te handhaven van de steriliteit.
- Houden de mallen aan de onderkant van het gewenste schip. Nieuwe mallen aan de onderkant van een niet-Weefselkweek behandeld plaat houden door stevig op de schimmel tegen de onbehandelde plastic (als gevolg van de hydrophobicity voor PDMS) te drukken.
Opmerking: Als-Weefselkweek behandeld polycarbonaat is echter om te worden gebruikt, of in het geval van hergebruikt mallen, die de neiging om minder stevig vasthouden, een natuurlijke of synthetische lijm (zoals fibrine of silicone sealant genezen 's nachts) kan worden gebruikt om de bijlage. - Bereiden fibrinogeen, trombine en geneutraliseerde collageen gieten oplossingen zodanig dat de gewenste concentratie van elk zal worden bereikt in het weefsel van de cast. Houden van collageen op ijs totdat gieten.
Opmerking: Fibrinogeen en trombine moeten niet toegestaan te mengen tot op het ogenblik gieten. Indien nodig, kunnen de fibrinogeen en trombine oplossingen ook worden gekoeld te verhogen van de polymerisatie-tijd. We hebben gebruik gemaakt van een definitieve fibrinogeen concentratie tussen 0-8 mg/mL, een definitieve trombine concentratie tussen 10-100 U/mL, en een laatste collageen concentratie tussen 0,8 - 2,0 mg/mL (Figuur 2). Voor gemanipuleerde cardiale weefsels, gebruiken we vaak cardiomyocytes bij 12 x 106 cellen/mL met 1,6 mg/mL, 4 mg/mL fibrinogeen en 20 U/mL trombine (trombine wordt toegevoegd vóór gieten). Optimale concentraties (ook buiten deze voorgestelde bereiken) moeten empirisch worden bepaald. - Oogsten van cellen standaard protocollen en resuspendeer bij een concentratie te bereiken van de gewenste oorspronkelijke celdichtheid in het weefsel van de cast.
Opmerking: Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige cardiomyocytes zijn geoogst zoals beschreven in Lian et al. 9 Houd de geoogste cellen op ijs. Cel volume dient te worden verwerkt bij de voorbereiding van de celsuspensie. We hebben gebruikt cel concentraties variërend van 9-18 x 106 cellen/mL, al optimaal bereiken worden verwacht om te variëren met celpopulatie (Figuur 2). - Combineer de fibrinogeen, geneutraliseerde collageen, en celsuspensie (zie stap 4.2 voor een voorbeeld) om het maken van een mix van gieten. Houd de gieten-mix op ijs.
Opmerking: Fibrinogeen en trombine temperaturen en concentraties bepalen polymerisatie kinetiek; om te voorkomen dat polymerisatie tijdens casting, wellicht te bereiden afzonderlijke batches van de casting mix afhankelijk van het aantal en het volume van de constructies die zal worden uitgebracht. - Behandelen van de oppervlakken van de schimmel die zal worden blootgesteld aan de casting mix te verzachten PDMS hydrophobicity (PDMS hydrophobicity zal verhogen van de eiwit adsorptie en gieten bemoeilijken).
- Hydrofiele oppervlakte modificatie bereiken door te behandelen met zuurstof plasma, zoals met een handheld hoge frequentie generator (bijvoorbeeldBD-20A van Litton Engineering). Alle oppervlakken van de schimmel die contact maken met het mengsel van de cel/gel voor de behandeling van plasma voor 3-5 s, ongeveer 5 min vóór gieten bloot.
- U kunt ook behandelen met een oppervlakteactieve stof, zoals Pluronic F-127 (1% w/v)10. Voer de oppervlaktebehandeling als de casting time dicht mogelijk benadert, zoals de verandering van polariteit na verloop van tijd verslechteren zal.
- Onmiddellijk voorafgaand aan de casting, de trombine aan toevoegen de casting mix en meng grondig door pipetteren omhoog en omlaag zonder bubbels.
- De casting mix werkt snel, Pipetteer in de mallen, met behulp van zorg te storten de mix in alle hoeken en spleten van de schimmel. Vermijd Pipetteer uitwerpen buiten de eerste halte luchtbel vorming binnen de constructies te voorkomen.
- Herhaal stap 4.6 en 4.7 desgewenst voor extra batches van gieten mix.
- Plaats het vaartuig weefselkweek in een incubator 37 ° C gedurende 45 minuten. Als de incubator niet goed bevochtigde is, Kluisje cel media rond de mallen vóór incubatie om construct uitdroging te voorkomen.
