Protocol voor Acute en chronische ecotoxiciteit testen van de Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Samenvatting

In dit werk beschrijven we een acute, chronische en multigeneratie bioassay om te bestuderen van de effecten van gemeenschappelijke en gecombineerde stressoren op de Turquoise poolfish Nothobranchius furzeri. Dit protocol is ontworpen om te bestuderen levensgeschiedenis eigenschappen (sterfte, groei, vruchtbaarheid, gewicht) en kritieke thermische maximum.

Samenvatting

De poolfish Nothobranchius furzeri is een opkomende model-organisme in het gebied van ecotoxicologie en de toepasbaarheid ervan in de acute en chronische ecotoxiciteit testen heeft aangetoond. Over het geheel genomen is de gevoeligheid van de soorten aan giftige stoffen in het bereik met, of hoger dan die van andere soorten model.

Dit werk beschrijft protocollen voor acute, chronische en multigeneratie bioassays van enkelvoudige en gecombineerde stressor effecten op N. furzeri. Vanwege de korte rijpingstijd en levenscyclus kunnen dit gewervelde model de studie van eindpunten zoals rijpingstijd en vruchtbaarheid binnen vier maanden. Transgenerationele volledige levenscyclus blootstelling proeven kunnen worden uitgevoerd in slechts 8 maanden. Aangezien deze soort produceert eieren die droogte-resistente zijn en levensvatbaar blijven jarenlang, de eigen cultuur van de soorten is niet nodig maar individuen kunnen worden aangeworven, wanneer dit nodig is. De protocollen zijn ontworpen om de maatregel levensgeschiedenis eigenschappen (sterfte, groei, vruchtbaarheid, gewicht) en kritieke thermische maximum.

Inleiding

Profielen van de gevoeligheid van een matrix voor toxische stoffen in strategisch geselecteerde soorten zijn beschreven¹ voor de Europese REACH wetgeving (registratie, evaluatie, autorisatie en beperking van chemische stoffen). Acute of op korte termijn toxiciteitstesten werden meestal gebruikt voor dit doel als ze een snelle indicatie van een soort gevoeligheid geven. Echter in hun natuurlijke omgeving, organismen worden blootgesteld gedurende veel langere en volledige levenscyclus of zelfs meerdere generaties kon worden getroffen². Bovendien worden organismen in vervuilde omgevingen meestal blootgesteld aan meer dan één stressor tegelijkertijd, die met elkaar samenwerken kunnen, mogelijk resulterend in synergetische effecten³. Vandaar, veilige concentraties berekend op basis van acute, één stressor toxiciteitstesten kunnen onderschatten de werkelijke risico's die worden opgelegd door toxische stoffen in natuurlijke omgevingen. Het is daarom aan te raden om ook het bestuderen van de chronische en multigeneratie effecten van subletale concentraties van toxische stoffen in een milieu relevante context zoals bepleit door de EuropeseCommissie^4,5 en de USEPA (United States Environmental Protection Agency)^6,7. Vooral in gewervelde onderzoek zijn de kosten op het gebied van arbeid, geld en tijd hoog bij het uitvoeren van studies van de chronische en multigeneratie blootstelling vanwege de relatief lange levensduur van gewervelde dieren ten opzichte van ongewervelde modelorganismen. Daarom is het raadzaam om te kiezen van de meest geschikte modelorganisme voor vis, afhankelijk van de onderzoeksvraag. Bovendien moet een breed scala van gewervelde dieren beschikbaar om te testen van de algemeenheid van reacties over soorten om het aanpassen van de verordeningen op basis van de meest gevoelige soorten te kunnen zijn. Voor nu moet er een nieuwe, efficiënte protocollen met gewervelde model soorten gekenmerkt door korte levenscyclus te verlagen van de kosten van het uitvoeren van chronische en multigeneratie posities op gewervelde dieren^7,8te ontwikkelen.

