Methodenartikel

Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

DOI:

10.3791/57281

⸱

28 februari 2018

 , 
1Center for Infectious Diseases, Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De intestinale immuunsysteem speelt een essentiële rol bij het handhaven van de barrièrefunctie van het maag-darmkanaal door het genereren van tolerant reacties op dieet antigenen en commensale bacteriën terwijl montage effectieve immuun reacties op enteropathogenic microben. Bovendien is het duidelijk dat lokale intestinale immuniteit een diepgaande invloed op immuniteit van verre en systemische heeft geworden. Daarom is het belangrijk om te bestuderen hoe een intestinale immuunrespons wordt geïnduceerd en wat de immunologische uitkomst van de reactie is. Hier, een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van dunne darm inductieve sites zoals de gut-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren en effector sites zoals de lamina propria wordt beschreven en de intestinale epitheel. Deze techniek zorgt voor isolatie van een groot aantal lymfocyten van kleine intestinale weefsels met optimale zuiverheid en levensvatbaarheid en minimale compartimentaire kruisbesmetting binnen acceptabele tijdsbeperkingen. De technische mogelijkheden om te isoleren van lymfocyten en andere immune cellen van intestinale weefsels kan het begrip van immuunresponsen gastro-intestinale infecties, kankers en ontstekingsziekten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het maag-darmkanaal (GI) heeft vele plooien en uitsteeksels die vertegenwoordigt de grootste interface scheiden van het interne lichaam en de externe omgeving. De intestinale immuunsysteem speelt een essentiële rol bij het handhaven van de barrièrefunctie van het GI-darmkanaal. Het is voortdurend blootgesteld aan dieet antigenen, commensale bacteriën en pathogene microben. Zo moet het verdraagzaam aan voedsel antigenen en commensale bacteriën blijven met behoud van het vermogen om snel genereren een effectieve immuunrespons op enteropathogenic microben1. De intestinale immuunsysteem kan anatomisch worden onderverdeeld in inductieve sites, waar naïef lymfocyten worden geactiveerd door antigeen presentatie van cellen dragen antigenen van de intestinale mucosa, en effector, waar de geactiveerde lymfocyten specifieke uitoefenen Effector functies2. De inductieve sites omvatten de georganiseerde lymfoïde structuur van Peyer van patches (PP) die enquêtes de intestinale lumen rechtstreeks via het optreden van gespecialiseerde cellen van de M en de regionale zuig mesenterische lymfklieren (MILJ.). De effector sites bestaan uit de lamina propria (LP), oftewel het bindweefsel onder de kelder-membraan en het intestinaal epitheel, een eencellige laag gelegen boven de kelder membraan dat geest lymfocyten (IEL) bevat. Lymfocyten zijn belangrijke spelers van adaptieve immuniteit die bemiddelen bescherming tegen infecties en kanker en kunnen ook bijdragen aan Immunopathologie in ontstekingsziekten. Het is belangrijk en zeer relevant voor de studie van lymfocyten in deze verschillende anatomische mucosal compartimenten beter begrijpen hun inductie en effector functies.

Een relatief eenvoudige en uniforme protocol voor de isolatie van lymfocyten van deze compartimenten is nodig omdat het aantal onderzoekers het verkennen van immuun gebeurtenissen die zich in de darm zijn versnellen. Verschillende onderzoeksgroepen hebben gepubliceerd protocollen die delen van verschillende soortgelijke processen voor het isoleren van immuuncellen van de muis kleine intestinale compartimenten3,4,5,6,7 . Er zijn echter verschillende technische onderling verschillen afhankelijk van de focus van het individuele protocol. Bijvoorbeeld, met de focus op het isoleren van immuuncellen van de LP, onderzoekt één protocol de impact van verschillende enzymatische spijsvertering op de levensvatbaarheid van de cellen, cel-oppervlakte marker expressie en de samenstelling van geïsoleerde immuuncellen5. Een ander protocol wijst op een snelle en reproduceerbare methode voor isolatie van lymfocyten zonder dichtheid centrifugeren6. Tot slot, specifieke protocollen bestaan ook met het oog op het isoleren van mononucleaire fagocyten uit weefsel van de verschillende lagen van de dunne darm7. Hier, wordt een zeer reproduceerbaar protocol waarmee sequentiële Isolatievan lymfocyt populaties van de MLN, PP, LP en IEL compartiment van de dunne darm gepresenteerd.