Opmerking: Het type cel media zal afhangen van celtype, maar voor gemanipuleerde cardiale weefsel constructies gebruiken we RPMI 1640 + B27 supplement. - Na 45 min, keren de constructies naar de kap en de cover met cel media voordat hij terugkeerde naar de incubator.
- Wijzigen van de cel media elke 48-72 uur nodig hebt voor de cel en type op te bouwen.
Opmerking: Media verandering moet worden gepland volgens de instructies van de aanbevolen door de leverancier verstrekt om ervoor te zorgen maximale cell gezondheid. Wees voorzichtig bij het wijzigen van de media om te voorkomen dat de verstoring van de constructies. Wij hebben geen problemen ondervonden met drijvende constructies, maar als dit gebeurt, kan het bij hoge posten toe te voegen aan het ontwerp van de schimmel die verder reiken dan het niveau van de media worden verhinderd. - Na gebruik wassen de mallen opeenvolgend met 10% bleekwater, 70% ethanol, en gedestilleerd water. Dan lucht droog, en autoclaaf voor hergebruik tot ~ 10 keer.
5. analyse technieken: Weefsel verdichting
Opmerking: Verdichting als gevolg van het remodelleren van de matrix is een indicator van weefsel levensvatbaarheid en ontwikkeling die gemakkelijk kan worden gemeten door middel van optische microscopie en beeld-analyse.
- Het verzamelen van beelden van de optische microscopie van de constructies in de mallen op tijd stappen variërend van 2 h tot 96 uur na gieten.
Opmerking: Als gevolg van de geringe mate van vergroting nodig, een dissectie Microscoop met een camera mount is geschikt voor deze toepassing. - Het zichtbare construct gebied in een afbeelding analyse suite zoals ImageJ traceren (open bron, imagej.nih.gov/ij/).
- Het analyseren van het tarief en de definitieve van de mate van verdichting (Figuur 2).
6. analyse technieken: Treksterkte testen
Opmerking: Beide actieve mechanica (krachten of stammen die zijn gegenereerd door een gemanipuleerde weefsel als gevolg van activiteiten van de cel) en passieve mechanica (krachten of stammen gegenereerd in reactie op toegepaste stammen of krachten) zijn kritische functionele eigenschappen van veel ontworpen weefsels, en dit geldt met name voor gemanipuleerde cardiale weefsels. De micromechanische analyzer gebruikt voor de analyses wordt beschreven in de Tabel van materialen. Andere mechanische testen toestellen kunnen ook worden toegepast door ervan uitgaande dat ze toestaan om gehydrateerd te testen en lengte controle staat en metingen via bereiken en resoluties relevant zijn voor het weefsel afdwingen. Voor weefsels met transversale gebieden over de volgorde van enkele vierkante millimeters en stiffnesses over de volgorde van tientallen kPa is een 5 mN lading cel een goede pasvorm. Grotere en zwaardere materialen zou vereisen een grotere belasting-cel. Vóór de test, zien erop toe dat zowel de kracht transducer en lengte controller correct zijn gekalibreerd.
- Inschakelen van de controller van de lengte, kracht transducer, pulse generator en temperatuurregelaar.
- Vul de mechanische testen trog met Tyrode de oplossing (calciumchloride 1,8 mM, 1,0 mM magnesiumchloride 5.4 mM kaliumchloride, 140 mM natriumchloride, natriumfosfaat 0.33 mM, 10 mM HEPES en 5 mM glucose in ddH2O, pH aangepast aan 7.4) voor Engineered cardiale weefsels. Stel de thermokoppel zo in dat een bad temperatuur van 37 ° C wordt bereikt.
- Het laden van een mechanische testen protocol voor het verzamelen van gegevens van de actieve contractie.
Opmerking: We hebben geëvalueerd actieve contractiele mechanica met behulp van een lengte stap protocol welke lengte stappen in 5% belasting wordt verhoogd tot 30% worden gehouden voor 120 s te evalueren van het effect van druk op contractie kracht (figuur 3A). Daarnaast hebben we passieve mechanische eigenschappen via een pull-naar-break-protocol met de snelheid van een constante spanning van 10% stam/min (figuur 3B) geëvalueerd. Beide van deze protocollen kunnen dienen als goede aanknopingspunten voor actieve en passieve mechanische analyse. - Onder de werkingssfeer van een dissectie, loskoppelen zorgvuldig de gemanipuleerde weefsel constructie van het PDMS schimmel, zodanig dat het vrij zweeft.
