Dit protocol beschrijft een minimaal invasieve osteosynthese techniek met een schroef intramedullaire voor gestandaardiseerde stabilisatie van fracturen van het dijbeen, die kan worden gebruikt voor het analyseren van endochondral bot genezing in muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een minimaal invasieve Model voor het analyseren van Endochondral fractuur genezing in muizen onder gestandaardiseerde condities van de biomechanische
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Bot helende modellen zijn noodzakelijk om te analyseren de complexe mechanismen van breuk genezing ter verbetering van de klinische fractuur behandeling. Tijdens de afgelopen tien jaar, werd een toenemend gebruik van Muismodellen in orthopedische onderzoek opgemerkt, waarschijnlijk omdat Muismodellen een groot aantal genetisch gemodificeerde stammen en speciale antilichamen voor de analyse van de moleculaire mechanismen van breuk genezing bieden. Om te controleren de biomechanische voorwaarden, zijn goed gekarakteriseerd osteosynthese technieken verplicht, ook bij muizen. Wij rapporteren hier, over het ontwerp en gebruik van een gesloten bone genezing model te stabiliseren dijbeen breuken in muizen. De intramedullaire schroef, gemaakt van medisch-grade roestvrij staal, zorgt voor een axiale en rotatie stabiliteit in vergelijking met de meest gebruikte eenvoudige intramedullaire pinnen, waaruit een compleet gebrek aan axiale en rotatie stabiliteit door breuk compressie. De stabiliteit bereikt door de intramedullaire schroef staat de analyse van endochondral genezing. Een grote hoeveelheid eelt weefsel, ontvangen na stabilisatie met de schroef, biedt ideale omstandigheden voor de oogst van weefsel voor biochemische en moleculaire analyses. Een ander voordeel van het gebruik van de schroef is het feit dat de schroef in het dijbeen met een minimaal invasieve techniek zonder schade aan de weke delen kan worden ingevoegd. Kortom, is de schroef een unieke implantaat dat idealiter kan worden gebruikt in gesloten fractuur genezing modellen bieden gestandaardiseerde biomechanische condities.
Inleiding
Bot helende studies in muizen zijn in grote vraag vanwege een breed spectrum van antilichamen en genetisch gemodificeerde dieren. Deze feiten kunnen bestuderen van de moleculaire mechanismen van genezing1bot. Verschillende bot genezing modellen voor muizen zijn ontwikkeld in de afgelopen jaren,2. Deze modellen kunnen worden onderverdeeld in open modellen, die het bot is osteotomized met behulp van een open benadering van de laterale chirurgische en gesloten modellen, waarin het bot gebroken is gebaseerd op het model van de fractuur geïntroduceerd door Bonnares en Einhorn3. Met deze techniek kan een gestandaardiseerde dwarse breuk kan worden geproduceerd door een 3-punts buigende apparaat en intramedullaire implantaten kunnen worden ingebracht via een kleine mediale parapatellar snede in een minimaal invasieve techniek die het vermijden van een grote zachte weefseltrauma.
De intramedullaire schroef kan worden toegepast voor gesloten fractuur stabilisatie in muizen. De schroef biedt rotatie- en axiale stabiliteit. Dit wordt bereikt door compressie van de fractuur door een proximale draad en een distale hoofd4. Verdere voordelen van de schroef zijn de eenvoudige chirurgische techniek, de lage graad van invasivity, het lage gewicht en, vooral, een hogere stabiliteit bieden gestandaardiseerde en gecontroleerde biomechanische voorwaarden ten opzichte van andere intramedullaire implantaat 5implantaten. In feite, in de meest gesloten fractuur-modellen, de fragmenten zijn gestabiliseerd alleen door eenvoudige pinnen, die wordt geassocieerd met een compleet gebrek aan rotatie- en axiale stabiliteit en een hoog risico van pin en ook breuk dislocatie. Dit kan het genezingsproces, wat leiden vertraagde genezing of de vorming van de niet-geheelde tot kan aanzienlijk beïnvloeden.
Het is algemeen bekend dat de stabiliteit van de fractuurfixatie een enorme impact op het helende proces6,7 heeft. Een hoge stijve fixatie resulteert in intramembranous genezing, terwijl een minder rigide fixatie, die mogelijk is micromovements in de kloof van de fractuur, in endochondral genezing resulteert. Stabilisatie van de breuk met de intramedullaire schroef toont hoofdzakelijk een endochondral genezing met een grote hoeveelheid eelt weefsel, met name na 2 weken van breuk genezing. De mogelijkheid om te oogsten van een grote hoeveelheid eelt weefsel maakt de analyse van veelvoudige parameters door verschillende technieken.