Wij focussen op het isoleren van hoogst gezuiverde populaties van de LP en IEL compartimenten, die grotendeels vrij is van contaminanten in andere intestinale compartimenten. Dit gebruikte protocol produceert een hoog rendement van maximaal zuiver en levensvatbare lymfocyten binnen acceptabele tijd beperkingen4,8,9,10,11,12. Dit protocol zorgt er ook voor de isolatie van lymfocyten van de LP en IEL compartiment met minimale compartimentaire kruisbesmetting, waardoor een bonafide mogelijkheid om te studeren van lymfocyten in deze afzonderlijke compartimenten. De geïsoleerde lymfocyten kunnen worden onderworpen aan verdere manipulaties zoals flow cytometrische analyse of functionele analyse. Dit protocol is met succes toegepast, tot de isolering van lymfocyten uit de muis dunne darm en dikke darm tijdens bacteriële infecties zoals Listeria monocytogenes, Salmonella typhimuriumen Yersinia pseudotuberculosis infecties en inflammatoire aandoeningen zoals chemische - en pathogen-geïnduceerde colitis. Dit protocol kan ook worden gebruikt om te isoleren van de ingeboren immune cellen zoals dendritische cellen, macrofagen, neutrofiele granulocyten en monocyten van de muis dunne darm en dikke darm.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven zijn uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van het National Institute of Health en goedgekeurd door de Stony Brook University institutionele Animal Care en gebruik Comité.

Opmerking: Zorg ervoor dat alle goedkeuringen zijn verleend voordat u procedures uitvoert.

1. oplossing voorbereiding

  1. HGPG (HEPES, L-glutamine, penicilline/streptomycine en gentamycine), 100 ×
    1. Meng 59.6 g HEPES (500 mM definitieve), 14.6 g L-glutamine (200 mM in finale), 1 × 106 U penicilline (2.000 U/mL definitief), 1 g streptomycine (2 mg/mL final) en 2,5 mg gentamicine (5 µg/mL definitief). Toevoegen van RPMI 1640 tot 500 mL. Breng pH 7.5 met NaOH (vóór aanpassing, de buffer is geel/oranje met een pH rond 6.0). Filter steriliseren met behulp van een 0,45 µm filter. Aliquot en winkel bij-20 ° C voor maximaal 1 jaar of bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
  2. HEPES-bicarbonaat buffer, 10 x
    1. Meng 23.8 g HEPES (100 mM definitieve), 21 g NaHCO3 (250 mM definitieve) en voeg water tot 1000 mL. Breng pH op 7,2 met HCl. Filter steriliseren met behulp van een filter 0,45 micrometer. Bewaren bij kamertemperatuur. De pH verandert na verloop van tijd. Breng opnieuw de pH regelmatig.
  3. Oogsten van media (~ 1 fles/2 muizen)
    1. 500 mL RPMI 1640, toevoegt 25 mL warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (5% laatste) en 5 mL 100 × HGPG. Opslaan van maximaal 6 maanden bij 4 ° C.
  4. Dithioerythritol (DTE) oplossing (40 mL/kleine darm)
    1. Mix-50 mL 10 × Hanks evenwichtige zoutoplossing en Ca2+- Mg2+-gratis, 50 mL 10 × HEPES-bicarbonaat buffer en 50 mL warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (10% laatste). Voeg 350 mL H2O en 15,4-inch mg dithioerythritol/100 mL (1 mM definitieve). Dit vers vóór gebruik voor te bereiden.
  5. Ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) oplossing (50 mL/kleine darm)
    1. Mix-50 mL 10 × Hanks evenwichtige zoutoplossing en Ca2+- Mg2+-gratis met 5 mL 100 × HGPG. Toevoegen van 445 mL H2O. toevoegen 260 µL 0.5 M EDTA/100 mL (1.3 mM definitieve). Dit vers vóór gebruik voor te bereiden.
  6. Collagenase oplossing (30 mL/LP)
    1. Tot 500 mL RPMI, voeg 50 mL FBS (10% FBS def.), 5 mL 100 × HPGP, 1 mL 0,5 M MgCl2 (1 mM definitieve) en 1 mL 0,5 M CaCl2 (1 mM definitieve). Toevoegen van collagenase, Type I (100 U/mL def.). Dit vers vóór gebruik voor te bereiden.
  7. Dichtheid kleurovergang (DG) oplossingen
    1. 1 × DG stockoplossing bereiden door het mengen van 90 mL DG stockoplossing (Zie de Tabel van materialen) met 10 mL 10 × PBS. Steriele bewaren bij 4 ° C.
    2. Bereid 44% DG oplossing (8 mL/IEL, 8 mL/LP) door het mengen van 44 mL van de stockoplossing van 1 × DG en 56 mL RPMI 1640. Dit vers vóór gebruik voor te bereiden.
    3. 67% DG oplossing (5 mL/IEL, 5 mL/LP) voor te bereiden door het mengen van 67 mL van de stockoplossing van 1 × DG en 33 mL RPMI 1640. Dit vers vóór gebruik voor te bereiden.