Opmerking: Cellularized constructies die hebben ondergaan weefsel verdichting zal waarschijnlijk al worden losgekoppeld van de interieur schimmel oppervlakken, en in die gevallen minimaal manipulatie is vereist.- Als verdichting niet geleid tot de constructie om vrij te geven heeft, gebruik pincet te voorzichtig het scheiden van de constructie van de zijkanten en onderkant van de schimmel om te voorkomen beschadiging van het weefsel.
- Met pincet, zachtjes pick-up van de constructie en het overbrengen van de mechanische testen bad.
- De constructie bekijken door een Microscoop dissectie, mount beide uiteinden van de constructie aan de haken bevestigd aan de kracht transducer en hefboom arm.
- Pas de hendel arm positie met behulp van de micromanipulator totdat de constructie zonder toegepaste spanning wordt geplaatst. De controller van lengte nul en dwingen controller.
- Het imago van de constructie door de dissectie werkingssfeer zodat de afmetingen van de constructie kunnen worden gemeten via beeldanalyse.
- Het actieve kracht-protocol starten en sla de verzamelde gegevens nadat het protocol is voltooid (Figuur 3).
- Als passieve mechanische gegevens eveneens vereist zijn, passen de hendel arm opnieuw zolang er geen nul toegepaste spanning. De lengte nul en dwingen controllers en de constructie een tweede afbeelding de criteria tijdig vóór het laden en het initiëren van het passieve mechanica protocol (Figuur 3). De verzamelde gegevens opslaan.
7. analyse techniek: Paraffine histologie en Immunohistochemistry
Opmerking: We hebben het grootste succes in imaging gemanipuleerde weefselsecties met paraffineblokken zodat weefsel morfologie is best bewaard gebleven. Alle stappen van het proces moeten zorgvuldig worden beschouwd en worden afgestemd op de gemanipuleerde weefsel, met inbegrip van de verwerking van de monsters zonder vacuüm of druk, empirisch bepalen van de juiste antigeen ophalen methoden en titrating van het primaire antilichaam concentratie. Andere technieken, zoals het gebruik van bevroren blokken voor het voorbereiden van dia's, wellicht minder tijd en kosten terwijl voldoende resultaten afhankelijk van de beoogde toepassing oplevert.
- Onder de werkingssfeer van een dissectie, loskoppelen zorgvuldig de gemanipuleerde weefsel constructie van de mal van de PDMS met pincet gleed tussen de constructie en de PDMS zachtjes scheiden van het PDMS, zodanig dat het vrij zweeft. Deze constructies overbrengen in een microcentrifuge buis voor de fixatie.
Opmerking: Kwetsbare constructies of die vast te stellen onder de voorwaarde van de statische stress geboden door de schimmel zelf kunnen worden vastgesteld in de mal door oplossingen in de cultuur ook wijzigen en verwijderen van de constructie van de schimmel na fixatie. - Onmiddellijk oplossen de gemodificeerde weefsels door dompelen in 4% paraformaldehyde (PF) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Schatten van niet meer dan 1 h per 1 mm met de dikte van het weefsel; niet overdreven oplossen.
- Spoel de weefsels met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Het weefsel nat te houden, breng een druppel van eosine daarop voor vlek het roze voor 10-30-s en daarna spoelen met 70% ethanol.
Opmerking: De roze kleur helpt om het te identificeren in het blok van de paraffine voor later afdelen en zal weggewassen worden tijdens deparaffinization. - Wikkel het weefsel in de lens papier en plaats in een cassette histologie. Schuim pads in de cassette gebruiken zo nodig om het weefsel plat.
- Het onderdompelen van de cassette in 70% EtOH en bewaren bij 4 ° C tot klaar voor verwerking van paraffine.
- Het verwerken van het weefsel door het drogen in de toenemende concentraties van ethanol (2 x 30 min elke 70, 95 en 100%). Vervolgens Baden monsters in drie opeenvolgende xyleen baden voor elke 30 min.
- De monsters in drie opeenvolgende paraffine baden voor elke 30 min. onderdompelen.
- Opwarmen van de cassettes, zorgvuldig ontvouwen en het weefsel eosine gebeitste verwijderen uit het document van de lens en het weefsel van paraffine-geïnfiltreerd insluiten in een blok van paraffine. Wees voorzichtig met het monster lag plat op de bodem van de mal om gemakkelijker segmenteren.
