Method Article

Een eenvoudige methode voor het isoleren van soja protoplasten en toepassing op voorbijgaande gen expressie Analyses

DOI:

10.3791/57258

⸱

January 25th, 2018

 , 
1Department of Biology, California State University, Northridge

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We ontwikkelden een eenvoudige en efficiënte protocol voor de voorbereiding van grote hoeveelheden soja protoplasten om te studeren van de ingewikkelde regelgeving en signalering mechanismen in levende cellen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sojabonen (Glycine max (L.) Merr.) is een belangrijk gewas soorten en geworden een peulvrucht model voor de studies van genetische en biochemische trajecten. Daarom is het belangrijk om een efficiënte voorbijgaande gen expressie systeem in soja. Wij rapporteren hier een eenvoudig protocol voor de bereiding van soja protoplasten en de toepassing ervan voor voorbijgaande functionele analyses. We vonden dat de jonge unifoliate bladeren van soja zaailingen in grote hoeveelheden hoogwaardige protoplasten resulteerde. We bereikt door het optimaliseren van een PEG-calcium-gemedieerde transformatie methode, hoge transformatie efficiëntie met behulp van soja unifoliate protoplasten. Dit systeem biedt een efficiënte en veelzijdige model voor onderzoek van complexe regelgeving en signalering mechanismen in levende soja cellen en kan helpen om beter begrijpen divers cellulaire-, ontwikkelings- en fysiologische processen van peulvruchten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protoplasten zijn plantaardige cellen waarin celwanden verwijderd. Als ze beweert dat de meeste functies en activiteiten van plantencellen, protoplasten zijn een goed modelsysteem te observeren en evalueren van de verschillende cellulaire gebeurtenissen, en waardevolle hulpmiddelen te bestuderen van somatische hybridisatie1 en regeneratie2plant. Protoplasten hebben ook op grote schaal gebruikt voor plant transformatie3,4,5, aangezien celwanden zou anders het blokkeren van de passage van DNA in de cel. Protoplasten bezitten sommige van de fysiologische reacties en cellulaire processen van intact planten, vandaar het aanbieden van fundamentele waarde bij het basisonderzoek aan studie eiwit subcellular localisatie6,7,8, eiwit-eiwit interacties9,10, en promotor activiteit11,12,13 in levende cellen.

Het isolement van de plant protoplasten werd voor het eerst gemeld in 196014 en de protocollen voor zowel de isolatie en de transformatie van protoplasten zijn ontwikkeld en geoptimaliseerd. Een standaardprocedure voor isolatie van de protoplast impliceert het uitsnijden van bladeren en enzymatische vertering van celwanden, gevolgd door een scheiding van vrijgegeven protoplasten van niet-verteerde weefsels puin. Transformatie strategieën bevat electroporation15,16, microinjection17,18, en op basis van polyethyleenglycol (PEG)4,5,19 methoden. Een breed scala van soorten hebben gemeld succes voor isolatie van de protoplast, met inbegrip van Citrus20, Brassica21, Solanaceae22 en andere sierplanten gezinnen23,24. Terwijl verschillende weefseltypes (HLA) worden gebruikt in verschillende soorten, is een stelsel van meningsuiting van de voorbijgaande in Arabidopsis mesophyl protoplast (TEAMP) van de bladeren van de plant model Arabidopsis thaliana geïsoleerd goed ingeburgerd25 en algemeen aangenomen voor uiteenlopende toepassingen.

