We beschrijven een protocol van stereotaxic chirurgie met een zelfgemaakte hoofd-fixed device voor microinjecting reagentia in het striatum van neonatale muis hersenen. Deze techniek maakt het mogelijk specifieke genmanipulatie in neuronale cellen van bepaalde regio's van neonatale muis hersenen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Stereotaxic chirurgie voor genetische manipulatie van striatale cellen van neonatale muis hersenen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Veel genen in embryonale hersenen zijn uitgedrukt, en sommigen van hen voortdurend worden uitgedrukt in de hersenen na de geboorte. Voor dergelijke aanhoudend uitgedrukte genen werken ze voor het regelen van de ontwikkelingstoxiciteit proces en/of de fysiologische functie in neonatale hersenen. Om te onderzoeken neurobiologische functies van specifieke genen in de hersenen, is het essentieel om de inactivering van genen in de hersenen. Hier beschrijven we een eenvoudige stereotaxic methode om de inactivering van genexpressie in het striatum van transgene muizen op neonatale tijd windows. AAV-eGFP-Cre virussen werden microinjected in het striatum van Ai14 reporter gene muizen op postnatale dag (P) 2 door stereotaxic hersenchirurgie. De tdTomato verslaggever genexpressie werd ontdekt in P14 striatum, hetgeen wijst op dat een succesvolle Cre-loxP gemedieerde DNA recombinatie bij AAV-getransduceerde striatale cellen. We verder gevalideerd deze techniek door AAV-eGFP-Cre virussen in P2Foxp2fl/fl muizen microinjecting. Dubbele etikettering van GFP en Foxp2 bleek dat GFP-positieve cellen ontbrak Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggereert het verlies van Foxp2-eiwit in de AAV-eGFP-Cre getransduceerde striatale cellen. Samen genomen, tonen deze resultaten een effectieve genetische schrapping door stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre virussen in specifieke neuronale populaties in de neonatale hersenen van floxed transgene muizen. Kortom, biedt onze stereotaxic techniek een gemakkelijk en eenvoudig platform voor genetische manipulatie in neonatale muis hersenen. De techniek kan niet alleen worden gebruikt om te verwijderen van de genen in bepaalde gebieden van neonatale hersenen, maar het kan ook worden gebruikt om te injecteren farmacologische drugs, neuronale verklikstoffen, genetisch gemodificeerde optogenetics en chemogenetics eiwitten, neuronale activiteit indicatoren en andere reagentia in het striatum van neonatale muis hersenen.
Inleiding
Moderne studies van de structuur en functie van de hersenen vereisen meestal genetische manipulatie van specifieke genen in neuronale cellen. Om de sonde van de functies van verschillende genen, transgene muizen mutant allelen, met inbegrip van uitvoering zijn knock-out en knock-in allelen routinematig gegenereerd. Stereotaxic hersenoperatie voor volwassen knaagdieren is een standaardmethode om lokaal drugs, virussen, verklikstoffen en andere reagentia voor specifieke regio's voor knaagdieren hersenen1,2. De stereotaxic hersenoperatie toe te passen op transgene muizen toelaat een om genetisch te manipuleren de genfunctie en de neuronale activiteit in specifieke neuronale populaties van de hersenen van de muis. De manipulatie van de type-specifieke cel biedt een krachtige aanpak om te ontcijferen van neuronale functies in complexe neurale circuits van de hersenen3,4,5.
Neurale ontwikkeling van het zenuwstelsel begint bij vroege embryonale stadia en de ontwikkelings processen blijven na de geboorte tot de jonge periode. Postnatale rijping van het zenuwstelsel omvat de precieze synaptic bedrading van neurale circuits, die is van essentieel belang voor fysiologische en cognitieve functies van de hersenen-6. Daarom studeren developmental gebeurtenissen die in neonatale tijd windows plaatsvinden is niet alleen belangrijk voor het begrijpen van normale neurale ontwikkeling, maar het kan ook inzicht verwerven in de pathogenese van neurologische en neuropsychiatrische aandoeningen7 ,8. Hoewel de methoden van stereotaxic hersenoperatie voor volwassen knaagdieren direct beschikbaar2,9 zijn, zijn paar protocollen beschikbaar op het internet voor stereotaxic hersenoperatie in neonatale muizen10,11. In feite, zijn stereotaxic microinjections van reagentia in de hersenen van neonatale muis pups moeilijk, omdat het hoofd van neonatale pup is te kwetsbaar vast te stellen in de standaard stereotaxic apparaat. Niettemin, de toepassing van stereotaxic hersenoperatie op transgene muizen is haalbaar voor neonatale muizen12. Hier beschrijven we een eenvoudige methode met een zelfgemaakte setup uit te voeren stereotaxic hersenoperatie in pasgeboren muis pups. We laten zien dat deze techniek maakt het mogelijk om voorwaardelijk verwijderen floxed genen door AAV-uiten Cre DNA recombinase microinjecting in het striatum van reporter gene muizen en voorwaardelijk floxed transgene muizen. Deze techniek is ook van toepassing op het leveren van reagentia in de neonatale striatum van wild-type muizen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De dierlijke protocollen die hier beschreven zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik comités van nationale Yang-Ming Universiteit.