De turquoise poolfish Nothobranchius furzeri is een interessant model van vis in dergelijke langdurige blootstelling experimenten vanwege de korte rijpingstijd en levenscyclus (generatietijd minder dan 4 weken⁹) gebruiken. Dit betekent dat ecologisch relevante eindpunten zoals rijpingstijd en vruchtbaarheid binnen een kort tijdsbestek in vergelijking met andere vis modellen⁷kunnen worden bestudeerd. Bovendien, deze vissen produceren droogte-resistente, slapende eieren die levensvatbaarheid jarenlang wanneer opgeslagen onder standaardvoorwaarden, daardoor eliminerend de behoefte aan een continue cultuur⁹. In ecotoxicologisch onderzoek impliceert dit ook dat repliceren vis kunnen allemaal worden uitgebroed op exact hetzelfde moment, wat resulteert in tijd synchrony voor alle dieren, zelfs onder partijen eieren geproduceerd op verschillende tijdstippen. Wij adviseren met behulp van het laboratorium GRZ stam uit te voeren van de experimenten van de blootstelling. Deze spanning presteert goed onder laboratoriumomstandigheden, is homozygoot (met uitzondering van geslacht chromosomen) en het genoom is goed gekarakteriseerd^10,11.

Ecotoxicologisch onderzoek is het belangrijk de juiste reeks testconcentraties wilt selecteren. Te dien einde kunnen verschillende complementaire methoden worden gebruikt. De nominale concentratiebereik kan worden gebaseerd op de gevoeligheid van een aanverwante soorten, zoals Nothobranchius guentheri¹². U kunt ook kan het bereik worden gebaseerd op de gevoeligheid van standaard vis modellen, zoals zebravissen (Danio rerio)² , die een vergelijkbare gevoeligheid voor toxische stoffen in de meeste (Philippe et al. (in review)). In combinatie, met beide opties, moet een oriënterend experiment worden uitgevoerd als de nominale concentratiebereik wilt selecteren. Voor het testen van de acute, moeten onderzoekers streven naar concentratie behandelingen met 100% mortaliteit, tussentijdse mortaliteit en 0% sterfte na 24 uur blootstelling aan de veroorzaken. Voor chronische testen, is het raadzaam om uit te voeren van het oriënterend experiment voor twee weken om te verifiëren als larvale sterfte in de staat met de hoogste testconcentraties niet hoger is dan 10% gedurende deze referentieperiode.

Het protocol kan dienen als een basislijn voor het uitvoeren van acute and chronische blootstelling aan drijvende/varende verontreinigende stoffen op N. furzeri, behandeling van de potentiële effecten van stressoren, zowel op het niveau van individuele en cellulaire. Het kan ook worden gebruikt voor het uitvoeren van meerdere stressor onderzoek zodat een hogere ecologische belang, dat het mengen van verschillende toxische verbindingen of studeren interactieve effecten tussen vervuiling en andere natuurlijke stressoren (bijvoorbeeld predatie) of antropogene stressoren (bijvoorbeeld opwarming van de aarde als gevolg van de klimaatverandering).

Protocol

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de KULeuven.