Sojabonen (Glycine max (L.) Merr.) is een van de belangrijkste eiwit en olie gewassen26. In tegenstelling tot Arabidopsis en rijst, is verkrijgen van transgene soja planten bekend nogal moeilijk en lage efficiëntie. Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde infiltratie is volksmond gebruikt voor tijdelijke gen expressie studies in de epidermale cellen in tabak27 en zaailingen in Arabidopsis28,29, overwegende dat Agrobacterium rhizogenes is gebruikt voor transformatie van harige wortels in soja30. Virus-geïnduceerde gene silencing benaderingen hebben gebruikt voor Downregulatie van doel genen31,32 en voorbijgaande expressie33 met systemische. Protoplasten vormen een waardevolle en veelzijdig alternatief voor deze benaderingen. Protoplasten kunnen worden verkregen uit sojabonen van bovengrondse materialen en laat snel en gesynchroniseerde transgenic expressie. Echter sinds de eerste succesvolle isolatie van soja protoplasten in de 198334, zijn er beperkt verslagen over de toepassing van protoplasten in soja35,36,,37,, 38, voornamelijk te wijten aan de relatief lage opbrengst voor sojabonen protoplasten.

Hier beschrijven we een eenvoudig en efficiënt protocol voor isolatie van soja protoplasten en de toepassing ervan voor voorbijgaande gen expressie studies. Met behulp van jonge unifoliate bladeren van soja zaailingen, konden we krijgen van grote hoeveelheden van vitale protoplasten binnen een paar uur. Daarnaast hebben we een PEG-calcium-gemedieerde transformatie methode die is eenvoudig en low-cost te leveren van DNA in soja protoplasten met hoog rendement geoptimaliseerd.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. de groei van de planten

  1. Zaaien 5-10 sojabonen (Williams 82) in een 13 cm pot in de serre omstandigheden lange-dag (16 h licht aan 1.500 µmol m-2 s-1) bij 25 ° C op de bodem van de aangepaste mix voor sojabonen (het 1:1:1 verhouding bodem, perliet en torpedo zand).

2. voorbereiding van de plasmide DNA

  1. Met behulp van een steriele Pipetteer tip of een tandenstoker, kies een één kolonie of bevroren glycerol voorraad van E. coli die de plasmide met het gen van belang en het in 20 mL Luria Bertani (LB) vloeistof met passende antibiotica in een maatkolf van 50 mL beënten.
  2. Incubeer de kolf bij 37 ° C's nachts op een shaker. Het verzamelen van de bacteriën door centrifugeren van de opschorting bij 12.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten en het supernatant te verwijderen. Extraheren en te zuiveren van de plasmide die volgens de procedure van de fabrikant van een plasmide prep kit.

3. isolatie van de protoplast

  1. Gesneden onlangs uitgebreide unifoliate bladeren van 10 - dagen oude soja zaailingen (Figuur 1).
    Opmerking: Selectie van bladeren in een passend stadium van ontwikkeling is de sleutel tot het succes voor soja protoplast voorbereiding. Gebruik alleen net uitgebreid bladeren op vroege ontwikkelingsstadia. Laat volwassen, celwanden worden moeilijker te verteren.
  2. Met een verse scheermesje, de hoofdnerf uit de unifoliate blad en dan knippen de resten in 0,5-1 mm strips te verwijderen.
    Opmerking: Twee unifoliate bladeren verteerd in 10 mL enzym oplossing krijgt voldoende protoplasten voor meer dan 10 transformaties.
  3. Met behulp van een paar pincet, overdracht stroken het blad onmiddellijk en zachtjes in 10 mL vers bereide enzym in een tube van 15 mL oplossing (tabel 1). Vacuüm infiltreren het blad strips voor 15 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Incubeer de blad-strips in de enzym-oplossing met zachte agitatie (40 rpm) onder lage licht voor 4-6 uur op kamertemperatuur. Zorg ervoor dat het enzym omslaat naar geel-groen zoals protoplasten zijn vrijgegeven. Controleer de enzym/protoplasten oplossing onder de Microscoop (X10).
    Opmerking: De vrijgegeven protoplasten zijn bolvormige vorm, terwijl de onverteerd cellen onregelmatige of ovale vorm hebben.
  5. Breng de 10 mL van enzym/protoplast oplossing in een tube van 50 mL door zachtjes gieten en voeg 10 mL W5 oplossing (tabel 1) bij kamertemperatuur om te stoppen met de spijsvertering. Voorzichtig omkeren de buis een paar keer. Giet voorzichtig het enzym/protoplasten oplossing op een schone 75 µm nylon gaas geplaatst op de top van een tube van 50 mL te verwijderen van de weefsels onverteerd blad.
  6. Centrifugeer de doorstroming enzym/protoplasten oplossing bij 100 x g in de tube 50 mL voor 1-2 minuten bij kamertemperatuur. Zachtjes Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van serologische Pipetteer 10 mL zonder verstoring van de protoplast-pellet.
  7. Resuspendeer de protoplasten en Verdun tot een concentratie van 2 x 105 mL-1 in gekoeld W5 oplossing bij 4 ° C door het tellen van de protoplast nummer op een hemacytometer onder de Microscoop (x10). Houd de protoplasten op ijs gedurende 30 minuten.
  8. Centrifugeer de schorsing bij 100 x g gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur en verwijder voorzichtig de W5-oplossing met behulp van een pipet 1 mL zonder verstoring van de protoplast-pellet. Resuspendeer de protoplasten in MMG oplossing (tabel 1) bij een concentratie van 2 x 105 mL-1 bij kamertemperatuur.