2. isolatie van de mesenterische lymfklieren, darmen, en Peyer van Patches

  1. De muis met behulp van kooldioxide versuffing en secundaire cervicale dislocatie euthanaseren. Plaats de muis op de rug en spray met 70% ethanol. Schaar gebruik te maken van een incisie middellijn en open de huid en de buikwand de peritoneale holte bloot te stellen.
  2. Zoek het caecum en gebruik van pincet voorzichtig het caecum om neer te trekken. Pincet gebruiken om de dunne darm zorgvuldig naar het recht, bloot de hele keten van MLN, die is afgestemd op de dikke darm.
    Opmerking: De kaart van de mesenterische lymfeklieren ketting en lymfatische drainage van de darmen voorheen afgebeeld13.
  3. Identificeren van het knooppunt van de bodem in de keten, dichtst gelegen aan de blindedarm. Één set pincet gebruiken om te begrijpen het mesenterium/vet eromheen en het zachtjes verwijdert de MLN keten onder naar de top van het vet uit rond de lymfeklier met een andere set van verlostang pincet.
  4. Leg de ketting MLN op een papieren handdoek bevochtigd met oogst media. Verwijder mesenterium/vet door rollen van de keten op de toren van papier en trekken het vet af met twee sets van de verlostang. Plaats de MLN in koude oogst media voor latere stappen van de isolatie.
    Opmerking: (i) rechtstreeks te worden aangeraakt van de knooppunten wordt afgeraden. In plaats daarvan begrijpen het mesenterium/vet om hen heen. (ii) het is cruciaal voor het verwijderen van zo veel mesenterium/vet mogelijk ter verbetering van de levensvatbaarheid van de cellen.
  5. Gesneden van de dunne darm onder de pyloric sphincter en boven de blindedarm met behulp van schaar. Trek de darm langzaam uit het ileum aan twaalfvingerige darm met behulp van een set van verlostang tijdens het verwijderen van het bijgevoegde mesenterium/vet met behulp van een andere set van verlostang.
  6. Plaats de darm op een papieren handdoek bevochtigd met oogst media en plagen van alle resterende mesenterium/vet af met twee sets van de verlostang.
    Opmerking: (i) moet zoveel mesenterium/vet verwijderen als mogelijk is voor optimale cel opbrengst en levensvatbaarheid. (ii) houden de darm bevochtigd in dit en de volgende stappen door oogst media regelmatig toe te passen.
  7. Verzamelen van Peyer patches door ze te verwijderen uit de darm met gebogen schaar. Gebruik een ontleden scope of Vergrootglas indien nodig (beginners); de meeste Peyer patches moeten worden weergegeven voor de getrainde oog. 5-11 (typische) Peyer patches verzamelen uit de dunne darm. Plaats Peyer patches in koude oogst media voor latere stappen van de isolatie.
    Opmerking: Peyer de patches zijn kleine, voornamelijk ronde uitstulpingen in de buitenste darmwand tegenover de lijn van mesenterium bijlage.
  8. Gebruik de platte kant van pincet en zachtjes dia van twaalfvingerige darm naar ileum tot uitzetting van fecale inhoud en slijm. Herhaal deze stappen eenmaal te verwijderen van de meeste van het slijm.
    Opmerking: Onvolledige verwijdering van slijm kan verlagen van de levensvatbaarheid van de cellen en opbrengst. Toch moet u Schuif de darm voorzichtig om te voorkomen dat strippen villi of beschadiging van het membraan van de kelder.
  9. Fijne schaar gebruiken met een botte uiteinde op één punt, het botte uiteinde invoegen in de darm en opengesneden de darm lengterichting van de twaalfvingerige darm aan ileum. Lateraal de geopende darm in ~ 2 cm stukken gesneden. Leg de intestinale stukjes in een conische buis van 50 mL met 25 mL koude oogst media voor latere stappen van de isolatie.
    Opmerking: De schaar bevochtigd met media houden zal hen helpen glijden moeiteloos door de darm.

3. isolatie van lymfocyten van de inductieve Sites

  1. Isoleren lymfocyten van MLN door zachtjes distantiëren door een zeef van 70-µm cel met behulp van de zuiger van een 3-mL spuit. Wassen cel zeef met 5 mL koude oogst media.
  2. Pellet MLN-cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL koude oogst media. Levensvatbare cellen tellen met uitsluiting van de trypan blauw.
    Opmerking: rode bloedcellen lysis-buffermengsel kan worden gebruikt voor het verwijderen van rode bloedcellen, als het bloeden opgetreden tijdens het verwijderen.
  3. Isoleren lymfocyten van Peyer van patches door Peyer van patches in een conische buis van 15 mL, 5 mL voorverwarmde collagenase oplossing bij 37 ° C en 220 rpm voor 30 min met broeden.
  4. Vortex voor 15 s bij maximale instelling en filter weefsel en de bovendrijvende substantie in een conische buis van 50 mL verteerd door een zeef van de cel 70-µm. Zachtjes distantiëren van de resterende weefsel stukken met behulp van de zuiger van een injectiespuit 3 mL en wassen van de cel zeef met 5 mL koude oogst media.
  5. Pellet Peyer de patch cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C en resuspendeer de cel pellet in 1 mL koude oogst media. Levensvatbare cellen tellen met uitsluiting van de trypan blauw.
    Opmerking: Peyer de patches isolatie wellicht sommige contaminerende lamina propria lymfocyten en geest lymfocyten.

4. isolatie van geest lymfocyten uit de dunne darm

  1. De stukken van dunne darm driemaal met 25 mL koude oogst media door de buis 10 keer omkeren, laten de intestinale stukken regelen en gieten uit het supernatant wassen.
    Opmerking: Weefsel stukken moeten gemakkelijk regelen naar de onderkant van de buis. Als dat niet het geval is, is een indicatie dat teveel mesenterium/vet verbonden blijft, of ze geassocieerd met een luchtbel worden.
  2. Voeg 20 mL voorverwarmde DTE oplossing aan de conische buis van 50 mL, met darm stuks en overbrengen in een 50 mL gesiliconiseerd conische kolf met een roer-bar. Roer bij 37 ° C en 220 rpm op een magneetroerder voor 20 min. gebruiken een grote magneet aan de buitenzijde van de kolf te houden van de roer-bar en het weefsel en de oplossing ook terug overzetten naar de conische buis van 50 mL.
  3. Vortex de buis op maximum instellen voor 10 s. overdracht de bovendrijvende substantie in een nieuwe 50-mL conische buis door een 70-µm cel zeef voorzichtig om te houden van de stukjes weefsel in de originele buis. Gooi niet het supernatant; de bovendrijvende vloeistof bevat geest lymfocyten. Pellet cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet cel in 10 mL koude oogst media en op te slaan op het ijs.
  4. Voeg 20 mL voorverwarmde DTE oplossing aan de conische buis van 50 mL, met darm stuks en breng terug naar de 50 mL gesiliconiseerd erlenmeyer met een roer-bar. Roer bij 37 ° C en 220 rpm op een magneetroerder voor 20 min. gebruiken een grote magneet aan de buitenzijde van de kolf te houden van de roer-bar en het weefsel en de oplossing ook terug overzetten naar de conische buis van 50 mL.
    Opmerking: DTE is een reductor die geest lymfocyten verrijkt.
  5. Vortex de buis op maximum instellen voor 10 s. overdracht de bovendrijvende vloeistof door een zeef van 70-µm cel in de vorige buis met cellen van het supernatans van de eerste behandeling van de DTE (uit stap 4.3).
    Opmerking: De resterende intestinale stukken worden gebruikt voor het isoleren van lymfocyten van de lamina propria. Kwaliteitscontrole: Een stukje weefsel kan worden verwijderd en histologisch gecontroleerd om ervoor te zorgen dat de epitheliale cellen aanwezig zijn en de kelder membraan intact is.
  6. Pellet cellen door centrifugering van het supernatant bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet cel in 8 mL van 44% DG-oplossing bij kamertemperatuur (RT).
  7. Overdracht de 8 mL 44% DG oplossing/celsuspensie in een 17 mm ø x 100 stijl mm 14-mL polypropyleen ronde-onderkant-buis. Onderlaag met 5 mL van RT 67% DG-oplossing. Centrifugeer bij 1600 × g gedurende 20 min op RT zonder gebruik te maken van de rem.
    Opmerking: Buizen kunnen worden voorbehandeld met boviene serum om te voorkomen dat cellen kleven aan de muren van de buis.
  8. Merk op dat levensvatbare cellen een band (buffy coat) op het raakvlak van 44 tot 67 vormen %, dode cellen en sommige epitheliale cellen in een mucoid film aan de bovenkant van het verloop zijn en de rode bloedcellen in de pellet zijn. Verwijder de bovenste laag van de kleurovergang binnen ~ 2 cm van de interface van de door vacuüm aspiratie. Gebruik een pipet van Pasteur de buffy coat op het raakvlak van de oogst en hen overbrengen naar een conische buis van 50 mL, met 40 mL koude oogst media.
  9. Pellet cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL koude oogst media. Levensvatbare cellen tellen met uitsluiting van de trypan blauw.

