Bemonsteringsstrategie en verwerking van Biobank weefselmonsters van varkens biomedische modellen

Samenvatting

De praktische toepassing en de prestaties van methoden voor generatie van representatieve weefselmonsters van varkens diermodellen voor een breed spectrum van downstream analyses in biobank projecten worden gedemonstreerd, waaronder volumetrie, systematische steekproefsgewijze bemonstering, en differentiële verwerking van weefselmonsters voor kwalitatieve en kwantitatieve analyses van morfologische en moleculair typen.

Samenvatting

Translationeel medisch onderzoek, varkens modellen steeds populairder geworden. Gezien de hoge waarde van individuele dieren, met name van genetisch gemodificeerde varken modellen, en de vaak beperkte aantal beschikbare dieren van deze modellen, oprichting van (biobank) collecties van voldoende verwerkte weefselsteekproeven geschikt voor een breed spectrum van latere analyses methodes, inclusief analyses niet opgegeven op de tijdstip van monsterneming, vertegenwoordigen zinvolle benaderingen ten volle te profiteren van de translationeel waarde van het model. Met betrekking tot de eigenaardigheden van varkens anatomie, zijn onlangs uitgebreide richtsnoeren opgesteld voor gestandaardiseerde generatie representatief, kwalitatief hoogwaardige monsters van andere varkens organen en weefsels. Deze richtsnoeren zijn essentiële voorwaarden voor de reproduceerbaarheid van de resultaten en hun vergelijkbaarheid tussen de verschillende studies en onderzoekers. De opname van basisgegevens, zoals orgel gewichten en volumes, de bepaling van de locaties van de bemonstering en de nummers van weefselmonsters moeten worden gegenereerd, evenals hun geaardheid, grootte, verwerking en trimmen richtingen, zijn relevante factoren het bepalen van de dan en de bruikbaarheid van het model voor moleculaire, kwalitatieve en kwantitatieve morfologische analyses. Hier, een illustratieve, praktische, stapsgewijze demonstratie van de belangrijkste technieken voor generatie van vertegenwoordiger, multifunctionele biobank specimen van varkens weefsels wordt gepresenteerd. De hier beschreven methoden bepaling te omvatten van orgaan/weefsel volumes en dichtheden, de toepassing van een systematische steekproeven volume-gewogen procedure voor parenchymal organen door punt-tellen, bepaling van de omvang van weefsel krimp aan de histologische inbedding van monsters en generatie van willekeurig georiënteerde monsters voor kwantitatieve stereological analyses, zoals isotrope uniforme willekeurige (IUR) secties die zijn gegenereerd door de "Oriënteringsapparaten" en "Isector" methoden en verticale uniform gerelateerde willekeurige (VUR) secties.

Inleiding

Translationeel geneeskunde, varkens zijn steeds vaker voorkomende voor gebruik als groot dier^1,2,3,4,5, als gevolg van verschillende voordelige overeenkomsten tussen de varkens modellen en menselijke anatomie en fysiologie, en de beschikbaarheid van gevestigde moleculaire biologische methoden toestaan voor generatie op maat, genetisch gemodificeerde varken modellen voor een breed scala van^1,4van de voorwaarden van de ziekte.

Ten opzichte van knaagdier modellen, is het aantal dieren van een respectieve varken model dat kan worden voorzien voor experimenten op elk gewenst moment echter beperkt. Dit is te wijten aan de varkens generatie interval van ongeveer een jaar, en de financiële en tijdrovende inspanningen die nodig zijn voor de generatie van varkens modellen en de veehouderij. Daarom, individuele dieren van een varkens model, evenals de voorbeelden die kunnen worden gegenereerd op basis van deze varkens, zijn zeer waardevol, vooral als genetisch gemanipuleerde varkens modellen en/of lange termijn experimentele problemen (bijvoorbeeld, late complicaties van chronische ziekten) worden in leeftijd individuen^2,6,7onderzocht.

In de loop van een studie, prestaties van aanvullende analyses die had niet gepland in de eerste opzet van de studie kan later blijken te worden betrokken, bijvoorbeeldnaar adres verschillende vragen die voortvloeien uit eerder ontdekt onverwachte bevindingen. Als geschikt monsters voor dergelijke aanvullende experimenten niet beschikbaar zijn, mogelijk onevenredig hoge kosten en tijdrovende uitgaven noodzakelijk voor het genereren van extra varkens en weefselmonsters worden. Als u wilt worden voorbereid dergelijke, generatie van biobank collecties van geconserveerde reservekopie monsters van de verschillende organen, weefsels of bio-vloeistoffen, kwantitatief als in kwalitatief opzicht geschikt zijn voor een breed scala van latere analyses, wordt beschouwd als een belangrijk ^2,6,7te benaderen. Optimale voordelen uit een varkens diermodel voortvloeiende, de beschikbaarheid van voldoende biobank monsters biedt ook de unieke mogelijkheid voor het uitvoeren van een breed spectrum van verschillende analysemethoden op identieke monster materialen op het niveau van een multi-orgel in de precies dezelfde individuele dieren, bijvoorbeelddoor verdeling van de monsters aan wetenschappers van verschillende werkgroepen georganiseerd in een onderzoek netwerk^2,6,7. De '' toekomstgerichte '' bemonsteringsstrategie in biobanking draagt bovendien ook bij aan een vermindering van het aantal dieren in een studie nodig. De voordelen van varkens model biobanking zijn onlangs aangetoond in een multi orgel, multiomics onderzoek, onderzoek van orgel cross talk in een genetisch gemanipuleerde varkens model van lange termijn diabetes mellitus, met behulp van specimens van de München MIDY varken Biobank ².

