Isoleren van lymfocyten van het immuunsysteem intestinale kleine muis

Summary

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van de inductieve sites met inbegrip van de darm-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren, en de effector met inbegrip van de lamina propria en de intestinale epitheel van het kleine intestinale immuunsysteem.

Abstract

De intestinale immuunsysteem speelt een essentiële rol bij het handhaven van de barrièrefunctie van het maag-darmkanaal door het genereren van tolerant reacties op dieet antigenen en commensale bacteriën terwijl montage effectieve immuun reacties op enteropathogenic microben. Bovendien is het duidelijk dat lokale intestinale immuniteit een diepgaande invloed op immuniteit van verre en systemische heeft geworden. Daarom is het belangrijk om te bestuderen hoe een intestinale immuunrespons wordt geïnduceerd en wat de immunologische uitkomst van de reactie is. Hier, een gedetailleerd protocol voor de isolatie van lymfocyten van dunne darm inductieve sites zoals de gut-geassocieerde lymfoïde weefsel Peyer van patches en de zuig mesenterische lymfklieren en effector sites zoals de lamina propria wordt beschreven en de intestinale epitheel. Deze techniek zorgt voor isolatie van een groot aantal lymfocyten van kleine intestinale weefsels met optimale zuiverheid en levensvatbaarheid en minimale compartimentaire kruisbesmetting binnen acceptabele tijdsbeperkingen. De technische mogelijkheden om te isoleren van lymfocyten en andere immune cellen van intestinale weefsels kan het begrip van immuunresponsen gastro-intestinale infecties, kankers en ontstekingsziekten.

Introduction

Het maag-darmkanaal (GI) heeft vele plooien en uitsteeksels die vertegenwoordigt de grootste interface scheiden van het interne lichaam en de externe omgeving. De intestinale immuunsysteem speelt een essentiële rol bij het handhaven van de barrièrefunctie van het GI-darmkanaal. Het is voortdurend blootgesteld aan dieet antigenen, commensale bacteriën en pathogene microben. Zo moet het verdraagzaam aan voedsel antigenen en commensale bacteriën blijven met behoud van het vermogen om snel genereren een effectieve immuunrespons op enteropathogenic microben¹. De intestinale immuunsysteem kan anatomisch worden onderverdeeld in inductieve sites, waar ....

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren van het National Institute of Health en goedgekeurd door de Stony Brook University institutionele Animal Care en gebruik Comité.

Opmerking: Zorg ervoor dat alle goedkeuringen zijn verleend voordat u procedures uitvoert.

1. oplossing voorbereiding

1. HGPG (HEPES, L-glutamine, penicilline/streptomycine en gentamycine), 100 ×
   1. Meng 59.6 g HEPES (500 mM definitieve), 14.6 g L-glutamine (200 mM in finale), 1 × 10⁶ U penicilline (2.000 U/mL definitief), 1 g streptomycine (2 mg/mL final) en 2,5 mg gentamicine (5 ....

Results

Een schematische voorstelling van het protocol wordt afgebeeld (Figuur 1). Lymfocyten binnen de intestinale mucosa inductieve en effector sites zijn duidelijk georganiseerd. Peyer de patches (PP) en de mesenterische lymfklieren (MILJ.) bevatten lymfocyten in overzichtelijke T-cel-ruimtes en B-cel follikels, terwijl het intestinaal epitheel bevat lymfocyten die meer diffuus verspreid zijn. De lamina propria (LP) bevat zowel diffuus gedistribueerde lymfocyten e.......

Discussion

Een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd voor de isolatie van lymfocyten van de intestinale mucosa inductieve (MLN en PP) en effector (LP en IEL compartiment) sites. Het protocol is ontwikkeld om het evenwicht van de input (keer) en output (levensvatbaarheid en rendement) naar maximalisering van productiviteit en resultaten. Het protocol zorgt er ook voor minimale compartimentaire kruisbesmetting tussen LP en IEL compartimenten.

Verschillende protocollen voor de isolatie van immuun celle.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
L-glutamine	Sigma-aldrich	G3126-100G
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Gentamicin	Life Technologies	15710-072
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
RPMI 1640	Life Technologies	21870-076
Sodium bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Fetal bovine serum	Life Technologies	26140-079
10x Hanks' balanced salt solution	Sigma-aldrich	H4641-500ML
1,4-Dithioerythritol	Sigma-aldrich	D9680-5G
0.5M EDTA, pH 8.0	Life Technologies	15575-020
Calsium chloride hexahydrate	Sigma-aldrich	21108-500G
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-aldrich	M2670-100G
Collagenase, Type I	Life Technologies	17100-017
DG gradient stock solution (Percoll)	GE Healthcare	17-0891-01
Red Blood Cell Lysis Buffer	Biolegend	420301
70-µm cell strainer	Corning	352350
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube	Corning	352059
Erlenmeyer flask	Kimble	26500R-50mL
Magnetic stirrer	Thermo Fisher	50094596
Stir bar	Fisher Scientific	14-512-148