5. isolatie van Lamina Propria lymfocyten uit de dunne darm

  1. Epitheliale cellen verwijderen uit het intestinale weefsel stukken door 25 mL EDTA-oplossing voorverwarmde toe te voegen aan de kolf, met de resterende intestinale stuks. Roer kolf bij 37 ° C en 220 rpm op een magneetroerder voor 30 min. gebruik een grote magneet aan de buitenzijde van de kolf te houden van de roer-bar en zorgvuldig Verwijder het supernatant terwijl intestinale stukken binnen de kolf.
    Opmerking: (i) EDTA is een calcium-complexvormer die richt zich op calcium-afhankelijke kruispunten en bevordert het losmaken van intestinale epitheliale cellen. (ii) het supernatant moet bewolkt en kan worden gebruikt voor het isoleren van de IEC als hun collectie is gewenst.
  2. Herhaal stap 5.1.
    Opmerking: Het supernatant moet minder bewolkt na deze incubatie. Kwaliteitscontrole: Een stukje weefsel kan worden verwijderd en histologisch gecontroleerd om ervoor te zorgen dat intestinale epitheliale cellen zijn verwijderd en de kelder membraan intact is. Een monster van het supernatant kan ook worden geëvalueerd door een stroom cytometry om te bevestigen dat leukocyten (CD45+ cellen) afwezig zijn.
  3. Voeg 50 mL RT oogst media aan op de maatkolf. Roer kort met een magneet. Laat intestinale stukken regelen en zorgvuldig Verwijder het supernatant.
    Opmerking: Deze stap zorgt u ervoor de verwijdering van EDTA vóór collagenase spijsvertering zoals EDTA collagenase inactiveert door chelaat de calcium die essentieel zijn voor collagenase functie.
  4. Voeg 30 mL voorverwarmde collagenase oplossing in de kolf en roer intestinale stukken bij 37 ° C en 220 rpm op een magneetroerder voor 45 min.
  5. Verteerd weefsel en supernatant overbrengen naar een conische buis van 50 mL door filteren door middel van een 70-µm cel zeef. Zachtjes distantiëren resterende weefsel stukken met behulp van de zuiger van een injectiespuit 3 mL aan beslag door de filter. Was het filter met 10 mL koude oogst media.
  6. Pellet cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet cel in 8 mL van omgevingstemperatuur 44% DG-oplossing.
  7. Overdracht de 8 mL 44% DG oplossing/celsuspensie in een 17 mm ø x 100 stijl mm 14-mL polypropyleen ronde-onderkant-buis. Onderlaag met 5 mL van omgevingstemperatuur 67% DG-oplossing. Centrifugeer het verlopen bij kamertemperatuur en 1600 × g gedurende 20 minuten met geen rem.
  8. Verwijder de vetlaag bovenop door vacuüm aspiratie. Gebruik een pipet van Pasteur te oogsten van de buffy coat op de interface en de overdracht aan een conische buis van 50 mL, met 40 mL koude oogst media.
  9. Pellet cellen door centrifugatie bij 400 × g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de cel pellet in 1 mL koude oogst media. Levensvatbare cellen tellen met uitsluiting van de trypan blauw.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematische voorstelling van het protocol wordt afgebeeld (Figuur 1). Lymfocyten binnen de intestinale mucosa inductieve en effector sites zijn duidelijk georganiseerd. Peyer de patches (PP) en de mesenterische lymfklieren (MILJ.) bevatten lymfocyten in overzichtelijke T-cel-ruimtes en B-cel follikels, terwijl het intestinaal epitheel bevat lymfocyten die meer diffuus verspreid zijn. De lamina propria (LP) bevat zowel diffuus gedistribueerde lymfocyten e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd voor de isolatie van lymfocyten van de intestinale mucosa inductieve (MLN en PP) en effector (LP en IEL compartiment) sites. Het protocol is ontwikkeld om het evenwicht van de input (keer) en output (levensvatbaarheid en rendement) naar maximalisering van productiviteit en resultaten. Het protocol zorgt er ook voor minimale compartimentaire kruisbesmetting tussen LP en IEL compartimenten.