Wij rapporteren hier, over het ontwerp en de toepassing van de intramedullaire schroef in muizen, alsmede op de voor- en nadelen in experimentele studies op normale endochondral bot genezing.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health voor het gebruik van proefdieren en institutionele richtsnoeren (Landesamt für Verbraucherschutz, Zentralstelle Amtstierärztlicher Dienst, Saarbrücken, gevolgd Duitsland).
1. bereiding van chirurgische instrumenten en implantaten
- Selecteer een scalpel blad (grootte 15), een klein doekje, fijne pincet, een 27 G naald, een 5-0 niet-resorbeerbare hechtdraad, schaar en de houder van een naald in de microchirurgische instrument.
- Pak de intramedullaire schroef, de begeleidingskabel (0,3/0,2 mm diameter, lengte 10 cm), de centreren boor (0,5 mm diameter) en de hand-boor (Figuur 1; Zie Tabel van materialen).
Opmerking: De intramedullaire schroef (0,5 mm diameter, 17.2 mm lengte) is gemaakt van medisch-grade roestvrij staal voor retrograde implantatie in het dijbeen. De schroef is een proximale draad (0,5 mm diameter, lengte 4 mm) met een neus (0,2 mm diameter, 0,4 mm lengte) bij het uiteinde en de distale conus-vormige hoofd (0.8 mm diameter, 0,9 mm lengte) tot fractuur compressie evenals axiale en rotatie stabiliteit. - Bloot de implantaten en alle chirurgische instrumenten tot een desinfecterende oplossing (96% alcohol) voor 5 min en steriliseren van hen (stoomsterilisatie, 130 ° C, 25 min.). Na desinfectie of sterilisatie, plaats u de instrumenten op een doek van de operatie. Plaats de operatie doek direct aan de kleine dierlijke operatie tabel.
2. dieren, anesthesie en analgesie
- Kies de stam, leeftijd en geslacht van de muizen volgens de vraag van de studie die is gericht.
Opmerking: Deze studie 12 - tot 14-week-oude mannelijke CD-1 mice werden gebruikt. Het juiste lichaamsgewicht te gebruiken de intramedullaire schroef is tussen 25-35 g. - Anesthetize van de muizen met een intraperitoneale injectie van 15 mg/kg xylazine en 75 mg/kg ketamine. Bevestig de afstomping door teen snuifje. Toepassing oog smeermiddel om te voorkomen dat de dieren ogen drogen tijdens anesthesie. Na de inductie van de anesthesie, plaatst u de muisaanwijzer onder een warmte-radiator de lichaamstemperatuur constant te houden. Tijdens de procedure werden dieren gecontroleerd met herhaalde teen snuifje om een geschikt vliegtuig van de verdoving.
- Tramadol-hydrochloride in het drinkwater (1.0 mg/mL) solliciteren door analgesie vanaf dag 1 vóór de operatie tot dag 3 na de operatie.
Opmerking: Analgesie en infectie preventie moet in overleg met de respectieve richtsnoeren voor het land en de instelling waar de experimenten moeten worden uitgevoerd.
3. de chirurgische ingreep en intramedullaire schroef implantatie
- Voor de operatie, de hele rechts achterpoot scheren en een ontharende room van toepassing. Na 5 min, verwijder de crème en het been met water schoon. Vervolgens passen een desinfecterende oplossing met 96% alcohol. Betadine of chloorhexidine kan worden toegevoegd aan de alcohol om ervoor te zorgen volledige asepsis.
- Onder aseptische condities, plaatst u de muisaanwijzer op de liggende positie van de kleine dierlijke operatie tabel. Buig de rechterknie te voorzien in een anterieure benadering van de condyles van de knie. Het uitvoeren van een 5-mm mediale parapatellar incisie aan de rechter knie met behulp van het scalpel blad.
- De Patellaire ligament zorgvuldig met het mes van de scalpel en het staafje te mobiliseren. Vervolgens shift de knieschijf lateraal met de fijne pincet bloot de intercondylar inkeping van het dijbeen.
- Open de intercondylar inkeping precies in het midden van het dijbeen tussen beide condyles. Zorg ervoor dat niet hoger is dan 1,0 mm in diepte voor de boor gat.
