Ontwikkeling van Microfluidic apparaten te bestuderen van de rek mogelijkheid van plantencellen Tip groeiende in zeer kleine ruimtes

Naoki Yanagisawa; Nagisa Sugimoto; Tetsuya Higashiyama; Yoshikatsu Sato

doi:10.3791/57262

Method Article

Ontwikkeling van Microfluidic apparaten te bestuderen van de rek mogelijkheid van plantencellen Tip groeiende in zeer kleine ruimtes

DOI:

10.3791/57262

⸱

May 22nd, 2018

Naoki Yanagisawa¹ , Nagisa Sugimoto² , Tetsuya Higashiyama¹^,² , Yoshikatsu Sato²

¹Division of Biological Science, Graduate School of Science, Nagoya University, ²Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM), Nagoya University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beschrijven we een methode voor het onderzoeken van de mogelijkheid van tip-groeiende plantencellen, met inbegrip van stuifmeel buizen, root haren, en mos protonemata, naar elongate via zeer smalle openingen (~ 1 µm) in een microfluidic apparaat.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vivo, tip groeiende plantencellen moeten overwinnen van een aantal fysieke belemmeringen; onderzoekers ontbreekt echter de methodologie om te visualiseren van cellulaire gedrag in dergelijke beperkende voorwaarden. Om dit probleem te verhelpen, hebben we groei kamers voor tip groeiende plantencellen die een aantal smalle, micro-verzonnen lacunes (~ 1 µm bevatten) in een poly-dimethylsiloxane (PDMS) substraat. Deze transparante materiaal zorgt voor de gebruiker te volgen uiteinde rek processen in afzonderlijke cellen tijdens microgap penetratie door time-lapse imaging. Met behulp van deze experimenteel platform, waargenomen wij morfologische veranderingen in stuifmeel buizen als ze de microgap doorgedrongen. We veroverde de dynamische veranderingen in de vorm van een fluorescently geëtiketteerde vegetatieve kern en zaadcellen in een stuifmeel buis tijdens dit proces. Bovendien, we toonden de mogelijkheden van de root haren en mos protonemata te dringen de 1 µm-kloof. Dit platform in vitro kan worden gebruikt om te bestuderen hoe individuele cellen reageren op fysiek beperkte ruimten en kan inzicht verwerven in de mechanismen van de tip-groei.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nadat stuifmeel korrels op een stigma ontkiemen, produceert elke graan een enkele stuifmeel buis dat zaadcellen de eicel en de centrale cel in de zaadknop voor double bevruchting draagt. Stuifmeel buizen elongate door middel van de stijl en uiteindelijk het bereiken van de zaadknop door het aftasten van meerdere begeleiding signalen langs hun manier¹. Tijdens de rek tegenkomen stuifmeel buizen een aantal fysieke belemmeringen; de verzendende track is gevuld met cellen, en pollen buizen moet invoeren de minieme micropylar opening van de zaadknop te bereiken hun doel (figuur 1A)². Stuifmeel bu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. fabricage van het PDMS Microdevice te onderzoeken groeiende Pollen buizen en mos Protonemata

Opmerking: We gebruikten een maskless fotolithografie instrument te bereiden PDMS mallen (wafers) van silicium. De details over de werking van het systeem worden weggelaten in dit manuscript. Een standaard fotolithografie techniek⁹ met behulp van een photomask kan ook worden gebruikt om het maken van de mallen van de PDMS beschreven in dit manuscript.

11 g van pre polymeer PDMS mengsel giet (elastomeer base: genezen van agent bij een verhouding van 10:1) in elke 4-inch mal.
Ontgas de schimmel in stap 1.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als aangegeven in Figuur 1, tegenkomen plantencellen tip groeiende een aantal fysieke barrières langs hun groei paden in vivo. De microfluidic in vitro cel cultuur platforms gepresenteerd in deze studie ingeschakeld het onderzoek naar de tip-groeiende proces in drie soorten plantencellen (stuifmeel buizen, root haren en mos protonemata) via 1 µm kunstmatige lacunes (Figuur 3, Figuur 4

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende kritische stappen in het protocol moeten worden gevolgd om juist te verkrijgen van de resultaten van bovenstaande. Eerst, de PDMS laag en glazen bodem schotel oppervlakken moeten beide worden behandeld met plasma voor een voldoende hoeveelheid tijd voordat hechting. Anders kan de PDMS laag lokaal losmaken van het glasoppervlak terwijl tip groeiende cellen zijn het overschrijden van de microgaps. Een andere cruciale stap in het haar van de wortel en moss protonemata-protocol is de sterilisatie van de microde.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken H. Tsutsui en D. Kurihara voor ons te voorzien van transgene planten, met inbegrip van de T. fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato -lijn en de lijn van A. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover , respectievelijk. Dit werk werd ondersteund door het Instituut van transformatieve Bio-moleculen van Nagoya University en het Japan geavanceerde Plant Science netwerk. Financiële steun voor dit werk werd verstrekt door subsidies van de Japan Science and Technology Agency (ERATO project verlenen neen. JPMJER1004 voor T.H.), een Grant-in-Aid voor wetenschappelijk onderzoek op innovatieve gebieden (Nos. JP16H06465 en JP16H06464 voor T.H.), en Japan maatschappij voor ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Dow Corning Co.	Sylgard184
Murashige & Skoog Medium	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
Sucrose	Wako Pure Chemical	196-00015
50 mm glass-bottom dish	Matsunami Glass	D210402
35 mm glass-bottom dish	Iwaki	3971-035
Surgical blade	Feather	No.11
biopsy punches	Harris		Uni-Core
Gel loading tips	Bio-Bik	124-R-204
Inverted Microscope	Olympus	IX83
CSU-W1	Yokogawa Electric		No Catalog number is avairable for this customized microscope
MetaMorph imaging software	Molecular Devices

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Higashiyama, T., Takeuchi, H. The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance. Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).
Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. Pollen Tip Growth. Obermeyer, G., Feijó, J. , Springer. 65-85 (2017).....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Ontwikkeling van Microfluidic apparaten te bestuderen van de rek mogelijkheid van plantencellen Tip groeiende in zeer kleine ruimtes

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles