Method Article

Kwantitatieve en kwalitatieve methode voor sphingomyelinase door LC-MS met behulp van twee Stable ionenpaar label sphingomyelinase soorten

DOI:

10.3791/57293

⸱

May 7th, 2018

 ,  , 
1Faculty of Pharmaceutical Sciences, Teikyo University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol te kwantificeren en kwalificeren van elke soort van de sphingomyelinase met behulp van meerdere reactie controle en MS/MS/MS mode, respectievelijk.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presenteren we een methode voor het analyseren van sphingomyelinase (SM) kwalitatief en kwantitatief door vloeibare chromatografie-electrospray ionisatie-tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS/MS). SM is een gemeenschappelijk sfingolipiden samengesteld uit een phosphorylcholine en een ceramide als de hydrofiele en hydrofobe component, respectievelijk. Een aantal soorten SM in zoogdiercellen wegens een verscheidenheid in de sphingoid lange keten base (LCB) aanwezig zijn en een N-acyl deel in het ceramide. In dit verslag, tonen we een methode voor het schatten van het aantal koolstof en dubbele bindingen in een LCB en een N-acyl groep op basis van hun overeenkomstige product-ionen in MS/MS/MS (MS3) experimenten. Daarnaast presenteren wij een kwantitatieve analysemethode voor SM met behulp van twee stabiele ionenpaar gelabelde SM soorten, dat vergemakkelijkt het meetbereik in SM kwantificatie bepalen. De huidige methode zal zitten nuttig in karakterisering van een verscheidenheid van SM soorten in biologische monsters en industriële producten zoals cosmetica.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sphingomyelinase (SM) is een gemeenschappelijk sfingolipiden bij zoogdiercellen. SM is gesynthetiseerde intracellulair1 en heden als een voorloper voor andere sfingolipiden zoals een sphingosine-1-fosfaat en een ceramide, die hebben een cruciale rol in immuun cel mensenhandel en huid barrière homeostase, respectievelijk2, 3. De nauwkeurige analyse van de SM-metabolisme is dus belangrijk voor het ophelderen van de functies van het fysiologische en pathologische van sfingolipiden.

SM is samengesteld uit een ceramide en een phosphorylcholine die is gekoppeld aa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) vóór gebruik. Draag handschoenen om te minimaliseren van monster besmetting door huid-afgeleide SM. Dit protocol werd toegepast op HeLa cellen gekweekt in Eagle's minimale essentiële medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 1.000 U/L penicilline en streptomycine van 100 mg/L.

1. bereiding van de monsters van de lipide

Opmerking: Het is belangrijk dat alle glaswerk waaronder reageerbuisjes met Teflon beklede schroefdoppen wasmiddel-vrij zijn.

  1. Extractie van totale lipide breuk van cel homogenaat met behulp va....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemisch gesynthetiseerd d18:1 / 24:0 SM (Figuur 1A) en d18:1 / 24:0 SM in lipide monsters HeLa cellen (Figuur 1B) is onttrokken werden geanalyseerd door LC-ESI-MS3 tewerkstellen [M + HCOO]- en [M-CH3]- als eerste en tweede voorloper ionen, respectievelijk. Merk op dat de intensiteit van het spectrum van demethylated-sphingosylphosphorylcholine (SPC) (<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de huidige kwalitatieve methode, verkregen we MS3 product ionen een SPC en een N-acyl deel daarvan. Het is essentieel voor het correct toewijzen van zowel een SPC en een N-acyl deel daarvan. Te dien einde moet opgemerkt worden dat andere phosphorylcholine-bevattende moleculen kunnen ook worden gedetecteerd als MS3 product ionen. Diacyl-dunlaag (PC) en plasmalogen-PC zijn overvloedig aanwezig in cellen van zoogdieren, en hun hydrophobicity is vergelijkbaar met die van SM. Daarom,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen conflict van belang hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een onderzoek subsidie van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan (KAKENHI) naar K.H. (#15 K 01691), Y.F. (#15 K 08625), K.Y. (#26461532) en een subsidie voor de studie van hardnekkige ziekte Project van het ministerie van Gezondheid, arbeid en welzijn (K.Y. #201510032A). Wij danken de Edanz groep (www.edanzediting.com/ac) voor het bewerken van een ontwerp van dit manuscript.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PBSThermoFisher10010023
100 mm tissue culture dishIWAKI3020-100
Cell scraperIWAKI9000-220
Siliconized 2.0 mL tubeFisher Scientific02-681-321
Test tubeIWAKITST SCR 16-100
Teflon-lined screw capIWAKI9998CAP415-15
Disposable glass tubeIWAKI9832-1310
CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm I.D. x 100 mmShiseido92223Guard cartridge is inserted into cartridge holder, and linked to C18 column
CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm x 10 mm GUARD CARTRIDGEShiseido12197
Cartridge holderShiseido12415
AcetonitrileWako018-19853
2-Propanol (Isopropyl Alcohol)Wako161-09163
MethanolWako134-14523
Formic acidWako066-00466
28% Ammonia waterWako016-03146
Sonicator (bath type)SHARPUT-206H
Vortex mixer for glass test tubeTAITECMix-EVR
1.4 mL glass vialTomsic500-1982Samples are stored in 1.4 mL glass vial sealed with screw cap and 8 mm septum at -20°C
8 mm septumTomsic200-3322When samples are analyzed, screw caps are replaced with screw caps with slit septum
Screw cap for 1.4 mm glass vialTomsic500-2762
Screw cap with slit septumShimadzu GLCGLCTV-803
PVDF 0.22 µm filterMilliporeSLGVR04NL
Triple quadrupole and quadrupole linear ion trap mass spectrometrySCIEXQTRAP4500
The software for data acquisition and analysis of product ion spectraSCIEXAnalyst
The software for data integration in quantitative analysisSCIEXMultiQuant
HPLC systemShimadzuNexera
Glass bottleSansyo85-0002
d18:1/24:0 sphingomyelinAvanti Polar Lipids860592P
SphingosylphosphorylcholineMerck567735
Fetal bovine serumThermoFisher 26140079
L-glutamineThermoFisher 25030081
Penicillin and streptomycinSigmaP4333
Eagle’s minimum essential mediumSigmaM4655

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
  2. Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. Lysophospholipid receptors in drug discovery. Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).
  3. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sphingomyelin AnalysisLC MS MS MethodStable Isotope LabelingLipid ExtractionMobile Phase PreparationTriple Quadrupole MSProduct Ion SpectraStandard Curve ConstructionHeLa Cell SamplesCosmetic Lipid Characterization

Related Articles