1. broedeieren en het algemene onderhoud van N. furzeri

1. Bereiden vis medium (pH 7) bij een temperatuur van 14 ° C en gezuiverd water Type II, met toegevoegde gestandaardiseerde zouten, toevoegen aan een geleiding van 600 µS/cm (24 ° C).
2. Selecteer eieren in de GRZ (Gona-Rhe-Zhou) laboratorium lijn die zijn opgeslagen onder gestandaardiseerde condities¹³. Selecteer eieren in de Terugmatch fase (dat wil zeggen klaar om uit te komen), herkenbaar door de aanwezigheid van gouden ogen⁹ en zachtjes overbrengen met een zachte pincet naar een kunststof 2 L tank (niet meer dan ongeveer 30 eieren per tank).
   Opmerking: Om een voldoende aantal gezonde testorganismen, uitkomen tweemaal zoveel eieren als het aantal vereiste vissen larven.
3. Voeg 1 cm van het vis-medium bij 12 ° C en laat de temperatuur van het water geleidelijk convergeren naar kamertemperatuur (24 ° C)⁹. Vis zal uitkomen binnen de eerste 12 uur.
4. Na 24u, feed de hatchlings een geconcentreerde dosis van vers gearceerde Artemianauplii (voor meer informatie over de frequentie en de hoeveelheid voedsel, verwijzen naar het protocol van de fokkerij van Polačik et al. 2016⁹) en verhogen de waterdiepte tot 5 cm door het toevoegen van het vis-medium.
5. Na 36 h, voeden de hatchlings nog een geconcentreerde dosis van vers gearceerde Artemia naupliën en toevoegen van vis medium te verhogen van de waterdiepte tot 10 cm.
6. Incubeer vis recipiënten onder constante temperatuurvoorwaarden (bijvoorbeeld in een incubator, klimaat kamer of verwarmd waterbad) onder een 14 h:10 h licht: donker regime.
7. Vóór het begin van het experiment, complexe vis containers (zonder vissen) met de blootstelling samengestelde door ze te vullen met de hoogste concentratie van blootstelling medium en laat het 's nachts ter beperking van de overdracht van toxische stoffen aan de container in de werkelijke experiment.
8. 48 uur na het uitkomen, selecteer gezonde uitbundige larven om te beginnen met het experiment van de blootstelling. Negeren van de zogenaamde buik-schuifregelaars die konden te vullen hun zwemblaas en hebben dus een bijzondere waardevermindering heeft ondergaan drijfvermogen (continu naar de bodem zinken).

2. korte blootstelling Protocol

Opmerking: Onderzoekers moeten streven naar ten minste 20 replicatieonderzoeken (20 vis in aparte potten) per behandeling. Naast een volledige controle behandeling, moet een oplosmiddel besturingselement worden opgenomen als de stockoplossing van de compound is opgesteld op basis van een oplosmiddel. Het oplosmiddel besturingselement moet bevatten de hoeveelheid oplosmiddel evenaren de oplosmiddelen concentratie in de hoogste concentratie van de blootstelling.

1. De experimentele containers (0.5 L glazen potten) voor te bereiden door labelen hen en ze te vullen met de juiste belichting medium (verschillende toxische concentraties). Voeg de verbinding om te verkrijgen van de juiste concentratie.
2. Larven (48u na uitkomen) afzonderlijk overbrengen naar de containers (1 vis per container voor individuele monitoring).
   Opmerking: Vissen blootstaan individueel om te minimaliseren van mogelijke storende effecten van sociale interactie zoals concurrentie voor voedsel en agressie. Nochtans, zijn vis mag visueel communiceren in overeenstemming met ethische normen voor laboratoriumgebruik dierlijke.
3. Follow-up van deze acute blootstelling voor een duur van maximaal 2 weken. Gedurende die tijd, voeden de vis ad libitum met Artemia naupliën tweemaal per dag, 7 dagen per week.
4. Vernieuw het medium om de andere dag waterkwaliteit te behouden en om te minimaliseren van de potentiële effecten van samengestelde afbraak. Belangrijkste water variabelen controleren (opgeloste zuurstofniveaus moeten groter zijn dan 80%, geleidbaarheid moet liggen tussen 600 en 700 µS/cm, pH tussen 7.8 en 8.2 en hardheid (als CaCO₃) tussen de 350 en 450 mg/L, die binnen het bereik van optimale steigerend omstandigheden ligt voor N. furzeri ⁹). Watermonsters te nemen vóór en na het vernieuwen van het medium om te bepalen van de werkelijke samengestelde concentraties.
5. Eindpunten
   1. Vis voor de sterfte, stress controleren (bijvoorbeeld afwijkend gedrag: zwemmen ondersteboven) of ziekte dagelijks (ochtend, avond). De publicatie van Shedd et al. raadplegen (1999) ¹² voor meer informatie over de waarneming van sterfte, ziekte of stress.
   2. Berekenen van LC₅₀ waarden gebaseerd op mortaliteit met behulp van de dosis / respons-curven (Ritz en Streibig, 2005) op verschillende tijdstippen. De drm -functie gebruiken in de drc-pakket in R v3.2.3 (R Core ontwikkelingsteam, 2016) of vergelijkbare statistische benaderingen.

3. chronische blootstelling Protocol

Opmerking: Gericht op een minimum van 25 vis/voorwaarde bij de aanvang van het experiment, om te minimaliseren van de kans op een scheve sex-ratio en aan potentiële achtergrond sterfte als gevolg van natuurlijke oorzaken (dwz. leeftijd-gerelateerde sterfte).

1. Broedeieren (zie punt 1)
2. Fase I (2 dagen na broedeieren-16 dagen post broedeieren)
   1. Volg protocol zoals wordt beschreven in de 2.1-2.4
   2. Als tijdens de tweede fase van het experiment, zal het medium degraderen gedurende de week (geen verfrissing, zie hieronder). Slaan het normbedrag van medium voor een week in grote containers onder geleide inerte zodat soortgelijke afbraak van de stof.
3. Fase II (16 dagen post broedeieren-einde)
   1. Bereiden van 2 L experimentele glazen potten door complexvormers hen met de compound. Vul de potten met de juiste belichting middellange en voeg een lucht-buis om te beluchten van de pot. Huis vis afzonderlijk in deze potten voor de rest van het experiment. Visuele interactie aan ethische normen toestaan.
   2. Vernieuw het medium eenmaal per week. De vis met een net overbrengen in een nieuwe pot met hetzelfde blootstelling medium. Watermonsters nemen elke dag gedurende een week om te controleren de afbraak van de stof in de behandeling van elke concentratie. Bereken een afbraak curve voor elke behandeling als meerdere stressoren (bv . de toxiciteit van een stof in verschillende temperatuur regimes) getest. Meten van abiotische parameters (pH, temperatuur, % opgeloste zuurstof, geleidbaarheid) drie keer per week.
   3. Vanaf 2 dagen na broedeieren (departement) tot 23 departement, voeden de vissen tweemaal per dag, 7 dagen per week ad libitum Artemia naupliën. Van 24 departement - 37 departement, als aanvulling op het dieet van de advertentie libitumArtemia met gehakte Chironomus larven. Voeden van 38 departement volksgezondheid op, de vis tweemaal per dag, 7 dagen per week ad libitum bevroren Chironomus larven.
4. Eindpunten
   1. Dagelijks controleren vis voor sterfte, ziekte of stress¹².
   2. Om te bepalen van groei, het meten van de lichaamsgrootte van het op een wekelijkse basis (9 departement - 16 departement - 21 departement -...) door de overdracht van vis aan een petrischaal gevuld met medium uit hun reservoir. 4-5 grootte gekalibreerd foto's van de vis van bovenaf nemen (op een vaste hoogte) en analyseren ze digitaal met behulp van een ruimtelijke meten programma (bijvoorbeeld ImageJ).
      Opmerking: Voor volwassen vis, gebruik een hogere petrischaal om behandeling stress te minimaliseren door het houden van alle vissen ondergedompeld gedurende het gehele proces te meten.
   3. Voor mannelijke rijping, Inspecteer visueel of vis dagelijks voor de kleuring van 15 departement vanaf. Controleer de vinnen voor eerste tekenen van huwelijkse verkleuring (seksuele nevenkenmerk). Gebruik de eerste dag waarop dit zichtbaar als een proxy voor mannelijke rijpingstijd is.
   4. Koppel niet-sexed vis met mannetjes van dezelfde behandeling groep of niet-experimentele mannetjes driemaal per week van 30 departement vanaf om te bepalen van vrouwelijke rijpingstijd (de dag dat het eerste ei wordt gestort). Hiervoor de paaitijd protocol beschreven in 3.4.5 te gebruiken.
   5. Voor vruchtbaarheid, paar volwassen vrouwtjes met volwassen mannetjes 3 maal / week vanaf 30 departement, binnen hun behandelingen met behulp van een kruising regeling.