1. voorbereiding van de houder van de neonatale Pups in het Stereotaxic apparaat
- De hoofd lade maken: Snijd de onderkant van een centrifugebuis 1,5 mL (15 mm lang) in de vorm die het hoofd van neonatale pups door het verwijderen van 1/5 van de wand van de buis past.
- Neem een pipet tip doos met de juiste grootte die bij het voetstuk van stereotaxic apparaat past, en verwijder de bovenklep. Brengt het hoofd lade bereid in stap 1.1 en een cassette weefsel insluiten op de basis van tip dienblad met hot-smelten lijm. De hoogte van het weefsel inbedden cassette is 7 mm, die wordt gebruikt ter ondersteuning van de nek en het lichaam van de pup in de hoofd-vaste positie.
- Plaats de hele setup in een standaard stereotaxic apparaat.
2. voorbereiding van 30G injectie RVS naalden
- Vooraf schone 30 G spuit naalden door inweken hen in chloroform voor 3 dagen.
- Gebruik pincet om zorgvuldig en langzaam Trek de naald uit haar polypropyleen hub in een chemische kap.
- Wassen van de naalden met absolute ethanol gedurende 20 minuten, gevolgd door 70% ethanol gespoeld voor 3 × 10 min op een shaker 50 rpm. Laat de naalden lucht droog, en de schone naalden Bewaar in een schone vak bij kamertemperatuur (RT) tot gebruik.
3. een Adapter voorbereiden door Microinjection Tubing
- De spuit microliter verbinden met een naald 30G injectie met een PE10 polyethyleen buis (PE10 buis). Voorbereiden op een PE20 polyethyleen buis (PE20 buis) adapter overbruggen de injectie naald en de spuit microliter. Het gebruik van de adapter is nodig, omdat de diameter van de buis van de PE10 veel kleiner dan die van de naald van de spuit 26G microliter is.
- De buis voor de microliter spuit bereiden: Sluit de vooraf gereinigd 30 G injectie naald met 5 cm van PE20 buis, en verzegel het kruispunt met instant lijm. Deze buis-adapter is herbruikbaar.
Opmerking: Als de naald van microinjection spuit is 30G, de voorbereiding (stap 3.1) en het gebruik (stap 3.3) voor deze adapter is niet nodig. - Sluit de adapter van de buis (bereid in stap 3.1) met een microliter spuit (10 µL).
- Sluit het ene uiteinde van PE10 buis (langer dan 60 cm) op de naald 30G van de PE20 slang adapter. Monteer een nieuwe 30G injectie naald op het andere uiteinde van de buis van de PE10.
4. Laad de Microinjection buis met gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd Water, kleurstof en virussen
- Verwijder de plunjer van de injectiespuit microliter. Gebruik een 25G spuit te laden de microliter spuit en haar verbonden PE buis met gesteriliseerde met autoclaaf gedestilleerd water te verwijderen van de lucht uit de slang.
- Plaats de zuiger terug naar de microliter spuit, en duw de plunjer tot 2 µL van gedistilleerd water in het vat blijft. Laat niet de hoeveelheid gedestilleerd water lager dan 2 µL worden.
- Mount zorgvuldig de microliter spuit op de micro stroom tarief-spuitpomp.
- Pipetteer van kleine hoeveelheden van 0,1% snel groene kleurstof (bereid in een zoutoplossing 0,9% en gefilterd met 0,22 µm filter) en het virus vloeistoffen op een stuk parafilm.
- Een kleine hoeveelheid lucht een luchtbel zichtbaar maken op de kruising tussen de 30G injectie naald en PE10 buis gevolgd door het laden van 0,7 µL van gefilterde snel groen in de buis om te testen de stroom van vloeistoffen in de buizen van microinjection trekken.
- Een andere kleine hoeveelheid lucht om een tweede luchtbel gevolgd door het laden van de virus vloeistoffen in de buizen van microinjection trekken.
- Hechten en beveiligen van de 30G microinjection naald aan de tak van stereotaxic apparaat.
5. de verdoving van neonatale muizen door onderkoeling
- Plaats de pup in een latex handschoen hoes en dompel het in crushed ijs tot de nek voor 5 min.
- Knijp de pup de voeten met een tang om ervoor te zorgen dat geen reactie van de terugtrekking van zijn voeten.
- Plaats van de pup met latex handschoen mouw in het Dienblad van het hoofd en zet sommige crushed ijs rond de latex mouw te houden koude voor onderkoeling anesthesie.
- Dierenarts zalf toepassen op pup van ogen om indien mogelijk te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving.