Er zijn een aantal verplichte eisen biobank monsters in het algemeen voldoen moeten om de betrouwbaarheid en interpretability van de resultatenvan de later uitgevoerde analyses. De monsters moeten reproducibly worden gegenereerd, en ze moet voldoende representatief, dat wil zeggen, als gevolg van de interesse morfologische en moleculaire kenmerken van het weefsel/orgel de monsters werden genomen uit⁷. Om zijn geschikt voor een breed scala van soorten downstream analyse, moeten de monsters worden genomen in voldoende hoeveelheden en verwerkt volgens de eisen (met inbegrip van tijd- en temperatuurdisplays voorwaarden) van de verschillende analysemethoden, met inbegrip van beschrijvende histopathologische analyses, zoals cryohistology, paraffine en kunststof histologie, immunohistochemistry, in situ hybridisatie, ultrastructurele elektronen microscopische analyses en klinisch laboratorium diagnostische analyses, evenals als moleculaire analyses van DNA, RNA, eiwitten en metabolieten.

Als u wilt toestaan voor de beoordeling van een breed scala aan verschillende kwantitatieve morfologische parameters zoals cijfers, volumes, lengtes, of oppervlakten van verschillende weefsel structuren door kwantitatieve stereological analyses, gerandomiseerde sectie vliegtuigen van de histologische monsters van de respectieve organen/weefsels moeten worden voorbereid^7,8,9,10,11. In kwantitatieve morfologische studies, de nauwkeurige bepaling van het totale volume van het weefsel, orgel of orgel compartiment, de monsters werden genomen uit (dat wil zeggen, de verwijzing ruimte) is van cruciaal belang^{7,9 , 12} om de absolute hoeveelheden van de betrokken parameters binnen de respectieve orgaan, weefsel of organisme te berekenen. Uiteindelijk heeft het effect van insluiten-gerelateerde weefsel krimp tijdens de voorbereiding van de histologische secties te worden bepaald en in rekening¹³genomen. Daarom, kwantitatieve stereological analyses, met name van gearchiveerde monsters (vaste weefselsteekproeven ingesloten weefsel blokken, histologisch secties, etc.) uit eerdere studies zijn soms ernstig beperkt of zelfs onmogelijk¹², met name indien volumetrie van de respectieve organen/weefsels is niet uitgevoerd, als geen passende bemonstering ontwerpen werden toegepast om te rechtvaardigen representatieve monsters, wanneer de aantallen en bedragen van de beschikbare afzonderlijke monsters ontoereikend zijn, of als de verwerking van de monsters is incompatibel met de raming van de kwantitatieve morfologische parameter (s) van belang. Vanwege de vele mogelijke factoren, de geschiktheid van archief-monster materialen voor analyses van afzonderlijke kwantitatieve morfologische parameters ondubbelzinnig kan niet worden beantwoord, maar hangt af van de zorgvuldige beoordeling van ieder individueel geval.

Dus, zoals de locatie, grootte, aantal, verwerking, trimmen richting en afdrukstand van monsters zullen mogelijk van invloed zijn op de resultaten van de latere analyses, deze factoren zijn van groot belang en moeten worden beschouwd in het experimentele ontwerp van een onderzoek. Met betrekking tot deze aspecten en de specificiteit van de varkens anatomie, uitgebreide, gedetailleerde, grootschalige bemonstering richtsnoeren aangepast aan varkens dierlijke modellen zijn onlangs vastgesteld, bieden een robuuste verwijzing naar gestandaardiseerde, reproduceerbare , en efficiënt genereren van redundante, adequaat verwerkt, kwalitatief hoogwaardige monsters van meer dan 50 verschillende varkens organen en weefsels^6,7.

De methodologische beschrijvingen en de video-tutorial weergegeven in dit artikel bieden gedetailleerde, illustratieve, begrijpelijk, stap-by stap-instructies voor de praktische uitvoering van een verscheidenheid van technieken voor volumetrie, bemonstering van varkens weefsels en organen, en verwerking van weefselmonsters voor verschillende downstream analysemethoden. De aanbevolen technieken omvatten methoden voor bepaling van orgaan/weefsel volumes en dichtheden gebaseerd op de beginselen van Archimedes en Cavalieri⁹, met inbegrip van de bepaling van de afmetingen van driedimensionale krimp van weefsel gerelateerde aan de insluiten in verschillende insluiten media¹⁴ tijdens de verwerking voor histopathologisch onderzoek, toepassing van uitvoerbaar volume-gewogen systematische steekproeven nadert, verwerking van gesamplede weefsel specimens voor verschillende latere analyses^7,,^8,,^9,15, generatie op passende wijze georiënteerd en verwerkt monsters voor potentiële kwantitatieve stereological analyses^{7,8, 9,10,11}. Naast hun toepassing in varkens biobank projecten zijn de bewezen methoden over het algemeen geschikt voor alle studies kwantitatieve histo-morfologische eigenschappen van organen/weefsels te onderzoeken. Bovendien, systematische steekproeven ontwerpen zijn vooral gunstig voor generatie van representatieve monsters in experimenten moleculaire analysemethoden gebruiken voor het detecteren van overvloed wijzigingen van, bijvoorbeeld, RNAs, eiwitten of metabolieten in verschillende organen en weefsels.

De volgende paragrafen bieden een korte inleiding op deze methoden, terwijl hun praktische prestaties wordt beschreven in de sectie protocol.

