Volgende Endocardial weefsel mutaties via de cel Photoconversion in het Embryo van de zebravis

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode voor de photoconversion van Kaede fluorescent proteïne in endocardial cellen van de levende zebrafish embryo waarmee het volgen van endocardial cellen tijdens de atrioventriculaire kanaal en Atrioventriculaire hart ventiel ontwikkeling .

Samenvatting

Tijdens de embryogenese, cellen ondergaan dynamische veranderingen in het gedrag van de cel, en ontcijferen van de cellulaire logica achter deze veranderingen is een fundamentele doelstelling op het gebied van de ontwikkelingsbiologie. De ontdekking en ontwikkeling van photoconvertible eiwitten hebben ons begrip van deze dynamische veranderingen sterk geholpen door het verstrekken van een methode om optisch Markeer cellen en weefsels. Terwijl photoconversion, time-lapse microscopie en latere beeldanalyse hebben bewezen als zeer succesvol in het blootleggen cellulaire dynamiek in organen zoals de hersenen of het oog, wordt deze aanpak echter in het algemeen niet gebruikt in de ontwikkelingslanden hart wijten aan uitdagingen van de snelle beweging van het hart tijdens de cardiale cyclus. Dit protocol bestaat uit twee delen. Het eerste deel beschrijft een methode voor photoconverting en vervolgens endocardial cellen (EdCs) bijhouden tijdens zebrafish Atrioventriculaire kanaal (AVC) en Atrioventriculaire hart ventiel ontwikkeling. Bij deze methode wordt tijdelijk stoppen van het hart met een geneesmiddel om nauwkeurige photoconversion plaatsvinden. Harten zijn toegestaan om te hervatten gewonnen na verwijdering van de drug en de embryonale ontwikkeling blijft normaal totdat het hart weer voor hoge resolutie beeldvorming van photoconverted EdCs op een moment later ontwikkelings tijd wordt gestopt. Het tweede deel van het protocol beschrijft een methode van de analyse van het beeld om te kwantificeren van de lengte van een photoconverted of niet-photoconverted gebied in de AVC in jonge embryo's door het toewijzen van het fluorescerende signaal van de driedimensionale structuur naar een tweedimensionale kaart . Samen, de twee delen van het protocol kan men de oorsprong en werking van cellen waaruit de zebravis AVC en Atrioventriculaire hartklep, en potentieel kan worden toegepast voor het bestuderen van mutanten, morphants of embryo's die zijn behandeld met te onderzoeken reagentia die AVC en/of klep ontwikkeling verstoren.

Inleiding

De zebravis is momenteel een van de belangrijkste gewervelde modellen om te studeren cellulaire en ontwikkelingsbiologie processen in vivo. Dit is grotendeels te wijten aan de de zebravis optische transparantie en inschikkelijkheid aan genetics, waardoor het een krachtig model voor de toepassing van optische technieken met genetisch photoresponsive eiwit technologieën¹gecodeerd. Specifiek voor de studie van hart ontwikkeling, zebravis ontvangen voldoende zuurstof via diffusie zodanig dat zelfs mutanten zonder hartslag kunnen overleven door middel van de eerste week van ontwikkeling, het toelaat van analyses over de gevolgen van ontwikk....

Protocol

1. voorbereiden van mallen en monteren van agarose

1. Maak een mal met de afmetingen weergegeven in Figuur 1 met behulp van een 3D-printer of traditionele mechanische werkplaatsgereedschap.
2. Pipetteer ongeveer 1,5 mL gesmolten 1% agarose in een 35-mm kunststof ophangsysteem schotel. Plaats de plastic mal in de vloeibare agarose, verzorgen om te voorkomen dat de lucht van de overlapping tussen de schimmel en de agarose. Zet de schotel bij 4 ° C, wachten tot de agarose verhardt (dit duurt ongeveer 5 minuten) en deze vervolgens verwijdert de plastic mal.
3. De montage schotel voor later gebruik opslaan, dekking van de ....

Resultaten

Een voorbeeld van een embryo photoconverted op 48 hpf en beeld weer bij 80 hpf wordt weergegeven in Figuur 2, films 1 en 2. Kaede bloot aan licht van 405 nm onherroepelijk bekeerlingen van de eiwitten uit zijn fluorescente groene vorm aan fluorescerende rode vorm, waardoor het gedrag van cellen die zijn gemarkeerd met de groene of de rode vorm moet worden gevolgd met betrekking tot hun differentieel gekleurde buren tijdens de.......

Discussie

Timing van photoconversion: Hoewel Kaede blijft helder uitgedrukt in EdCs zelfs bij 96 hpf, opgemerkt moet worden dat als het embryo groeit, laserlicht meer diffundeert voordat zij de AVC tot, beperkte photoconversion van Kaede moeilijker te maken. At embryonale stadia later dan 55 hpf, het ballonvaren van het ventrikel en het atrium betekent ook dat de paarse laserstraal gebruikt voor photoconversion AVC cellen zonder eerste doorsnijdt het atrium of de ventrikel niet bereiken. Dit betekent dat voorbij 55 hpf, o.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materialen
Noodzakelijke apparatuur voor het fokken van vissen en het verzamelen van eieren (zie het Zebrafish Book22 voor details).
Stereomicroscoop
Rechtopstaande confocale microscoop (Uitgerust met lasers die werken op 488 nm, 561 nm en 405 nm, een instelbare multifoton laser en een Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objectief)	Leica	Leica SP8
Heat block	ThermoScientific	88870001
35 mm x 10 mm weefselkweekschaal	Falcon	353001
6 wel plaat	Falcon	353046
Petrischaal
Pincet
Glazen pipette
Vorm
Reagentia
8 mg/mL Tricaine stockoplossing
1 M BDM stockoplossing
UltraPure lage smeltpunt agarose	Invitrogen	16520-050
Agarose	Lonza	50004
PTU (1-fenyl-2-thioureum)	Sigma Aldrich	P7629
Embryo medium: 30x stockoplossing
Software
Matlab uitgerust met de Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes	MathWorks
8 mg/mL Tricaine stockoplossing
200 mg tricainepoeder (Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonzuur)	Sigma-Aldrich	E10521
25 mL Danieau
Pas aan naar pH 7, verdeel in portieën en bewaar bij -20 °C
1 M BDM stockoplossing
1 g BDM	Sigma-Aldrich	112135
10 mL ddH2O
Verdeel in portieën en bewaar bij -20 °C
Embryo medium: 30x stockoplossing
50.7 g NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
0.78 g KCl	Sigma-Aldrich	7447-40-7
1.47 g Magnesiumsulfaat	Sigma-Aldrich	7487-88-9
2.1 g Calciumnitriet tetrahydraat	Sigma-Aldrich	13477-34-4
19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur)	Sigma-Aldrich	7365-45-9
Pas aan naar pH 7.2 en bewaar op kamertemperatuur
Vorm
PlasCLEAR hars	Asiga
Plus 39 Freeform Pico 3D printer	Asiga