      1. Bereiden van een paai tank (1 L) voor elk paar, met behulp van blootstelling medium uit het mannelijke aquarium aangevuld met het kuitschieten substraat (fijn zand < 500 µm).
      2. Pipetteer van zowel de man als de vrouw in de paaitijd tank en laten paaien voor twee uur. Het minimaliseren van menselijke activiteit of verstoring rond de paaitijd containers tijdens dit proces.
      3. Daarna, zachtjes vis terug overzetten naar hun oorspronkelijke behuizing containers, zonder geen onnodige vermenging van het water, dat van de eieren in de paaitijd substraat dwarrelen zou.
      4. De eieren uitfilteren door het gieten van de paaitijd substraat over een maaswijdte van 500 µm. De eieren tellen en deze overbrengen (met behulp van zachte pincet) te vochtig veenmos in petrischalen^9,14.
      5. Verwijder dode eieren dagelijks. Na een week, zegel het Petri schotel met het afdichten van de film en op te slaan in een temperatuur gecontroleerde incubator bij 28 ° C en een 14:10 cyclus h licht: donker voor onmiddellijke ontwikkeling naar de Terugmatch fase (dat wil zeggen klaar om uit te komen na ongeveer drie weken). Voor langdurige opslag, slaat u de eieren bij 17 ° C in constante duisternis waarop eieren de slapende fase ingaat en levensvatbaar blijven voor meerdere jaren. Bij het aanwerven van vis uit deze slapende eieren voor experimenten, overbrengen in de slapende eieren 28 ° C voorwaarden met 14:10 h licht: donker cyclus voor ongeveer drie weken voor de ontwikkeling naar de Terugmatch fase.
   6. Het meten van de kritieke thermische maximum (CTmax) (een maatregel voor prestaties¹⁵) van volwassen vis.
      1. Gebruik van een bad met water dat verwarmd wordt op een constante snelheid van 0.33 ° C/min en waarin het water voortdurend wordt verspreid. Voeg verschillende 1 L aquaria voor elke afzonderlijke vissen.
         Opmerking: Gezien ruimtebeperkingen in het waterbad, is het nodig om te werken in diverse series. Bij het uitvoeren van statistische analyse door 'series' als een willekeurigheidsfactor, moeten rekening worden gehouden met mogelijke verschillen in omstandigheden tussen serie.
      2. Begin het proces door de vis aan het aquarium toe te voegen wanneer het water in het aquarium heeft de experimentele steigerend temperatuur van de vis (in het algemeen 28 ° C) bereikt. Monitor de temperatuur in de 1 L aquaria van het CTmax-Bad elke 5-min met behulp van een digitale thermometer (0,1 ° C schaal).
      3. Eindigt het proces wanneer de vis er niet in slaagt om een dorso-ventrally rechtop of begint spiertrekkingen zwaar^16,17. Meet de temperatuur in het aquarium van 1 L, oftewel de kritische maximale temperatuur. De vis ook terug overzetten naar haar gelijke huisvestings voor herstel.
   7. Het meten van het gewicht (nauwkeurigheid 0,1 mg) van de vissen op de laatste dag van het experiment door klopte droog en over te dragen op een gewicht boot. Opmerking: Alle vis moet worden gemeten vier uur na de laatste voeding om het gewicht van het voedsel in het darmkanaal standaardiseren.
   8. Euthanaseren van het vis met behulp van 0,1% tricaïne.

4. transgenerationele blootstelling protocol

Opmerking: Voor het meten van transgenerationele effecten van verontreinigende stoffen op N. furzeri, volg het protocol van de chronische blootstelling hierboven beschreven voor de eerste generatie.