Bepaling van orgaan/weefsel volumes
Bepaling van orgel gewichten en volumes is belangrijk in verschillende experimentele instellingen, zoals deze factoren kunnen wijzen op veranderingen, potentieel aan experimenteel gerelateerde onderzocht factoren van belang. Het totale volume van een orgaan/weefsel is ook vaak nodig voor het berekenen van de absolute kwantitatieve parameters (bijvoorbeeld, het nummer van de cel totaal), van stereologically geschatte numerieke volume dichtheden (dat wil zeggen, het aantal cellen per volume-eenheid van weefsel)^7,12. Afgezien van technieken met behulp van complexe technische apparatuur, zoals computer tomografie, zijn er in principe drie praktische methoden die gewoonlijk worden gebruikt om te bepalen van het absolute volume van een orgaan of weefsel. Het volume van een orgaan kan worden bepaald door de "directe volumetrische meting" volgens het beginsel van Archimedes, dat wil zeggen, het meten van de hoeveelheid water of zoutoplossing dakloos geraakt door de structuur als volledig ondergedompeld. Voor relatief grote varkens organen zijn deze benaderingen echter onpraktisch en gevoelig voor onnauwkeurigheid, aangezien ze zeer grote volumetrische/meten kolven vereist. Meer gemakshalve, het volume van een orgaan/weefsel kan worden berekend op basis van haar gewicht en dichtheid^7,12,16, die efficiënt kan worden bepaald met behulp van de "methode van de onderdompeling"^{7,12 ,16} (protocol stap 1.1.). Orgaan/weefsel volumes kunnen ook worden geschat met behulp van volumetrie benaderingen gebaseerd op het "principe van Cavalieri" (1598-1647). In eenvoudige termen, het principe van Cavalieri stelt, als twee objecten zijn gesegmenteerd in vlakken evenwijdig aan een massaplaat, en de profielen van de secties door de twee objecten op overeenkomt gesneden afstanden van de massaplaat zijn dezelfde regio's, de twee objecten hetzelfde volume hebben. Dus, het volume van willekeurig gevormde objecten kan worden ingeschat als het product van hun sectie profiel gebieden in parallelle, even verre sectie vliegtuigen en de afstand tussen de vlakken van de sectie. Dit is begrijpelijk met de volgende analogie: overwegen twee stapels bestaande uit hetzelfde aantal identieke munten staan naast elkaar, een stapel met de munten ordelijke gestapeld bovenop elkaar opbrengst van een cilindrische vorm van de munt-stack, en de andere stapel van munten met uit het midden geplaatst munten (figuur 3A). Hoewel de vormen van zowel munt-stapels anders zijn, hun volumes zijn hetzelfde, sinds de gebieden van de munten op overeenkomstige niveaus van beide stapels (dat wil zeggen, het gebied van profielen van parallelle secties snijden door beide stapels van de munt in op gelijke afstand van de gemalen) identiek zijn. Schatting van de volumes van varkens organen en weefsels met behulp van de^12,voor Cavalieri principe^7,15 wordt beschreven in stap 1,2.

Bepaling van de omvang van weefsel krimp aan histologische insluiten gerelateerde
In analyses van verschillende kwantitatieve morfologische parameters gemeten in histologische weefselsecties, heeft het effect van insluiten-gerelateerde weefsel krimp tijdens verwerking voor histologie weefsel te worden bepaald en in aanmerking genomen. De omvang van insluiten-gerelateerde weefsel krimp variabele kan worden, en is afhankelijk van zowel op het weefsel, de verwerking en het insluiten middellange^{8,13,17,18,19}. In het algemeen, insluiten-gerelateerde veranderingen van het volume van een sample van het weefsel (dat wil zeggen, meestal krimp) optreden in alle drie de dimensies van ruimte, en dus, is van invloed op alle dimensionale parameters geschat door kwantitatieve stereological analyses⁸ . Kortom, de omvang van insluiten-gerelateerde weefsel krimp, uitgedrukt als de lineaire weefsel krimp factor (f_S), kan worden geraamd zoals aangegeven in stap 1.3. en gebruikt voor correctie van de kwantitatieve morfologische parameters (krimp-gevoelig)¹⁴.

Volume-gewogen systematische aselecte steekproef van organen/weefsels
Voor vestiging van een biobank collectie van varkens orgel/weefselsteekproeven, hebben systematische steekproeven volume-gewogen benaderingen zoals beschreven in stap 2 bewezen praktische tijdbesparende en efficiënte technieken voor generatie van vertegenwoordiger, multi purpose weefsel monsters^7,8,9,15.

Generatie van isotroop uniforme Random secties en verticale uniforme Random secties voor kwantitatieve stereological analyses
Biobank weefselsteekproeven moeten geschikt zijn voor een breed scala van verschillende kwantitatieve stereological analysemethoden voor schatting van een maximum van parameters die kon niet worden vastgesteld zonder een adequaat bereid exemplaar. Bijna alle kwantitatieve stereological parameters kunnen worden bepaald, met behulp van "isotrope (onafhankelijke) uniforme willekeurige (IUR) secties"^8,9. In IUR secties, is de driedimensionale oriëntatie van het sectievlak van het weefsel monster gerandomiseerde. Dit kan worden bereikt door randomisatie van de positie van het weefsel monster ten opzichte van de positie van het sectievlak, zoals toegepast in de "Isector" methode¹¹ (protocol stap 3.1), of door randomisatie van de oriëntatie van het sectievlak ten opzichte de weefsel monster, zoals in de "Oriënteringsapparaten" methode¹⁰ (protocol stap 3.2). In weefselmonsters, zoals huid of mucosa specimen weergeven een nature aanwezig, of gedefinieerde en goed herkenbaar verticale as, voorbereiding van de "verticale uniforme willekeurige (VUR) secties" (protocol stap 3.3.) gesegmenteerd strikt binnen het vlak van hun verticale as is de voordeligste^8,20. Voor een volledige discours van de theoretische grondslagen van IUR/VUR bemonstering en een uitgebreide bespreking van potentiële downstream kwantitatieve stereological analyses, wordt de geïnteresseerde lezer verwezen naar de schoolboeken van kwantitatieve stereology in het leven Wetenschappen^8,9.

Protocol

Alle methoden die worden beschreven hier gebruik van weefselmonsters afgeleid van dode dieren en volledig in overeenstemming zijn met de Duitse wettelijke voorschriften voor het welzijn van dieren.

1. volumetrie

1. Onderdompeling techniek voor de bepaling van de dichtheid van het weefsel/orgel (Figuur 1 en Figuur 2) ^{7 , 12 , 16}
   1. Bereiden van de materialen: Scalpel messen, papieren handdoeken, fijne pincet, standaard laboratorium Weegschaal, glas of plastic bekers, zoutoplossing 0,9% en zelfgebouwde specimen houders (figuur 2A).
   2. Accijnzen een stukje weefsel (maximale grootte: 2 x 2 x 2 cm-³) van het orgaan/weefsel, specifiek van het orgel compartiment van belang. Kleine organen, zoals de hypofyse of de pijnappelklier, zijn gemeten in toto.
      Let op: Zorg ervoor dat de grootte van de steekproef met name kleiner dan de inwendige diameter van het bekerglas (stap 1.1.5 e.v.), en het niveau van de vulling is toe volledige onderdompeling van het monster zonder contact met de binnenmuren van het bekerglas in stap 1.1.7.
   3. Zorgvuldig swab het monster met een papieren handdoek te verwijderen van de overtollige bloed/weefsel vloeistof.
   4. Wegen van het monster op een schaal van de precisie en het gewicht van het monster (m_S). Het bepalen van het gewicht van de kleine weefselsteekproeven met de dichtstbijzijnde mg (figuur 1A).
   5. Plaats een bekerglas gevuld met kamertemperatuur 0,9% zoutoplossing op de schaal. Volledig vult niet het bekerglas, mogelijk te maken voor een onderdompeling van het monster van het weefsel in de daaropvolgende stap zonder overlopen.
      Let op: Gebruik een bekerglas grootte worden de afmetingen en gewicht voor elk weefsel exemplaar te meten en de effectieve meetbereik van de schaal. Voor grotere monsters tot 2 x 2 x 2 cm³, een bekerglas grootte van 50-100 mL is geschikt in combinatie met een schaal meten vanaf ongeveer 100 mg tot 500 g, terwijl voor kleine steekproeven, bekerglazen van 5-10 mL in combinatie te gebruiken met precisie weegschalen met meetbereiken tussen ongeveer 0,1 mg en 20 g.
   6. De monsterhouder (dat wil zeggen, een voldoende stijf lus van dunne draad of iets dergelijks, figuur 2A) in de zoutoplossing dompelen naar een duidelijke positie (pijlen in figuur 1B, figuur 2Ben figuur 2C). Opnieuw (tarra) de weergave van de schaal op nul.
   7. Zorgvuldig hechten het weefsel monster aan de monsterhouder en volledig het monster in de zoutoplossing dompelen totdat het duidelijke standpunt inzake de monsterhouder wordt bereikt (pijlen in figuur 1B, figuur 2Ben figuur 2C).
      Let op: Het verzonken monster en de monsterhouder niet moet contact met de binnenmuren of de bodem van het bekerglas af of het oppervlak van de zoutoplossing.
   8. Houd de monsterhouder en het verzonken staal in die positie, terwijl het opnemen van het gewicht weergegeven op de schaal (m_L), verwijzend naar het gewicht zoutoplossing verdrongen worden door het monster weefsel (Figuur 1 C, figuur 2B, en Figuur 2C).
   9. Bereken het volume van het monster (V_S) van m_L, en de dichtheid van zout bij kamertemperatuur (20 ° C) (ρ_zoute = 1.0048 g/cm³) = als V_S m_L/ Ρ_zoute [g/g/cm³] (Figuur 1).
   10. Bereken de dichtheid van het weefsel monster (ρ_monster) van het gewicht (dat wil zeggen, massa) van de steekproef (m_S) en het volume (V_S): ρ_monster = m_S /V_S[g/cm³] (Figuur 1).
   11. Voor organen gemeten in toto, herhaal de meting driemaal en berekenen van de gemiddelde orgel dichtheid van de waarden van enkele meting. Uitvoeren van herhaalde metingen met verschillende monsters van hetzelfde orgaan/weefsel/orgel compartiment voor grote organen/weefsels, en berekenen van de gemiddelde dichtheid van de enkele metingen, dienovereenkomstig.
   12. Berekenen van het totale volume van het orgaan/weefsel/orgel compartiment van het gewicht en dichtheid (Figuur 1).
2. Toepassing van de Cavalieri-Method for Determination of varkens orgel Volumes ⁷
   1. Bereiden van de materialen: heerser, remklauw, mes, schaar, pincet, waterdichte pen, kunststof transparanten, scanner, foto camera, en cross rasters gedrukt op kunststof transparanten.
   2. Plaats het gehele orgaan/weefsel op een platte ondergrond (snijden base) en meet de lengte (l) van het orgel langs de longitudinale as (figuur 3B, figuur 5A).
   3. Snijd het volledige orgaan/weefsel in equidistante parallelle segmenten orthogonale aan de as van de longitudinale orgel (Figuur 3 c, figuur 5B). Kies een afstand d tussen twee secties (dat wil zeggen, de vectorafbeeldingsbestanden interval/sectie dikte, meestal ongeveer 1 cm) voldoende klein zijn om een voldoende aantal weefsel/orgel platen te ontvangen. Willekeurig het standpunt van de eerste sectie in een afstand tussen 0 en het vectorafbeeldingsbestanden-interval van de marge van het orgel. Tijdens het snijden, visueel beoordelen de positie en oriëntatie van elke sectievlak, ongeveer parallel orgaan/weefsel platen van ongeveer uniforme dikte te verkrijgen.
      Opmerking: Het benodigde aantal weefsel/orgel platen is afhankelijk van de vorm en de grootte van de onderzochte orgaan/weefsel. Als kleine organen of monsters worden gesegmenteerd in dunne platen van ≤5 mm moeten, insluiten de monsters in agar voorafgaand aan segmenteren (zie stap 1.3.3.) en een technische apparaat gebruiken voor het snijden van het monster agar-ingesloten. Empirisch aan te bevelen vectorafbeeldingsbestanden intervallen voor meest varkens organen en weefsels, alsmede voorbeelden voor segmenteringshulplijnen apparaten, zijn aangegeven in het aanvullend materiaal van "Weefsel bemonstering gidsen voor varkens biomedische modellen"⁷.
   4. Plaats alle orgaan/weefsel platen op hetzelfde oppervlak naar beneden op de basis snijden (dat wil zeggen, consequent op het recht of de linker sectievlak van elk orgel slab, figuur 3D, figuur 5C), en tellen van de platen (n).
   5. Sectie profielen van het weefsel platen verkrijgen door een van de volgende methoden:
      1. Zorgvuldig plaats de weefsel platen op adequaat gelabelde kunststof transparanten, met behoud van de oriëntatie van de bovenste en onderste sectie oppervlakken. De contouren van het weefsel platen op de plastic transparanten met een waterdichte pen (3E figuur1-2) te traceren.
      2. Nemen van fotografische beelden van het weefsel platen, vasthouden van de camera verticaal boven de sectie oppervlakken (figuur 3F). Voor kalibratie, plaatst u een liniaal grootte naast de weefsel platen.
      3. Scan de weefsel platen op een flatbed-scanner met behoud van de oriëntatie van de bovenste en onderste sectie oppervlakken (Figuur 3 g). Voor kalibratie, plaatst u een liniaal grootte naast de weefsel platen.
   6. De gebieden van de profielen (overgetrokken, gefotografeerd of gescande) sectie van alle weefsel platen meten door een van de volgende methoden:
      1. Overlay of superponeren de getraceerde orgel plaat profielen met een gepaste afmetingen, gekalibreerde raster van gelijkelijk verdeelde kruisen afgedrukt op een kunststof transparantie en graaf alle kruist het raken van het gebied Profiel (3E figuur3-4; te vergelijken met Figuur 5D). Bereken de oppervlakte van de profiel sectie van elke plaat orgel door te vermenigvuldigen met het aantal kruisjes raken het gebied profiel door de oppervlakte die overeenkomt met een kruis.
         Opmerking: Voor het ontvangen van voldoende nauwkeurige volume schat, kies een kruis raster met een voldoende kleine afstand tussen aangrenzende kruisen, zodat een gemiddelde van ten minste 100 kruist treft de sectie oppervlakken van de platen van een orgel in elk onderzocht geval van de studie . Empirisch aanrader cross raster maten voor meest varkens organen en weefsels zijn aangegeven in het aanvullend materiaal van "Weefsel bemonstering gidsen voor varkens biomedische modellen"⁷.
      2. Meten van de gebieden van de platen van het weefsel in de digitale beelden van de foto's / scans met behulp van passende verkrijgbare of freeware morphometry soft- en hardware toepassingen (Figuur 3 H), zoals een commerciële afbeelding analyse systeem²¹, of ImageJ²².
         Let op: Opmerking dat een weefsel plaat (de eerste of de laatste) wordt geplaatst op de scanner op zijn natuurlijke oppervlak, respectievelijk rusten, geconfronteerd met de camera met zijn natuurlijke oppervlak. Daarom het gescande beeld, het beeld van de foto van deze plaat, verschijnt niet het oppervlak van een sectie. Daarom wordt geen sectie gebied profiel gemeten in de afbeelding van de gescande afbeelding/foto van dit weefsel plaat (figuur 3I). Ook Opmerking overmatige projectie presenteren in gescande afbeeldingen en foto's van orgaan/weefsel platen, dat wil zeggen, alleen het meten van de gebieden van de profielen van de werkelijke sectie, maar niet van het weefsel in de afbeelding ligt achter de plaat sectie oppervlak (Figuur 12 G-H).
   7. Berekenen van de geschatte orgel volume als het product van de som van alle desbetreffende sectie profiel oppervlakten van alle weefsel platen per geval (dat wil zeggen, consequent van rechts of links, respectievelijk de boven- of ondergrens sectie oppervlak van elk orgaan slab en de gemiddelde dikte van de platen (dat wil zeggen, het quotiënt van de gemeten lengte van het orgel van de verticale as (l) en het aantal platen)¹⁵.
3. Bepaling van de omvang van driedimensionale insluiten-gerelateerde weefsel krimp tijdens verwerking van weefselmonsters voor histologie
   1. Bereiden van de materialen: Microtome messen, pincet, agar, metaal gieten mallen, digitale scanner en grootte liniaal (b.v., grafiek papier).
   2. Snijd een vers, vlak sectie oppervlak uit een vaste weefsel monster.
      Opmerking: Als monsters van gemakkelijk vervormbaar (zachte) weefsels (vetweefsel, gelatine-achtige weefsels), insluiten het vaste weefsel monster in agar voorafgaand aan vectorafbeeldingsbestanden (figuur 4A).
   3. Monster in agar insluiten:
      1. Meng standaard agar poeder zoals gebruikt voor microbiologie kweekmedium met een juiste hoeveelheid water (ongeveer 0,5 – 1 g agar/10 mL water) in een bekerglas van glas. Roer het mengsel en verwarmen in de magnetron op 700 W tot koken voor 3 – 5 s. Roer het mengsel en breng aan de kook weer voor 3 – 5 s.
      2. Optioneel, het vergroten van het contrast van de agar aan het weefsel monster, kleurstof vloeibaar agar, bijvoorbeeldmet zwarte inkt (1 mL inkt toevoegen aan 10 mL hete vloeibare agar en roer krachtig).
      3. Giet de hete agar in een mal gieten (bijvoorbeeld, een metalen mal gebruikt voor paraffine insluiten, figuur 10A-D) en het onderdompelen van de steekproef vast weefsel in de warme agar. Laat de agar afkoelen tot stolling, verwijderen van de mal, en snijd het agar-blok met de ingesloten weefsel met een microtoom of scheermesje.
         Let op: Draag tijdens het verwerken van hete vloeibare agar, veiligheidsbril en handschoenen. Proces weefselsteekproeven vast in formaldehyde oplossing onder een uitlaat zonnekap en laboratorium handschoenen en veiligheidsbril dragen.
   4. Leg het monster met zijn oppervlakte van de sectie naar beneden op een flatbed-scanner, samen met een liniaal grootte en scannen van het oppervlak van de sectie (figuur 4AB).
   5. Bepaal de oppervlakte van de oppervlakte van de sectie van het monster (een_f) van de vaste weefsel in de digitale scan, met behulp van een van de technieken beschreven in stap 1.2.6 (figuur 4B).
   6. Insluiten van het monster in kunststof insluiten medium, zoals epoxy (bijvoorbeeldEpon) of glycolmethacrylate/methylmethacrylate (GMA/MMA)²³, volgende standaardprotocollen^23,24,25 ) Figuur 4C). Zorgen dat het oppervlak van de sectie van het vaste monster gescand in de vorige stap (1.3.4) in het monster kunststof-ingesloten.
      Opmerking: Om de richting van het oppervlak van de sectie van het monster tijdens de verwerking van het monster, consequent leg het monster met zijn oppervlakte van de beoogde sectie beneden gericht in de insluiten cassette of de mal gieten, of de beoogde sectie markeren oppervlak (of de andere kant van het monster) met inkt.
   7. Knippen histologische toont een sectie uit het plastic blok overeenkomt met de oorspronkelijke sectie oppervlak van de vaste weefsel monster (stap 1.3.2) gebruikend microtome (Figuur 4 d), monteren van de sectie op een glasplaatje (Figuur 4 d) en vlek het routinematig ( bijvoorbeeld, de haematoxyline en eosine stain, H & E)^24,25.
      Let op: Om te ontvangen een histologische sectie ongeveer in hetzelfde vlak als de oorspronkelijke sectie oppervlak van de vaste weefsel monster, zorgvuldig pas de positie van de kunststof blok op de berg van de microtoom voordat segmenteren.
   8. Plaats de dia met het bevlekte gedeelte beneden zijn gericht op een flatbed-scanner samen met een liniaal grootte en scannen van de sectie (figuur 4E).
   9. Bepaal de oppervlakte van de sectie van het monster van de kunststof-embedded weefsel (A-_e) in de digitale scan, met behulp van een van de technieken beschreven in stap 1.2.6 (figuur 4F).
   10. Bereken de gemiddelde insluiten-gerelateerde weefsel krimp (voor de respectieve weefsel en insluiten medium) van het gemeten gebied van overeenkomstige sectie profielen van weefselmonsters vóór en na het inbedden in kunststof medium te embedding. De lineaire krimp factor f_s wordt berekend als de vierkantswortel van het quotiënt van de gebieden van de profielen van de sectie van n weefselsteekproeven na insluiten in kunststof insluiten medium (A-_e) en het gebied van de overeenkomstige sectie profielen van de dezelfde weefselmonsters voor insluiten in kunststof medium (een_f) (Figuur 4 g) te embedding¹⁴.