4. protoplast transformatie

  1. Breng 100 µL aliquots van protoplasten (2 x 104 protoplasten op 2 x 105 mL-1) in 1,5 mL lage wrijvingscoëfficiënt microcentrifuge buizen met behulp van Onbesneden 200 µL Pipetteer tips. Één aliquot opzij zetten om te dienen als negatieve controle. Voeg 10 µL van plasmide (10-20 µg) in elk van de rest hoeveelheid protoplasten.
  2. Voeg langzaam 110 µL van vers bereide oplossing van de PEG (tabel 1) op de binnenwand van de 1,5 mL microcentrifuge buis, en vervolgens voorzichtig omkeren en draai de buis totdat de oplossing homogeen wordt.
  3. Incubeer de transformatie mengsel bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  4. De transformatie stoppen, langzaam Voeg 400 µL van W5 oplossing aan de buis 1,5 mL bij kamertemperatuur en voorzichtig het omkeren van de buis totdat de oplossing homogeen wordt. Centrifugeer de buis bij 100 g gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant met behulp van een precisiepipet.
  5. Voeg 1 mL WI oplossing (tabel 1) aan de buis en resuspendeer door zachtjes pipetteren 1 - 2 keer. Voeg 1 mL 5% (vol/vol) steriele kalfsserum in elk putje van de plaat van een 6-well weefselkweek coat het oppervlak te voorkomen dat de protoplasten kleven aan de plaat.
  6. Na een paar seconden, gooi de met behulp van een precisiepipet kalfsserum. Breng de geresuspendeerde protoplasten in een putje van de plaat van de cultuur. De afdekplaat met een deksel.