- Afdeling van de weefsels gebruikend microtome zoals gewenst (5-8 µm dik) en vlek met behulp van standaardprocedures geoptimaliseerd voor de gemanipuleerde weefsel (Figuur 4).
Opmerking: Een alternatief voor paraffine secties is het gebruik van bevroren blokken, hoewel de morfologie van het monster kan worden aangetast. Plaats de vaste constructies in 30 gewichtspercenten sacharose in PBS gedurende 3U of totdat het monster geëquilibreerd (bijvoorbeeld's nachts wordt). Wisselen van de oplossing met 50/50 v/v 30% sacharose en optimale scherpe temperatuur (OCT) bevriezing van medium voor 1 h. de constructies in bevroren blokken met LGO bevriezing medium gebruik van een 70% EtOH met droogijs drijfmest voor snelle blok ingevroren in plastic bakjes. Sectie de blokken met een cryostaat 10-50 µm dik secties.
8. analyse techniek: Celuitlijning
Opmerking: Manipuleren van de vorm van het weefsel en de interne stress velden kunt moduleren Celuitlijning, een kenmerkend van vele inheemse weefsels.
- Bereiden de gemanipuleerde weefsel constructies in PDMS mallen met geometrieën van belang.
- Aan het einde van de periode van de cultuur, de constructies te wassen in PBS, fix in 4% PF (zie stap 7.2) en oogsten van constructies voor te bereiden voor beeldvorming door segmenteren en histologie (zie sectie 7) of hele mount kleuring.
Opmerking: Hele mount kleuring volgt soortgelijke stappen naar histologie/immunohistochemistry maar vereist langere incubatietijd en de diepte van de penetratie van kleurstoffen, de antilichamen en geen beeldvormende technieken (zoals lichte indringingsdiepte in de constructies) zal behoeft te worden empirisch vastgesteld voor de samenstelling van de constructie. - De weefselsecties in het horizontale vlak (parallel aan het vliegtuig van de bodem van schimmel) oriënteren en vlek voor een marker voor de cel van belang. Gebruik een f-actine-label, zoals phalloidin, te markeren de actine stress vezels van meeste celtypes. Ook gebruiken een specifieke marker van de cel.
Opmerking: In het geval van gemanipuleerde cardiale weefsels, geaardheid werd bepaald door sarcomeres gekleurd met α-actinin. - Beoordelen van de hoofdas van alle cellen of kernen in de regio van belang handmatig of met behulp van een analyse tool (bijvoorbeeldImageJ, MATLAB).
Opmerking: Het kan nuttig zijn te categoriseren van verschillende regio's van de dezelfde constructie, afhankelijk van de geometrie zoals ("knooppunt" en "bundel" regio's in een gaas-achtige geometrie, of de "kern") en "edge" in een circulaire geometrie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De optiek van de laser cutter geëtste gebieden te zijn zeer licht gedaald afmetingen als de etsen van de verhogingen van de diepte zal veroorzaken, en resultaten in schimmel muren met een heel subtiel schuine kant, wijten aan taps toelopende van de laserstraal. Dit zal helpen de opheffing vergemakkelijkt van de cast PDMS mallen, maar moet zorgvuldig worden overwogen als zeer diep geëtst negatieve master mallen (> 6 mm) zijn vereist (Figuur 1).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Aangepaste PDMS schimmel geometrieën die compatibel met weefselkweek zijn hebben groot nut bij het afstemmen van belangrijke gemanipuleerde weefsel eigenschappen, zoals de celuitlijning, diffusie tarief en effectieve stijfheid. Deze mallen zijn bovendien zeer nuttig voor het voorbereiden van weefsels voor analyse toepassingen waarin geometrie belangrijk, zoals mechanische testen16,17 is. Voorbereiding van deze apparaten van laser gesneden negatieve master mallen ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen financiering van NIH R00 HL115123 en Brown University School of Engineering. Ze zijn ook de bruin Design Workshop en Chris Bull dankbaar voor training en ondersteuning met de laser cutter.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Item | |||
| Bovine fibrinogeen | Sigma | F8630-5G | Constructs |
| Bovine trombine | Sigma | T6634-250UN | Constructs |
| Bovine aprotinine | Sigma | 10820-25MG | Constructs |
| Rat tail collageen I, 4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | Constructs |
| Sodiumchloride | Fisher | BP358-10 | Constructs |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | Constructs |
