Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Menselijke pluripotente stamcel cultuur op Polyvinyl Alcohol-Co-itacon zuur Hydrogels met verschillende stijfheid onder voorwaarden Xeno-gratis

8.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57314

⸱

3 februari 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Een protocol is bedoeld om te bereiden polyvinyl alcohol-co-itacon zuur hydrogels met verschillende stijfheid, die waren geënt met en zonder oligopeptides, te onderzoeken van het effect van de stijfheid van biomaterialen op de differentiatie en de verspreiding van de cellen van de stam. De stijfheid van de hydrogels werd gecontroleerd door het crosslinking tijd.

Samenvatting

Het effect van lichamelijke signalen, zoals de stijfheid van biomaterialen op de proliferatie en differentiatie van stamcellen, is onderzocht door verschillende onderzoekers. De meeste van deze onderzoekers hebben echter polyacrylamide hydrogels gebruikt voor cel van de stam cultuur in hun studie. Daarom is hun resultaten zijn omstreden omdat deze resultaten afkomstig van de specifieke kenmerken van de polyacrylamide en niet van de fysieke keu (stijfheid) van de biomaterialen zijn mogelijk. Hier beschrijven we een protocol voor het voorbereiden van de hydrogels, die niet gebaseerd zijn op polyacrylamide, waar verschillende stuurpen, cellen, met inbegrip van menselijke embryonale stamcellen (ES) cellen en menselijk geïnduceerde pluripotente (iPS) stamcellen, kan worden gekweekt. Hydrogels met verschillende stijfheid waren bereid uit bioinert polyvinyl alcohol-co-itacon zuur (P-IA), met stijfheid gecontroleerd door crosslinking mate door het crosslinking tijd wijzigen. De P-IA hydrogels geënt met en zonder oligopeptides afgeleid van extracellulaire matrix werden onderzocht als een toekomstige platform voor cultuur van de cel van de stam en differentiatie. De cultuur en de passage van vruchtwater vloeistof stamcellen, cellen van de stam van de adipeus afkomstige, menselijke ES-cellen en menselijke iPS cellen wordt hier in detail beschreven. De oligopeptide P-IA hydrogels bleek superieur voorstellingen, die werden veroorzaakt door hun stijfheid eigenschappen. Dit protocol rapporteert de synthese van de biomaterial, hun oppervlakte manipulatie, samen met de beheersing van de stijfheid eigenschappen en ten slotte hun invloed op het lot van de cel van de stam met behulp van xeno-vrije cultuuromstandigheden. Gebaseerd op recente studies, kunnen dergelijke gemodificeerde substraten fungeren als toekomstige platformen te ondersteunen en het lot van verschillende stamcellen lijn naar verschillende verbanden; en verder, regenereren en de functies van de verloren orgaan of weefsel herstellen.

Inleiding

Het lot van de cel van de stam differentiatie in een bepaalde bloedlijn van cellen en de lange termijn proliferatie van cellen van de stam, vooral menselijke geïnduceerde pluripotente (iPS) cellen en cellen van menselijke embryonale stamcellen (ES), is bekend door remmers, groeifactoren, worden gereguleerd en / of kleine biologische actieve moleculen in kweekmedia. Onlangs, de fysieke signalen van de biomaterialen, met name de stijfheid van de cel cultuur biomaterialen, zijn erkend als een belangrijke factor voor het begeleiden van het lot van de cel van de stam proliferatie en differentiatie1,2, 3,4,5,6. Daarom zijn verschillende onderzoekers begonnen met het onderzoeken van het lot van stamcellen, die worden gekweekt op hydrogels, op de differentiatie, voornamelijk met behulp van polyacrylamide hydrogels met verschillende stijfheid.

De stijfheid van biomaterialen kunt focal verklevingen, cel morfologie, cel fenotype en hechting van de cel van de stam, met name in de teelt van tweedimensionale (2D)1,,2,,3,5. Mechano-sensing van biomaterialen door stamcellen wordt over het algemeen beheerd door focal hechting signalering via integrine receptoren. NMMIIA, nonmuscle myosin IIA-afhankelijke contractility van het cytoskelet van actine speelt een cruciale rol in het proces van de mechanosensing van stamcellen in 2-D-cel teelt systemen3,4,5, 7,8,9,10,11.

Engler en zijn collega's ontwikkelde een interessant idee dat adulte stamcellen, zoals het beenmerg (BMS) stamcellen gekweekt op cel cultuur biomaterialen met een soortgelijke stijfheid aan die van specifieke weefsels, de neiging om te differentiëren in cellen die afkomstig is van specifieke weefsels5. BMS cellen geïncubeerd op 2D-zachte polyacrylamide hydrogels bekleed met collageen type I (met een stijfheid die vergelijkbaar is met die van de hersenen weefsels) in expansie media werden spontaan veroorzaakte om te differentiëren in vroege neuron lineages, overwegende dat BMS cellen gekweekt op hydrogels met een vergelijkbaar met die van de spier of collagene bot weefsels stijfheid bleken voor het opwekken van differentiatie in vroege lineages van myocytes en botcellen, respectievelijk op 2D-polyacrylamide hydrogels3,5. Veel onderzoekers hebben onderzocht het lot van de cel van de stam van differentiatie gekweekte op polyacrylamide hydrogels geïmmobiliseerd met collageen type ik12,13,14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. echter, dient te worden opgemerkt dat sommige tegenstrijdige1,verslagen18,22,23,24 bestaan voor het bekende idee gesuggereerd door Engler et al. 5 dit is omdat de Engler idee5 werd ontwikkeld uitsluitend op polyacrylamide hydrogels en hun resultaten zijn afkomstig uit specifieke kenmerken van de biomaterial (polyacrylamide), en niet alleen uit de fysieke keu (stijfheid) van de biomaterial. Daarom is het belangrijk om een ander type hydrogel, waarvan de stijfheid kan worden gecontroleerd door crosslinking van de hydrogels. Voor dit doel, werden bioinert hydrogels ontwikkeld, en die verkrijging van polyvinyl alcohol-co-itacon zuur (P-IA) met een andere stijfheid, die werd gecontroleerd door de crosslinking graad met een veranderende crosslinking tijd25, 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. de cellen van de stam op nonmodified P-IA hydrogels, evenals P-IA hydrogels geënt met extracellulaire matrices (ECMs) en oligopeptides kunnen worden gekweekt. In een eerdere studie25, werden menselijke hematopoietische stamcellen (hHSCs) uit het navelstrengbloed gekweekt op P-IA hydrogels met verschillende stijfheid waarden variërend van een 3 kPa tot 30 kPa opslag modulus waar fibronectine of een oligopeptide afgeleid van fibronectine (CS1, EILDVPST) was geënt op de P-IA hydrogels. Hoge ex vivo vouw uitbreiding van hHSCs werd waargenomen in de P-IA hydrogels geënt met CS1 of fibronectin, die een tussenliggende stijfheid variërend van 12 kPa tot 30 kPa25weergegeven.