2. volume-gewogen systematische aselecte steekproef door punt tellen en verwerken van weefsel deelmonsters voor verschillende Downstream-soorten analyse⁷

1. Bereiden van de materialen: heerser, remklauw, mes, schaar, pincet, waterdichte pen, punt/Kruis rasters gedrukt op kunststof transparanten en willekeurige aantal tabellen.
   Opmerking: Kopie sjablonen voor grensoverschrijdende rasters (5-60 mm) vindt u in het aanvullend materiaal van "Weefsel bemonstering gidsen voor varkens biomedische modellen"⁷.
2. Plaats het orgel/het weefsel op een platte ondergrond (snijden base) en meet de lengte (l) van het orgel langs de longitudinale as (figuur 5A, figuur 6A).
3. Snijd het volledige orgaan/weefsel in equidistante parallelle segmenten orthogonale om de lengteas (figuur 5B). Kies een afstand d tussen twee secties (dat wil zeggen, de vectorafbeeldingsbestanden interval/sectie dikte, meestal ongeveer 1 cm) klein genoeg om een voldoende aantal weefsel/orgel segmenten te verkrijgen. Willekeurig het standpunt van de eerste sectie in een afstand tussen 0 en het vectorafbeeldingsbestanden-interval van de marge van het orgel. Tijdens het snijden, visueel beoordelen de positie en oriëntatie van elke Sectievlak te verkrijgen van ongeveer parallel orgaan/weefsel platen van ongeveer uniforme dikte.
   Opmerking: Het benodigde aantal weefsel/orgel platen is afhankelijk van de grootte van de onderzochte organen/weefsels en het aantal locaties van de bemonsterde weefsel. Als kleine organen of monsters worden gesegmenteerd in dunne platen van ≤5 mm moeten, insluiten de monsters in agar voorafgaand aan segmenteren (zie stap 1.3.3.) en het gebruik van technische hulpmiddelen voor het snijden van het monster agar-ingesloten. Empirisch aan te bevelen vectorafbeeldingsbestanden intervallen voor meest varkens organen en weefsels, alsmede voorbeelden voor het snijden van de apparaten zijn aangegeven in het aanvullend materiaal van "Weefsel bemonstering gidsen voor varkens biomedische modellen"⁷.
4. Plaats alle orgaan/weefsel platen op hetzelfde oppervlak naar beneden op de basis snijden (figuur 6B).
5. Overlay de weefsel platen met een gepaste afmetingen Kruis raster op een kunststof transparantie gedrukt door het plaatsen van de buitenste overgebleven bovenste cross van het raster een willekeurig punt buiten het weefsel (figuur 5C-D, figuur 6B).
   Opmerking: Kies een kruis raster met een voldoende kleine afstand tussen aangrenzende kruisen, zodat in elk onderzocht geval van de studie, ten minste tweemaal zoveel kruisen zal treffer naar de sectie remvlak(ken) van het weefsel compartiment te bemonsteren, als het aantal monsters dat moet dat weefsel compartiment te worden onttrokken. Empirisch aanrader cross raster maten voor meest varkens organen en weefsels zijn aangegeven in het aanvullend materiaal van "Weefsel bemonstering gidsen voor varkens biomedische modellen"⁷.
6. Mark en graaf alle kruist het raken van het weefsel (respectievelijk de weefsel sub compartiment te bemonsteren). Consequent toepassen van een uniforme manier van tellen en nummering van de kruisen het raken van het weefsel compartiment te bemonsteren in alle weefsel platen, bijvoorbeelddoor opeenvolgende nummering van de respectieve kruisen in elke lijn per lijn, van links naar rechts en van boven naar onder, of, bijvoorbeelddoor de nummering van de kruisen in een weefsel plaat na de andere in de richting van de klok, beginnend met het Kruis zich het dichtst bij de twaalf uur positie, zoals exemplarisch blijkt in het 5E cijfer.
7. Het getal van kruisen het raken van het weefsel/weefsel compartiment te steekproef (n) delen door het aantal monsters moet worden gegenereerd om te verkrijgen van de systematische voorbeeldinterval (i).
8. De eerste bemonstering positie bepalen door te kiezen voor een random getal x in het interval tussen de 1 en ik. Hiervoor door een random-nummer tabel te gebruiken. Mark de eerste bemonstering positie (x) en elke volgende x + i, x + 2ik, x + 3i, enz., Kruis het raken van het weefsel/weefsel compartiment te bemonsteren op de plastic transparantie met behulp van een waterdichte pen (figuur 5F).
   Opmerking: Random nummer tabellen kunnen gemakkelijk en snel gegenereerd worden met behulp van een online random number generator.
9. Label van het weefsel dat overeenkomt met de gemarkeerde locaties doorkruist door iets verhogen de kunststof transparantie en het plaatsen van een klein stukje van schone, lege confetti papier op het oppervlak van het weefsel plaat met behulp van een pincet (Figuur 5 g, Figuur 6 sexies ).
10. Accijnzen specimen van weefsel van de bemonsterde locaties (Figuur 5 H, figuur 6F, figuur 7A) en verder onderverdelen hen voor verschillende types van latere analyses (figuur 6G, figuur 7A-B), als omschreven in Tabel 1.
11. Na de monsterneming, de kunststof transparanten met warm water en zeep, droog, schoon en hergebruiken.