- Start handmatig boren op een langzame snelheid en een verschuiving van de 45 ° ventrally aan de as van de dijbeen met behulp van de 0.5 mm centreren boor en de hand-boor (Figuur 1 c en D, Figuur 2). Tijdens het boren, continu verminderen de hoek 0 ° offset (parallel met de as van het bot van het dijbeen). Stoppen met boren wanneer een diepte van 1,0 mm wordt bereikt.
- Na het openen van het bot op de intercondylar inkeping, plaatst u de 27 G naald in de intramedullaire Holte over de hele lengte van het dijbeen. Pak de intramedullaire holte van het dijbeen handmatig via roterende bewegingen van de 27 G naald. Duw de naald uit de corticaal bot op de grotere trochanter proximally perforate.
- Verwijderen van de 27 G naald en toepassen van de begeleidingskabel door het distale deel van het dijbeen.
- Een huid incisie maken met een scalpel mes (grootte 15) proximally over de begeleidingskabel en begeleidingskabel vooruit totdat beide uiteinden van de begeleidingskabel vallen. Zorg ervoor dat de begeleidingskabel in plaats te houden.
- Maak een gedefinieerde gesloten fractuur met behulp van de guillotine.
- Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in zijligging met het rechterbeen onder de guillotine. Zorg ervoor dat het diaphyseal deel van het dijbeen is geplaatst in het midden van de guillotine.
- Het gewicht (200 g) uit de gedefinieerde afstand van 25,5 cm neerzetten.
- Controleren van de configuratie van de fractuur, evenals fractuur positie en de positie van de begeleidingskabel (Figuur 3) met behulp van de x-ray-apparaat (Zie Tabel van materialen).
- Sluit de intramedullaire schroef met de neus op de distale einde aan de begeleidingskabel 0,2 mm en plaatst u deze in het dijbeen onder continue druk en rechtsom draaien.
- Schuintrekken van de Aandrijfas/Cardanas wanneer het voldoende koppel wordt bereikt.
- De begeleidingskabel proximally verwijderen.
- Verplaatsen van de patella en het monteren van de pees van de patella naar de spieren met één enkele hechtdraad met behulp van een 5-0 synthetische monofilamenten, nonabsorbable polypropyleen hechtdraad. Gebruik enkele hechtingen van hetzelfde materiaal en dezelfde afmetingen om te sluiten van de wond. Controle van de vermindering van de fragmenten en de positie van de schroef radiologisch met behulp van de x-ray-apparaat (Zie Tabel van materialen).
- De dieren onder de hitte radiator houden totdat ze van anesthesie herstellen. Laat niet de dieren zonder toezicht totdat ze hebben herwonnen voldoende bewustzijn te handhaven ventrale ligcomfort. De dieren terugkeren naar één kooien in het dier faciliteit. Niet de dieren tot terugkeren het gezelschap van andere dieren tijdens de eerste 24 h, zelfs als zij hebben volledig hersteld van de verdoving.
- Nauwlettend de dieren elke dag. Postoperatieve analgesie met behulp van tramadol-hydrochloride in het drinkwater met een dosering van 1,0 mg/mL gedurende de eerste drie dagen te handhaven. Blijven analgesie als op dag 4 na de operatie, de dieren nog steeds blijk geven van pijn, zoals aangegeven door vocalisatie, rusteloosheid, gebrek aan mobiliteit, gebrek aan de bruidegom, abnormale houding en gebrek aan normale belangstelling in de omgeving. Analgesia opgeheven wanneer de dieren zijn pijn-vrij.