Menselijke iPS en ES-cellen niet kunnen worden geteeld op conventionele weefselkweek polystyreen (TCP) gerechten33,34 omdat menselijke ES en iPS cellen specifieke binding aan ECMs, zoals vitronectin of laminin vereisen om hun pluripotent tijdens langetermijnkweek. Daarom werden verschillende structuren van oligopeptide-geënt P-IA hydrogels met optimale stijfheid kenmerken ontworpen en voorbereid in formaties van één keten, één keten met een gezamenlijke segment, een dubbele ketting met een gezamenlijke segment en een vertakt-type keten32. Oligopeptide sequenties werden geselecteerd uit integrine - en glycosaminoglycaan-bindende domeinen voor ECMs. De P-IA hydrogels geënt met vitronectin afkomstige oligopeptides met een dubbele ketting of gezamenlijke segment, die hebben een opslag-modulus bij ongeveer 25 kPa, ondersteund de langetermijnkweek van menselijke ES en iPS-cellen voor meer dan 12 passages onder xeno-vrij en chemische omschreven voorwaarden32. Het gecombineerde segment en de dubbele ketting met celadhesie-moleculen op de hydrogels vergemakkelijkt de proliferatie en pluripotent van menselijke ES en iPS cellen32. Hier, een protocol voor het voorbereiden van P-IA hydrogels (met een opslag modulus van 10 kPa naar 30 kPa, die werd gemeten onder natte omstandigheden in de lucht) geënt met en zonder oligopeptides of ECMs wordt beschreven. Hoe cultuur en doorgang van verschillende cellen van de stam (met inbegrip van vruchtwater vloeistof stamcellen, adipeus-afgeleide cellen van de stam, menselijke ES-cellen en cellen van menselijke iPS) wordt weergegeven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De experimenten in deze studie werden goedgekeurd door de ethische comités van het Taiwan Landseed ziekenhuis (IRB-13-05) en de nationale centrale Universiteit. Alle experimenten zijn uitgevoerd met inachtneming van alle relevante en toepasselijke gouvernementele en institutionele richtsnoeren en verordeningen tijdens deze studie.

1. oplossing en voorbereiding van de Media

  1. Polymeer zuivering
    1. Zuiveren van P-IA met carbonzuur groep met een graad van hydrolyse van > 96,5% door het wassen van P-IA met ethanol. 20 g P-IA in 200 mL ethanol plaats in een conische bekerglas van 500 mL en doorroeren op een magneetroerder voor 24-30 h. Exchange de ethanol met verse ethanol elke 8-10 h.
    2. P-IA uit de ethanol door filtratie met behulp van een trechter Büchner verwijderen.
    3. P-IA door vacuüm drogen bij kamertemperatuur gedurende 24 uur drogen.
      Opmerking: Het wordt aanbevolen om het schoon de val in het vacuüm drogen-systeem (door het verwijderen van ethanol) vaak, vooral tijdens de eerste paar uur, omdat de val heeft de neiging om verstopt raken na de verwijdering van een grote hoeveelheid ethanol uit P-IA.
  2. Bereiding van de oplossing van de P-IA
    Opmerking: Voeg het polymeer zeer langzaam in het oplosmiddel (water). Het wordt aanbevolen om ten minste 15 minuten toe te voegen van de P-IA in het oplosmiddel. Als oplosmiddel wordt toegevoegd in het polymeer, zou het polymeer niet volledig worden opgelost. Wees voorzichtig niet te genereren explosieve koken van de P-IA oplossing. Gebruik beschermende bril tijdens de bereiding van de oplossing van de P-IA. Het proces van de verwarming van de P-IA oplossing is van essentieel belang te ontbinden kristallijne P-IA. Het is voorgesteld (en beter) te bereiden van de oplossing van de P-IA in een relatief schone laboratoriumruimte, indien mogelijk.
    1. Los van de P-IA in zuiver water aan een 0.050 gewicht % concentratie voor de cel teelt experiment of een gewicht 0,50% voor de meting van de rheometer: bijvoorbeeld los 50 mg P-IA in 100 mL zuiver water voor celkweek en 500 mg P-IA in 100 mL van de geïoniseerd (DI) water voor de rheometer metingen.
    2. De P-IA oplossing voor 1 h op de hete plaat doorroeren.
      Opmerking: Om te voorkomen dat explosieve kokend, niet Verwarm de oplossing meer dan 95 ° C. Explosieve koken van de polymeeroplossing bij een hoge temperatuur kan genereren huid brandwonden. Daarom, de verwarming van P-IA zeer zorgvuldig uitvoeren en bewaken van de temperatuur van de P-IA oplossing tijdens de verwarming.
    3. Nadat de P-IA oplossing werd gekoeld bij kamertemperatuur, doorroeren van de P-IA oplossing bij kamertemperatuur voor 48 h. verlof hete P-IA oplossing op de hete plaat zonder verwarming en vervolgens verlaten zonder agitatie bij kamertemperatuur gedurende 20-24 uur om ervoor te zorgen dat luchtbellen niet aanwezig in de P-IA oplossing.
  3. Bereiding van de oplossing van het crosslinking
    1. De samenstelling van het crosslinking oplossing 1.0 gewicht % Glutaaraldehyde van 25% waterige Glutaaraldehyde oplossing maken, 20,0% Na2dus gewicht4 gebruik van 99% > zuiverheid en 1.0 gewicht % H2dus4. Bijvoorbeeld, voor een 6 of 12 goed cel cultuur plaat, voeg 100 µL van Glutaaraldehyde oplossing, 2 g natriumsulfaat en 100 µL van zwavelzuur in 10 mL zuiver water.
  4. Menselijke ES/PS cel kweekmedia
    Opmerking: Gebruik DMEM/F12 media, essentiële 6 media en essentiële 8 media voor de cultuur van de cel.
    1. Bevroren 50 X essentiële 8 aanvulling langzaam op de oplossing 's nachts door het ontdooien in de koelkast 4 ° C retourneren
    2. Het toevoegen van een fles van 50 X essentiële 8 supplement in een fles van essentiële 8 basale media. Scheiden van de media in kleine porties (van elk 50 mL) in 100 mL centrifugeren buizen, dan slaan de media bij-20 ° C.