3. productie van isotroop uniforme willekeurige (IUR) secties en verticale uniforme willekeurige (VUR) secties voor kwantitatieve Stereological Analyses

1. "Isector" techniek
   1. Bereiden van de materialen: Razor of microtoom messen, agar, sferische gieten mallen (bijvoorbeeldgieten mallen voor pralines, die kunnen worden verkregen van banketbakker leveranciers), foldback klemmen en pincet.
   2. Plaats een weefsel van voldoende grootte stuk (1 x 1 x 1 cm³) vaste, systematisch willekeurig bemonsterd in een bolvormige gieten schimmel, bijeenhouden door foldback klemmen, en vul de mal met warme vloeibare agar (figuur 8A-E).
   3. Verwijder de agar bol (figuur 8F) uit de mal gieten na stollen van de agar.
   4. Rollen van de agar-gebied met het monster van de ingesloten weefsel over de tafel, stoppen, en deel het op een willekeurige positie.
      Opmerking: De resulterende sectievlak is een IUR sectie (figuur 8F-G).
   5. Gaat u verder met het insluiten van het weefsel monster in kunststof hars zoals GMA/MMA, behoud van de richting van de sectie IUR vliegtuig (zie 1.3.5).
2. "Oriënteringsapparaten" techniek
   1. Bereiden van de materialen: Razor of microtoom messen met agar, pincet, willekeurige nummer tabel(len), afdrukken van is, en cosinus-gewogen kringen.
      Opmerking: Kopie sjablonen van cirkels zijn verstrekt in eerdere publicaties^8,26.
   2. Leg het monster met vaste weefsel (of agar-embedded vaste weefsel) op een afdruk van een cirkel is met een rand evenwijdig aan de 0-180 ° richting (figuur 9A, figuur 10E).
   3. Een willekeurige hoek bepalen met behulp van de random nummer tabel. Vind de overeenkomstige merken op de schaal van de is cirkel, die het monster op rust. Gebruik van deze merken, gesneden een sectie door middel van het monster (of via de agar rondom het ingesloten weefsel monster), met het sectievlak wordt gericht, parallel aan de richting van de willekeurige hoek op de schaal van de cirkel is aangegeven, en verticale naar de oppervlakte van het monster (figuur 9B-C, figuur 10F) rusten.
   4. Plaats het weefsel blok met het oppervlak van de sectie gegenereerd in de vorige stap tegenover nadeel op een cirkel cosinus-gewogen met de rand van de rust vlak evenwijdig aan de 1-1 richting (figuur 9D, Figuur 10 H) geplaatst.
   5. Herhaal stap 3.2.3 en knippen van een nieuwe sectie door middel van het monster in een willekeurige hoek bepaald met behulp van de random nummer tabel (Figuur 9 sexies-F, figuur 10I-J).
      Opmerking: De resulterende sectievlak is een IUR sectie.
   6. In voorkomend geval, bepalen van het gebied van het IUR sectie profiel van de steekproef vast weefsel voor bepaling van de insluiten-gerelateerde weefsel krimp (figuur 9G-J) zoals beschreven in stap 1.3, en gaat u verder met het insluiten van het weefsel monster in kunststof hars zoals GMA/MMA.
3. Generatie van verticale uniforme willekeurige (VUR) secties
   1. Bereiden van de materialen: Razor of microtoom messen, agar, pincet, willekeurige nummer tabel(len) en prenten is cirkels.
      Opmerking: Kopie sjablonen van cirkels zijn verstrekt in eerdere publicaties^8,26.
   2. Definieer een verticale as binnen het vaste weefsel monster dat altijd herkenbaar is in het monster/secties tijdens de daaropvolgende stappen.
      Opmerking: Doorgaans de as verticaal op het natuurlijke oppervlak van het weefsel monster wordt gekozen als de verticale as.
   3. Eventueel insluiten het monster in agar (Figuur 11).
      Opmerking: Agar-insluiting voorafgaand aan VUR - of IUR-afdelen van het vaste monster is over het algemeen aan te bevelen voor kleine, dunne, breekbare of zachte monsters. Ook gebruiken agar-insluiting van monsters om de positionering van de VUR verdeelde steekproef tijdens de daaropvolgende inbedding van het monster in kunststof hars medium.
   4. Leg het monster op een afdruk van een cirkel is, met de verticale as wordt orthogonaal gericht op het vlak van de tabel/papier tabel (figuur 11C).
   5. Knip het monster in een willekeurige hoek (bepaald met behulp van een willekeurige numerieke tabel) met het sectievlak orthogonale aan de tabel en evenwijdig aan de verticale as te ontvangen een VUR sectievlak (figuur 11D).
   6. In voorkomend geval, bepalen van het gebied van het IUR sectie profiel van de steekproef vast weefsel voor bepaling van de krimp van de insluiten-gerelateerde weefsel zoals beschreven in stap 1.3 (in vergelijking met figuur 9G-J) en ga verder met het insluiten van het weefsel monster in kunststof hars zoals GMA/MMA.