| Fijne pincetten | Fine Science Tools | 11252-20 | Constructs |
| Sylgard 184 siliconen elastomeer | Corning | 4019862 | PDMS Mallen |
| Lab tape | Fisher | 15-901-5R | PDMS Mallen |
| Acrylic, 1/4" dik | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS Mallen |
| HEPES Buffer, 1 M | Sigma | H3537-100ML | Constructs |
| RPMI 1640 medium, poeder | Fisher | 31800-089 | Constructs |
| Calciumchloride dihydraat | Fisher | AC423520250 | Constructs |
| Magnesiumchloride hexahydraat | Fisher | M33 500 | Constructs |
| Kaliumchloride | Sigma | P9541-500G | Constructs |
| Natriumfosfaat dibasisch heptahydraat | Sigma | S9390-500G | Constructs |
| Glucose | Sigma | G5767-25G | Constructs |
| OCT | VWR | 25608-930 | Histologie |
| Gevroren blok mallen | VWR | 25608-916 | Histologie |
| Hematoxylinen | Fisher | 3530 1 | Histologie |
| Eosine Y | Fisher | AC152880250 | Histologie |
| Fast groen FCF | Fisher | AC410530250 | Histologie |
| Software | |||
| Illustrator | Adobe Systems | Vector Graphics | |
| Inkscape | (Open Source) | Vector Graphics | |
| UCP (Universal Control Panel) | Universal Laser Systems | Laser Cutter Interface | |
| Equipment | |||
| PLS6.75 Laser Cutter | Universal Laser Systems | Laser Cutter | |
| Micromechanical Analyzer | Aurora Scientific | 1530A met 5 mN laadcel | Mechanische Analyse |
Referenties
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, 491(2010).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater. Today. 8, 50-56 (2005).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
- Isiksacan, Z., Guler, M. T., Aydogdu, B., Bilican, I., Elbuken, C. Rapid fabrication of microfluidic PDMS devices from reusable PDMS molds using laser ablation. J. Micromechanics Microengineering. 26, 035008(2016).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for Tissue Engineering. Chem. Rev. 101, 1869-1880 (2001).
- Kloxin, A., Kloxin, C., Bowman, C., Anseth, K. Mechanical properties of cellularly responsive hydrogels and their experimental determination. Adv. Mater. Deerfield Beach Fla. 22, 3484-3494 (2010).
- Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31, 6941-6951 (2010).
- Jaiswal, M. K., et al. Vacancy-Driven Gelation Using Defect-Rich Nanoassemblies of 2D Transition Metal Dichalcogenides and Polymeric Binder for Biomedical Applications. Adv. Mater. 29, (2017).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat. Protoc. 8, 162-175 (2013).
- Boxshall, K., et al. Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly(dimethylsiloxane) micro-bioreactor. Surf. Interface Anal. 38, 198-201 (2006).
- Pins, G. D., Christiansen, D. L., Patel, R., Silver, F. H. Self-assembly of collagen fibers. Influence of fibrillar alignment and decorin on mechanical properties. Biophys. J. 73, 2164-2172 (1997).
- Pipan, C. M., et al. Effects of antifibrinolytic agents on the life span of fibrin sealant. J. Surg. Res. 53, 402-407 (1992).
- Roberts, M. A., et al. Stromal Cells in Dense Collagen Promote Cardiomyocyte and Microvascular Patterning in Engineered Human Heart Tissue. Tissue Eng. Part A. 22, 633-644 (2016).
- Ye, K. Y., Sullivan, K. E., Black, L. D. Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering. JoVE. , (2011).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue Engineering of a Differentiated Cardiac Muscle Construct. Circ. Res. 90, 223-230 (2002).
- McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded Gelatin Hydrogels for Extended Culture of Engineered Cardiac Tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
- Hu, J. J., Chen, G. W., Liu, Y. C., Hsu, S. S. Influence of Specimen Geometry on the Estimation of the Planar Biaxial Mechanical Properties of Cruciform Specimens. Exp. Mech. 54, 615-631 (2014).
- Munarin, F., Kaiser, N. J., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Laser-Etched Designs for Molding Hydrogel-Based Engineered Tissues. Tissue Eng. Part C Methods. 23, 311-321 (2017).
- Zhang, H., Chiao, M. Anti-fouling Coatings of Poly(dimethylsiloxane) Devices for Biological and Biomedical Applications. J. Med. Biol. Eng. 35, 143-155 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