2. P-IA Hydrogel schotel voorbereiding

  1. P-IA film voorbereiding
    1. Een hoeveelheid van 1 mL van de oplossing van de P-IA injecteren met een 35 mm TCP schotel, en droog de schotel in een oven 45 ° C voor 2 dagen om een film van de P-IA in een schone bankje te produceren.
  2. Crosslinking van de P-IA hydrogel gerechten
    1. De P-IA films onderdompelen in een waterige crosslinking oplossing voor 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 en 48u.
      Opmerking: ' P-IA -X' (bijvoorbeeldP-IA-12 h) verwijst naar een P-IA hydrogel kruisverwijzende voor X h (b.v., 12 h).
    2. Na crosslinking, spoel de hydrogels P-IA met zuiver water bij kamertemperatuur en houd vervolgens hydrogels in zuiver water bij kamertemperatuur in een schone bankje.
    3. De P-IA hydrogels steriliseren door onderdompeling in een 75,0 volume/volume% ethanol oplossing voor 1 min, spoel de hydrogels P-IA in zuiver water zes keer, en dan houden de hydrogels P-IA in zuiver water totdat gebruikt voor de teelt van de cel.
  3. P-IA hydrogel gerechten bereiden geënt met oligopeptide of ECM
    1. Activeren van de P-IA hydrogels via onderdompeling in 1 mL van een waterige oplossing bevattende 10 mg/mL N--(3-Dimethylaminopropyl) -N'- ethylcarbodiimide-hydrochloride (EDC) en 10 mg/mL N- hydroxysuccinimide (NHS) voor 1 uur bij 37 ° C of 4 h bij 4 ° C.
    2. Spoel de hydrogels P-IA met 1 mL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,2) 3 keer en dompel de hydrogels P-IA in een PBS-oplossing met 1 mL oligopeptide (100-1.500 µg/mL) of ECM (10-100 µg/mL) gedurende 24 uur bij 4 ° C.
      Opmerking: De oligopeptide sequenties en ECMs gebruikt voor cultuur van de cel van de stam worden samengevat in tabel 1.
    3. Na het enten van de oligopeptide of de ECM, was de P-IA hydrogels met zuiver water 3 keer.
      Opmerking: De P-IA hydrogels geënt met Y µg/mL van oligopeptide of ECM (Z) worden hierna aangeduid als P-IA -Z Xh - ofP-IA-Xh -Z-Y, waarbij X verwijst naar het crosslinking tijd (h), Y geeft de concentratie van de oligopeptide of de ECM, en Z geeft aan een verschillende oligopeptide of ECM.

3. menselijk ES/iPS celkweek

  1. Methode van passage en onderhoud van de ongedifferentieerde menselijke ES en iPS cellen
    1. Handhaven van menselijke ES (bijvoorbeeldWA09 of/m H9) cellen of menselijke iPS (bvHS0077) cellen op Matrigel in essentiële 8 media in 6 cm gerechten, gebruikmakend van standaard menselijke ES/iPS cel28,32van de protocollen van de cultuur.
    2. Incubeer bij-heuvels menselijke ES/iPS cellen met 2,0 mg/mL dispase II in DMEM/F-12 media bij 37 ° C gedurende 8-10 minuten en spoel op menselijke cellen van de ES/iPS tweemaal met DMEM/F12 media.
    3. Na de toevoeging van 2 mL van DMEM/F-12 media aan menselijke ES/iPS cel cultuur gerechten, loskoppelen zwak aanhangend kolonies met behulp van een cel schraper of door pipetteren.
    4. Verzamelen van de menselijke cellen van de ES/iPS in 15 mL centrifugeren buizen en centrifugeer menselijke ES/iPS cellen bij 160 × g gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
    5. Na het centrifugeren, negeren van de DMEM/F12 schorten de menselijke cellen van de ES/iPS in 1 mL E8 media en dan tellen de celdichtheid door middel van een cel itemlogboeken.
    6. Beënt de ES/iPS-cellen na de aanpassing van de juiste dichtheid (1-5 x 104 cellen per cm2 voor passaging of zoals aangegeven) in nieuwe cultuur gerechten (P-IA hydrogels geënt met de oligopeptide of ECM).

4. karakterisering van de karakterisering van de cel van het menselijke ES/iPS

  1. Evaluatie van de activiteit van de alkalische fosfatase (AP)
    1. Het meten van de alkalische fosfatase (AP)-activiteit van menselijke ES/iPS cellen met behulp van een standaard alkalische fosfatase live kleuring.
  2. Immunokleuring
    1. Uitvoeren van immunokleuring van Tra-1-81, SSEA-4, Sox2 en Oct3/4 op hES en heupen cellen te onderzoeken na de conventionele protocol28,32pluripotent.
    2. Het toevoegen van een volume van 0,5 mL van 4% (volume/volume) paraformaldehyde in elk 24 goed gerecht waarin de menselijke cellen van de ES/iPS werden gekweekt, en vervolgens uit te broeden de gerechten gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C om de cellen vast te stellen.
    3. Gecombineerd de paraformaldehyde-oplossing van elk putje. Dan, voeg 1 mL PBS per putje en gecombineerd PBS om te spoelen van de cellen. Het uitvoeren van de spoeldouche proces 3 keer.
    4. Permeabilize celmembranen door toevoeging van 0,5 mL van 0,3% (volume/volume) Triton-X 100 oplossing in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    5. De Triton-X 100-oplossing gecombineerd en voeg 300 µL van 2% (gewicht/volume) bovien serumalbumine (BSA) in PBS (blokkeerbuffer) in elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Verwijder de buffer met blokkerend door pipetteren, en daarna het toevoegen van de gewenste primaire antilichamen (Oct3/4 (1:200), Sox2 (1:200), SSEA-4 (1:200), en Tra-1-81(1:200) Pipetteer, Zie tabel 2) in elk putje, waar 1:200 geeft de antistoffen waren verdund met PBS 200-fold en bebroede voor één dag bij 4 ° C.
    7. Het primaire antilichaam-oplossing gecombineerd, en wassen van de cellen met 300 µL van 0,05% Tween-20 in PBS oplossing 3 keer bij kamertemperatuur.
    8. Voeg 300 µL van secundaire antilichamen (1:200, Zie tabel 2), die specifiek zijn voor het primaire IgG-subtype, in 2% (gewicht/volume) BSA-oplossing in elk goed en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
    9. Wassen van de cellen met 300 µL van 0,05% Tween-20 in PBS oplossing 3 keer bij kamertemperatuur in het donker.
    10. Analyseer de gekleurde cellen door fluorescentie microscopie of confocale microscopie.
  3. Embryoid lichaam vorming
    1. Onderzoeken pluripotent van menselijke ES/iPS cellen door embryoid lichaam (EB) vorming op passages 10 en 20.
      Opmerking: In de buurt van 80% samenvloeiing in 6-Wells-platen is voldoende voor de bereiding van EB vorming.
    2. Spoel menselijke ES of iPS cellen met 2 mL DMEM/F-12 media tweemaal, en vervolgens het onderdompelen van de cellen in 1,5 mL essentiële 6 media.
    3. Snijd in de buurt van 80% confluente menselijke ES of iPS cellen in ongeveer 32 stuks met behulp van 200 µL tips. Vervolgens de cellen van de schotels loskoppelen met behulp van een cel schraper.
    4. Menselijke ES/iPS cellen en overdracht in een 6-well ultralow bijlage schotel verzamelen.
    5. Exchange essentiële 6 media door pipetteren oude media en het toevoegen van nieuwe media om de 2 dagen.
      Opmerking: Cultuur de cellen in suspensie voor 2 weken bij 37 ° C met 5% CO2.
    6. Nadat de EBs werden homogeen opgeschort in essentiële 6 media, overboeken van EBs tot cultuur op 24-well TCP gerechten bekleed met 0,1% gelatine van het gewicht, en cultuur van de cellen in essentiële 6 media voor een extra week.
    7. Vlekken van de cellen met antilichamen tegen merkers van de cellen afgeleid van drie lagen van de embryonale kiemcellen [AFP (endoderm), GFA (ectoderm), β III-tubuline (ectoderm) en SMA (mesoderm)] en evalueren van de cellen met de hierboven beschreven methode van immunokleuring.
  4. Teratoom vorming
    1. Onderzoeken pluripotent van menselijke ES/iPS cellen door Teratoom vorming op passages 10 en 20.
      Opmerking: 5 gerechten uit in de buurt van 80% samenvloeiing in 6-Wells-platen zijn voldoende voor Teratoom vorming (minstens 3 x 106 cellen zijn vereist voor de Teratoom vorming experimenten).
    2. Spoel de cellen met 2 mL DMEM/F-12 media tweemaal, en dan Voeg 1,5 mL DMEM/F-12 media aan de cel cultuur gerechten.
    3. Bijna 80% confluente menselijke ES of iPS cellen in ongeveer 32 stukjes gesneden met behulp van 200 µL tips. Vervolgens de cellen van de schotels loskoppelen met behulp van een cel schraper.