Resultaten

Onderdompeling techniek voor de bepaling van de dichtheid van het weefsel/orgel

Figuur 12A -B toont de representatieve bepaling van de dichtheid en het volume van een varkens nier met behulp van de onderdompeling techniek beschreven in stap 1.1 (Figuur 1, Figuur 2). Meer representatieve resultaten van metingen van de dichtheid...

Discussie

Generatie van biobank monstercollecties van varkens diermodellen vereist robuuste technieken en protocollen voor de bepaling van orgaan/weefsel volumes, de reproduceerbare generatie van vertegenwoordiger, redundante weefselsteekproeven geschikt voor een breed scala aan verschillende analysemethoden, en voor randomisatie van de oriëntatie van monster secties voor kwantitatieve stereological analyses. De in dit artikel beschreven methoden zijn aangepast aan de grootte van varkens organen en weefsels, en hebben ontwikkeld o...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (poeder), Cat.: 5210.3	Los ongeveer 1 g agar op in 10 ml koud water in een glazen of plastic beker, verwarm in magnetronoven op 700 W, kook de oplossing twee keer met krachtig roeren. Giet in mal terwijl het nog warm is en laat het stollen. Let op: draag beschermende veiligheidsbril en handschoenen bij het hanteren van hete vloeibare agar.
Calliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Elke soort calliper (mechanisch of elektronisch) kan hiervoor worden gebruikt.
Gietblokjes (metaal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Elk ander type metalen gietblokje dat gebruikt wordt voor paraffine-inbedding kan hiervoor worden gebruikt.
Sjablonen van kruisrasters (5mm - 6 cm)	n.a.	n.a.	Sjablonen van kruisrasters (5mm - 6 cm) worden gegeven in het aanvullende databestand van Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Sjablonen van gelijkhoekige en cosinus-gewogen cirkels	n.a.	n.a.	Sjablonen van gelijkhoekige en cosinus-gewogen cirkels worden gegeven in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) en in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux’s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Klapklemmen (YIHAI binderclips, 15 mm en 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 en Y10005	Elk ander type standaard kantoorklapklem kan hiervoor worden gebruikt.
Pincet (anatomisch)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Elk type anatomisch pincet kan hiervoor worden gebruikt.
Formaldehyde-oplossing 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Verdun tot 4% uit de geconcentreerde oplossing. Breng naar neutraal pH. Draag geschikte oog-, hand- en ademhalingsbescherming. Bewerk weefselmonsters die gefixeerd zijn in formaldehyde-oplossing onder een afzuigkap en draag beschermende veiligheidsbril en laboratoriumhandschoenen.
Millimeterpapier (voor kalibratie)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Elk type millimeterpapier kan hiervoor worden gebruikt.
Laboratoriumbekers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX®, niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Elk type glazen- of plastic beker met een volume van 5 – 100 ml kan hiervoor worden gebruikt.
Laboratoriumweegschaal(en)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Elke standaard laboratoriumweegschaal met meetbereiken tussen 0,1 mg tot ongeveer 20 g, respectievelijk tussen 100 mg tot ongeveer 500 g kan hiervoor worden gebruikt
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtoommessen	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtoom messen S35, Cat.:14700	Elk type microtoommessen voor eenmalig gebruik kan hiervoor worden gebruikt.
Morphometrie/planimetrie software/systeem	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Downloaden van https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM beeldanalyse systeem	Uit voorraad
Fotocamera	Nikon	D40	Elk type digitale fotocamera dat op een statief kan worden gemonteerd kan hiervoor worden gebruikt.
Kunststof transparanten	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Elk (laser)-printbaar kunststof transparant kan hiervoor worden gebruikt.
Willekeurige getallentabellen	n.a.	n.a.	Willekeurige getallentabellen kunnen gemakkelijk worden gegenereerd (met een gedefinieerd aantal willekeurige getallen en binnen gedefinieerde intervallen), met behulp van willekeurige getallengeneratoren, zoals: https://www.random.org/
Schermessen	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Elk type scheermes kan hiervoor worden gebruikt.
Liniaal	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Elk type cm-mm-geschaalde liniaal kan hiervoor worden gebruikt.
Zoutoplossing (0,9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	Om 0,9% zoutoplossing te bereiden, lost u 9 g NaCl op in 1000 ml gedistilleerd water bij 20°C.
Mesjes	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical mesjes N°22	Elk type mesjes kan hiervoor worden gebruikt.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Elk type standaard kantoorscanner die kan scannen met resoluties van 150-600 dpi kan hiervoor worden gebruikt.
Snijapparaten	n.a.	n.a.	Voorbeelden van zelfgebouwde snijapparaten zijn te vinden in Knust, et al. Anatomical record