- Aan het einde van het experiment euthanaseren het dier door een overdosis Barbituraat.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De gebruiksduur van huid incisie aan de wond sluiting was 20 min. De operatie kan worden uitgevoerd zonder een stereomicroscoop. Postoperatief, werden de dieren dagelijks gecontroleerd. Post-operatieve analgesie werd beëindigd na 2 dagen, omdat geen van de dieren bleek bewijs van pijn na deze periode. De dieren bleek ook normaal gewicht dragende binnen 2 dagen na de operatie. Infecties van de wond werden niet waargenomen tijdens de volledige observatieperiode.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritische stappen van de chirurgische procedure zijn te vinden van het juiste ingangspunt voor implantatie van de schroef in het midden van de dijbeen-condyles op de intercondylar inkeping, alsmede de optimale oriëntatie van de naald evenwijdig aan de aslijn van de bot voor het ruimen van de intramedullaire holte. Om te voorkomen dat de positie van een onjuiste vermelding, dient de chirurg de inkeping bereiden tot een optimale weergave is bereikt. Om te controleren de oriëntatie tijdens het ruimen, moet het dijbeen van d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door RISystem AG, Davos, Zwitserland.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Mouse Screw | RISystem AG | 221,100 | |
| Guide wire | RISystem AG | 521,100 | |
| Centering bit | RISystem AG | 590,205 | |
| Hand drill | RISystem AG | 390,130 | |
| Cotton-Swab (150 mm, small head) | Fink Walter GmbH | 8822428 | |
| Suture (5-0 Prolene) | Ethicon | 8614H | |
| Forceps | Braun Aesculap AG &CoKG | BD520R | |
| Scissors | Braun Aesculap AG &CoKG | BC100R | |
| Needle holder | Braun Aesculap AG &CoKG | BM024R | |
| 27 G needle | Braun Melsungen AG | 9186182 | |
| Scalpel blade size 15 | Braun Aesculap AG &CoKG | 16600525 | |
| Heat radiator | Sanitas | 605.25 | |
| Depilatory cream | Asid bonz GmbH | NDXZ10 | |
| Eye lubricant | Bayer Vital GmbH | 2182442 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH | 1320422 | |
| Ketamine | Serumwerke Bernburg | 7005294 | |
| Tramadol | Grünenthal GmbH | 2256241 | |
| Disinfection solution (SoftaseptN) | Braun Melsungen AG | 8505018 | |
| CD-1 mice | Charles River | 22 | |
| X-ray Device | Faxitron MX-20, Faxitron X-ray Corporation | 2321A0988 | |
| Fracture device small | RISystem AG | 891,100 |
Referenties
- Jacenko, O., Olsen, B. R. Transgenic mouse models in studies of skeletal disorders. J Rheumatol Suppl. 43, 39-41 (1995).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. J Orthop Res. 2 (1), 97-101 (1984).
- Holstein, J. H., et al. Development of a stable closed femoral fracture model in mice. J Surg Res. 153 (1), 71-75 (2009).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. J Orthop Res. 27 (9), 1152-1156 (2009).
- Claes, L., Augat, P., Suger, G., Wilke, H. J. Influence of size and stability of the osteotomy gap on the success of fracture healing. J Orthop Res. 15 (4), 577-584 (1997).
- Histing, T., et al. Characterization of the healing process in non-stabilized and stabilized femur fractures in mice. Arch Orthop Trauma Surg. 136 (2), 203-211 (2016).
- Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. A model for intramembranous ossification during fracture healing. J Orthop Res. 20 (5), 1091-1098 (2002).
- Cheung, K. M., Kaluarachi, K., Andrew, G., Lu, W., Chan, D., Cheah, K. S. An externally fixed femoral fracture model for mice. J Orthop Res. 21 (4), 685-690 (2003).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. J Biomech. 41 (8), 1689-1696 (2008).
- Histing, T., et al. An internal locking plate to study intramembranous bone healing in a mouse femur fracture model. J Orthop Res. 28 (3), 397-402 (2010).
- Garcia, P., et al. The LockingMouseNail-a new implant for standardized stable osteosynthesis in mice. J Surg Res. 169 (2), 220-226 (2011).
- Histing, T., Klein, M., Stieger, A., Stenger, D., Steck, R., Matthys, R., Holstein, J. H., Garcia, P., Pohlemann, T., Menger, M. D. A new model to analyze metaphyseal bone healing in mice. J Surg Res. 178 (2), 715-721 (2012).
- Histing, T., Menger, M. D., Pohlemann, T., Matthys, R., Fritz, T., Garcia, P., Klein, M. An Intramedullary Locking Nail for Standardized Fixation of Femur Osteotomies to Analyze Normal and Defective Bone Healing in Mice. J Vis Exp. (117), (2016).
- Hiltunen, A., Vuorio, E., Aro, H. T. A standardized experimental fracture in the mouse tibia. J Orthop Res. 11 (2), 305-312 (1993).
- Manigrasso, M. B., O'Connor, J. P. Characterization of a closed femur fracture model in mice. J Orthop Trauma. 18 (10), 687-695 (2004).
- Holstein, J. H., Menger, M. D., Culemann, U., Meier, C., Pohlemann, T. Development of a locking femur nail for mice. J Biomech. 40 (1), 215-219 (2007).
- Claes, L. E., et al. Effects of mechanical factors on the fracture healing process. Clin Orthop Relat Res. 355 Suppl, S132-S147 (1998).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