Verschillende protocollen voor de isolatie van immuun celle...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

B.S.S. wordt ondersteund door NIH grant (R01 AI076457) en fondsen geboden door Stony Brook University. Z.Q. wordt ondersteund door de NIH verlenen (K12 GM102778).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
HEPESFisher ScientificBP310-500
L-glutamine Sigma-aldrichG3126-100G
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140-122
GentamicinLife Technologies15710-072
NatriumhydroxideFisher ScientificS318-500
RPMI 1640Life Technologies21870-076
NatriumbicarbonaatFisher ScientificS233-500
Fetaal bovien serumLife Technologies26140-079
10x Hanks' gebalanceerde zout oplossingSigma-aldrichH4641-500ML
1,4-DithioerythritolSigma-aldrichD9680-5G
0,5M EDTA, pH 8.0Life Technologies15575-020
Calciumchloride hexahydraatSigma-aldrich21108-500G
Magnesiumchloride hexahydraatSigma-aldrichM2670-100G
Collagenase, Type ILife Technologies17100-017
DG-gradiënt stockoplossing (Percoll) GE Healthcare17-0891-01
Rode bloedcel lysis bufferBiolegend420301
70-µm celstrainer Corning352350
14 mL Polypropyleen Ronde BodembuisCorning352059
Erlenmeyer kolf Kimble26500R-50mL
MagneetschuddenThermo Fisher50094596
RoerbalkFisher Scientific14-512-148

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hooper, L. V., Macpherson, A. J. Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota. Nat Rev Immunol. 10 (3), 159-169 (2010).
  2. Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunol. 1 (1), 31-37 (2008).
  3. Lefrancois, L., Lycke, N. Isolation of mouse small intestinal intraepithelial lymphocytes, Peyer's patch, and lamina propria cells. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19(2001).
  4. Sheridan, B. S., Lefrancois, L. Isolation of mouse lymphocytes from small intestine tissues. Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 19(2012).
  5. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. J Immunol Methods. 405, 97-108 (2014).
  6. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. J Vis Exp. (111), (2016).
  7. Koscso, B., Bogunovic, M. Analysis and Purification of Mouse Intestinal Dendritic Cell and Macrophage Subsets by Flow Cytometry. Curr Protoc Immunol. 114, 11-14 (2016).
  8. Goodman, T., Lefrancois, L. Expression of the gamma-delta T-cell receptor on intestinal CD8+ intraepithelial lymphocytes. Nature. 333 (6176), 855-858 (1988).
  9. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Beta2 integrins and ICAM-1 are involved in establishment of the intestinal mucosal T cell compartment. Immunity. 5 (3), 263-273 (1996).
  10. Sheridan, B. S., et al. gammadelta T cells exhibit multifunctional and protective memory in intestinal tissues. Immunity. 39 (1), 184-195 (2013).
  11. Sheridan, B. S., et al. Oral infection drives a distinct population of intestinal resident memory CD8(+) T cells with enhanced protective function. Immunity. 40 (5), 747-757 (2014).
  12. Romagnoli, P. A., et al. Differentiation of distinct long-lived memory CD4 T cells in intestinal tissues after oral Listeria monocytogenes infection. Mucosal Immunol. 10 (2), 520-530 (2017).
  13. Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
  14. Lorenz, R. G., Newberry, R. D. Isolated lymphoid follicles can function as sites for induction of mucosal immune responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 44-57 (2004).
  15. Kim, S. K., Reed, D. S., Heath, W. R., Carbone, F., Lefrancois, L. Activation and migration of CD8 T cells in the intestinal mucosa. J Immunol. 159 (9), 4295-4306 (1997).
  16. Huleatt, J. W., Lefrancois, L. Antigen-driven induction of CD11c on intestinal intraepithelial lymphocytes and CD8+ T cells in vivo. J Immunol. 154 (11), 5684-5693 (1995).
  17. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. J Immunol Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van lymfocytendunne darmPeyerse plaguesmesenteriale lymfeklierenlamina propriaintra epitheliale lymfocytencelzeefdichtheidsgradi ntcentrifugatieflowcytometrieoogstmedium

Gerelateerde artikelen