6. microinjection
- Steriele chirurgie voor te bereiden door af te vegen de stereotaxic instrument grondig met 70% ethanol. Het chirurgische instrument steriliseren door ze onder te dompelen in 70% ethanol.
- Schrobben van de pup hoofd met 70% ethanol. Zoek de landmark lambda op de schedel en de lambda markeren met een viltstift. Doel van de tip van de naald om de lambda, en bepalen de anterior-posterior (AP) en de mediale-en laterale (ML) coördinaten nul.
- Verplaats de injectie arm naar de doelsite volgens de X- en Y-coördinaten van de doelsite. Voor het striatum van postnatale dag (P) 2 pups, de coördinaten zijn: AP, +2.4 mm anterior to de lambda; ML, ±1.0 mm lateraal van de middellijn; dorsal-ventrale (DV), −1.7 mm van de schedel. Markeer de positie van snel groene kleurstof in PE10 buis met een pen.
- Neerhalen van de 30G injectie naald langzaam te dringen via de huid en de schedel, en dan breng omhoog de naald tip totdat het stopt bij het oppervlak van de schedel. De DV-coördinaat ingesteld als nul.
- Omlaag brengen de 30G injectie naald langzaam totdat zij de DV-coördinaat van de doelsite tot. Wacht 1 minuut om het parenchym hervatten van de normale vorm. Voer het programma van microinjection (100 nL/min).
- Zorg ervoor dat het merk van snel groene kleurstof zich beweegt in de PE-buis om ervoor te zorgen dat de virus vloeistof wordt geïnjecteerd in de hersenen.
- 1 min wachten na de beëindiging van de microinjection, en dan langzaam en geleidelijk breng omhoog de naald tot 1/2 hoogte van DV diepte binnen 30 s. Na 30 s, langzaam het terugtrekken van de naald uit de pup het hoofd.
- Herhaal stap 6.2 tot en met 6.7 totdat de microinjections van alle gerichte sites zijn voltooid.
7. post-chirurgisch herstel van de Pup
- Opwarmen van de pup voor 20 min in een incubator 33 ° C. Controleer de terugwinning van de pup uit hypothermie verdoving elke 5 minuten totdat de pup heeft herwonnen voldoende bewustzijn te handhaven sternale ligcomfort.
- De pup terug terug naar de dam, nadat de pup volledig is hersteld.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voor de eerste reeks van experiment, microinjected wij 200 nL van AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 virussen (AAV-eGFP-Cre, 1/10 verdunning in de Dulbecco fosfaatgebufferde zoutoplossing) die uitdrukking geven aan de Cre DNA recombinase gesmolten met GFP in P2 striatum van Ai14 muizen. De muizen Ai14 express tdTomato verslaggever gen op Cre-gemedieerde schrapping van loxP-geflankeerd (floxed) STOP cassette (figuur 2F). De hersenen werden voor immunokleurin...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In de huidige studie, we laten zien een eenvoudige en betrouwbare stereotaxic methode voor het injecteren van AAV virussen in het striatum van neonatale muis hersenen. Wij microinjected AAV-eGFP-Cre virussen in het striatum van Ai14 verslaggever muizen op P2 en vervolgens de verslaggever genexpressie bij P14 geanalyseerd. We vonden getransduceerde AAV GFP-positieve cellen in de hele het striatum op rostrocaudal niveau. Bovendien, bijna alle GFP-positieve cellen uitgedrukt samen het tdTomato verslaggever gen in striatale ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door het ministerie van wetenschap en technologie verleent MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, de nationale instituten van gezondheid onderzoek subsidie NHRI-EX106-10429NI, en de aanbevolen gebieden Research Center Program grant van het ministerie van onderwijs door Brain Research Center, National Yang-Ming University in Taiwan, en de postdoctorale Fellowship verleent MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C.), MOST105-2811-B-010-036 en MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K.).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G-naald past op PE10-buis; 26G-naald heeft een PE20-adapter nodig |
| Polyethyleen buis PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethyleen buis PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Spuitpomp | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) en L0107-2A (Aandrijfeenheid) | |
| 25G-spuit | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0,1% |
| Standaard stereotaxische instrumenten | RWD Life Science | 68037 | Zonder gebruik van 68030 Muis/Neonatale Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antilichaam | Abcam | ab16046 | Konijn polyklonaal voor FOXP2, 1:4.000 |
| Anti-RFP antilichaam | Abcam | ab65856 | Muis monoklonaal voor RFP, 1:1.000 |
| BX63 microscoop | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocale microscoop | Zeiss | LSM 880 | |
| Geit anti-konijn geconjugeerd Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5,506x1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1x1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s fosfaat gebufferde zoutoplossing | Corning cellgro | 21-030-CVR |
Referenties
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Suppl ement 14. Appendix 4, Wiley Online Library A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
- Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).
- Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).
- Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).
- Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350 (6263), (2015).
- Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600(2013).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).
- Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. Jr A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).
- Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72(2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