1. Twee keer per week, het controleren van de ontwikkeling van de geproduceerde eieren (d.w.z. de tweede generatie) opgeslagen bij 28 ° C 14:10 h licht: donker cyclus voorwaarden door te inspecteren de petrischaaltjes voor embryo's in de Terugmatch fase (Polačik et al. Zie 2016⁹). Wanneer meer dan 50 wordt gerepliceerd van elke ouderlijke behandeling zijn volledig ontwikkeld, zij na het protocol in 1.1 uitkomen.
2. Gezonde, veerkrachtige vis aan precies de zelfde set-up en de behandeling als de ouderlijke vis bloot.

Resultaten

De resultaten van de acute blootstelling van N. furzeri aan verschillende concentraties van koper, berekend zoals 2.5.2, Toon cleardose-respons relaties (Figuur 1). Er is een toename van de sterfte met toenemende toxische concentratie. LC₅₀ waarden afnemen in de tijd, wat betekent dat met PM10, meer tijd voordat 50% van het sterven wordt gerepliceerd verstrijkt. Voor de gedetailleerde resultaten over de acute en chronische blootstelling va...

Discussie

Dit werk beschrijft een nieuwe bioassay met behulp van Nothobranchius furzeri, een opkomende modelorganisme, te bestuderen van het individu en langetermijneffecten van toxische stoffen en andere stressoren gecombineerd. De gepresenteerde protocollen werden met succes toegepast voor het meten van de gevoeligheid van de soorten naar een matrix van toxische stoffen (koper, cadmium, 3,4-dichloroaniline en chloorpyrifos). Als gevolg van de snelle levenscyclus, dit gewervelde model zorgt voor beoordeling van subletale...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
gezuiverd water Type 1 (milli Q)	Millipore
Zee zout	Instant Ocean
2L kunststof tank	SAVIC		Altijd afzonderlijk materiaal voor controle en toxiciteitsbehandelingen
1L kunststof tank (kuitmaken)	Avamoplast		Altijd afzonderlijk materiaal voor controle en toxiciteitsbehandelingen
netten	Aqua bilzen		Altijd afzonderlijk materiaal voor controle en toxiciteitsbehandelingen
2L glazen potten	Sepac-Flacover		Altijd afzonderlijk materiaal voor controle en toxiciteitsbehandelingen
0,5L glazen potten	Sepac-Flacover		Altijd afzonderlijk materiaal voor controle en toxiciteitsbehandelingen
Artemia eieren	Ocean Nutrition
chironomus	Ocean Nutrition		ingevroren
tricaine	Sigma Aldrich
Petri schotels	VWR
Parafilm	VWR
pipetten	MLS
pincetten	FST
500 µm maas fijn zeef	/		zelfgemaakt
microcentrifugebuisjes (2ml)	BRAND		Voor opslag van vissen in de vriezer
glazen buisjes	Sigma Aldrich		Voor wateranalyse
weegboot	MLS
Jiffy 7c pellets	Jiffy
waterbad	Gilac		voor Ctmax
vloeibare stikstof	Air liquide
digitale thermometer	Testo AG	testo 926
HETO therm verwarming	Anker Schmitt
gekalibreerd weegschaal	Mettler-Toledo AG
camera	/
platform voor camera	/		zelfgemaakt
Multiparameter kit	HACH
Vriezer (-80°C)	Panasonic Ultra lage temperatuur vriezer
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fysio
homogenisatie buffer	VWR		0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % polyvinyl pyrrolidone, 153 µM MgSO4 en 0.2 % Triton X-100
Chloroform:methanol	Sigma Aldrich
glyceryl tripalmitaat	Sigma Aldrich
amyloglucosidase	Sigma Aldrich	A7420
glucose assay reagens	Sigma Aldrich	G3293
Biorad eiwitkleur	VWR
96-well microtiter plaat	Greiner Bio-one
384 microtiter platen	Greiner Bio-one
2 ml glazen buisjes	Fiers		Voor vetanalyse
2,5ml eppendorf buisjes	VWR
homogenisator	Ultra-turrax TP 18/10
fotospectrometer	Infinite M200 TECAN
verwarming voor glazen buisjes	Hach COD REACTOR
centrifuge	Eppendorf Centrifuge 5415 R
Incubator	Bumako