5. protoplast incubatie en oogsten

  1. Incubeer de protoplasten bij kamertemperatuur gedurende 1-2 dagen in het donker.
    Opmerking: We vonden dat twee dagen incubatie opbrengsten sterker fluorescerende eiwit signaal in het algemeen ten opzichte van eendaagse incubatie, en dat het signaal fluorescent proteïne kan duren voor maximaal 3-4 dagen.
  2. Breng de protoplast-oplossing tot een 1,5 mL koker voor de microcentrifuge van de lage wrijvingscoëfficiënt. Centrifugeer de buis bij 100 x g gedurende 1-2 minuten bij kamertemperatuur te oogsten protoplasten. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet en overdracht van 10 µL protoplasten op een glasplaatje.
  3. Observeren fluorescent signaal onder fluorescentie- of confocale microscopie. Gebruik niet-getransformeerd protoplasten als negatieve controle (geen signaal moet worden nageleefd).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende organen van het 10 - dagen oude sojabonen werden getest voor protoplast voorbereiding (Figuur 1) en de opbrengsten werden waargenomen onder de Microscoop (Figuur 2). Celwanden van hypocotyl en epicotyl werden nauwelijks verteerd, en sommige cellen bleef vasthouden aan elkaar (figuur 2B, 2 C). In zaadlob (figuur 2D) en wortel (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol voor de isolatie van soja protoplasten en de toepassing op voorbijgaande expressie studies grondig is getest en werkt zeer goed in ons laboratorium. De procedures zijn eenvoudig en gemakkelijk en vereisen gewone apparatuur en minimale kosten. Ons protocol levert grote hoeveelheden van uniforme, hoge kwaliteit protoplasten in vergelijking met de eerder gemelde methoden34,35,,36,,37<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de Plant Genome Research Program van de National Science Foundation (NSF-PGRP-IOS-1339388).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MESSigma AldrichM8250-100G
Cellulase CELFWorthington Biological CorporationLS002611
Pectolyase Y-23BioWorld9033-35-6
CELLULASE "ONOZUKA" R-10yakult10g
MACEROZYME R-10yakult10g
MannitolICN Biomedicals152540
CaCl2FisherC79-500g
BSANEBR3535S
DTTSigma AldrichD5545-5G
NaClSigma AldrichS7653-1kg
KClFisherP217-500g
MgCl2Sigma AldrichM8266-100g
PEG4000Fluka81240
nylon meshcarolina652222N
Tissue Culture PlatesUSA ScientificCC7682-7506
Razor BladesFisher12-640
hemacytometerhausserscientific1483
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
EZNA plasmid miniprep kitOmegaD6942-01
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo ScientificK0502
Centrifuge 5810eppendorf5811000827
Centrifuge 5424eppendorf22620401
Jencons Powerpette Plus Pipet ControllerJencons14526-202
Zeiss 710 Confocal MicroscopeZeissN/A
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mLAmbionAM12450
15 mL Centrifuge TubesDenvilleC1018-P
50 mL Centrifuge TubesDenvilleC1060-P
Newborn Calf SerumThermo Scientific16010159
SoilIngram's Nursery
perliteVigoro100521091
Torpedo SandJKS Ventures
LB Broth, Lennox (Powder)FisherBP1427-500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
  2. Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
  3. Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).
  4. Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
  5. Koop, H. -U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199 (2), 193-201 (1996).
  6. Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts. Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).
  7. Lin, W., Wittenbach, V. A. Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).
  8. Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).
  9. Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
  10. Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant methods. 5 (1), 16(2009).
  11. Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).
  12. Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts. Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).
  13. Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts. P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).
  14. Cocking, E. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
  15. Zhang, H., et al. Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).
  16. Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).
  17. Crossway, A., et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).
  18. Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts. Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).
  19. Schapire, A. L., Lois, L. M. A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications. Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).
  20. Niedz, R. P. Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).
  21. Sheng, X., et al. Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).
  22. Grun, P., Chu, L. -J. Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae). Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).
  23. Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).
  24. Pitzschke, A., Persak, H. Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies. Plant methods. 8 (1), 14(2012).
  25. Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565(2007).
  26. Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases. New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).
  27. Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).
  28. Marion, J., et al. Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings. Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).
  29. Wu, H. -Y., et al. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant methods. 10 (1), 19(2014).
  30. Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules. Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).
  31. Nagamatsu, A., et al. Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).
  32. Juvale, P. S., et al. Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean. Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).
  33. Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing. Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).
  34. Lin, W. Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans. Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).
  35. Yi, J., et al. A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean. Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).
  36. Faria, J. A., et al. The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway. BMC Plant Biol. 11 (1), 129(2011).
  37. Kidokoro, S., et al. Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression. Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).
  38. Sun, X., et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci Rep-UK. 5, 10342(2015).
  39. Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
  40. Xia, Z., et al. Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering. P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Soybean ProtoplastsProtoplast IsolationPEG TransformationTransient Gene ExpressionEnzyme DigestionW5 SolutionConfocal MicroscopyHemocytometer CountingUnifoliate LeavesSoybean Seedlings

Related Articles