    4. Verzamelen van menselijke ES/iPS cellen in een buis 15 mL centrifugeren en centrifugeer de cellen bij 160 × g gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
    5. Na het centrifugeren, schorten de cel pellets in 100 µL DMEM/F12 en vervolgens mix de cel pellets met 100 µL Matrigel (1:1 volumeverhouding).
    6. Breng de celsuspensie in een vooraf afgekoeld spuit van-20 ° C. Injecteren, in totaal, minstens 3 × 106 cellen subcutaan mannelijke knik-SCID (NOD. CB17 -Prkdascid/JNarl) muizen (5-8 weken).
    7. Na 5-8 weken, ontleden teratomas herstellen met 4,0% (gewicht/volume) paraformaldehyde oplossing en sla bij 4 ° C.
    8. Herstellen van de Teratoom met paraffine, snijd de paraffine-ingebedde teratomas en vlekken met haematoxyline en eosine (H & E) met behulp van een standaardprotocol28,32.
      Opmerking: Onderzoekers kunnen verzenden vaste Teratoom weefsel het bedrijf om te herstellen van de teratomas met paraffine, segment de paraffine-ingebedde teratomas, en de vlekken van het monster met H & E, die meestal in de afdeling Pathologie in ziekenhuizen gebruikt wordt.
  5. De cultuur van de cel van de menselijke adipeus afkomstige stam (advertenties)
    1. Warme voedingsbodems (DMEM met 1% antimycotic antibioticum en 10% foetale runderserum (FBS)), 0,25% van trypsine-EDTA en PBS tot 37 ° C in een water bad voorafgaand aan gebruik.
    2. Wassen menselijke cellen van de advertenties door pipetting 10 mL PBS in elke cultuur 6-cm schotel waar de cellen worden gekweekt.
    3. Voeg 1 mL trypsine-EDTA-oplossing (0,25%) in de 6-cm cultuur gerechten en de oplossing bij 37 ° C gedurende 5 minuten uit te broeden.
    4. Observeren van de cellen in de 6 cm cultuur gerechten onder microscopie om te bevestigen dat de cellen zijn vrijstaand.
    5. Verzamelen van de cellen in een centrifugebuis van 15 mL en voeg een gelijk volume van voedingsbodems (DMEM met 1% antimycotic antibioticum en 10% FBS) in de centrifugebuis te neutraliseren de trypsine-EDTA.
    6. Centrifugeer de cellen bij 250 × g gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
    7. Verwijder het supernatant na het centrifugeren, zorgvuldig door pipetteren, zonder verstoring van de cel-pellet.
    8. Resuspendeer de cellen in de cultuur-media, en vervolgens het zaad van de cellen in de juiste dichtheid (5-10 x 103 cellen per cm2 voor passaging of zoals aangegeven) in nieuwe cultuur gerechten (P-IA hydrogels geënt met en zonder oligopeptides en ECM).
  6. Menselijke vruchtwater stammen (AFS) celkweek
    1. Warm teelt media (DMEM/MCDB 201 (2:3) met 20% foetale runderserum (FBS), 5 ng/mL bFGF en 1% antimycotic antibioticum), 0,25% van trypsine-EDTA en PBS tot 37 ° C in een water bad voorafgaand aan gebruik.
    2. Wassen menselijke AFS cellen door pipetting 10 mL PBS in elk 6-cm cultuur gerecht waar de cellen worden gekweekt.
    3. Voeg 1 mL trypsine-EDTA-oplossing (0,25%) in 6-cm cultuur gerechten en Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
    4. Observeer de cellen op 6-cm cultuur gerechten onder microscopie te bevestigen de cellen zijn vrijstaand.
    5. Verzamelen van de cellen in een centrifugebuis van 15 mL en voeg een gelijk volume van voedingsbodems (DMEM/MCDB 201 (2:3) met 20% foetale runderserum (FBS), 5 ng/mL bFGF en 1% antimycotic antibioticum) in de centrifugebuis te neutraliseren de trypsine-EDTA.
    6. Centrifugeer de cellen bij 250 × g gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
    7. Verwijder het supernatant na het centrifugeren, zorgvuldig zonder verstoring van de cel pellet door pipetteren.
    8. Resuspendeer de cellen in de media van de teelt en vervolgens het zaad van de cellen in de juiste dichtheid (5-10 x 103 cellen per cm2 voor passaging of zoals aangegeven) in nieuwe cultuur gerechten (P-IA hydrogels geënt met en zonder oligopeptide en ECM).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

P-IA hydrogels geënt met ECM-afgeleide oligopeptide (oligoECM) of ECM met de elasticiteit van de verschillende werden voorbereid door het volgen van de reactie-regeling, zoals te zien in figuur 1A, met behulp van verschillende soorten oligoECM (figuur 1B). De elasticiteit van de hydrogels werden geregeld door de toegepaste crosslinking intensiteit (keer) (Figuur 1 c). P-IA hydrogels geënt met vitrone...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

P-IA-oligoECM en P-IA-ECM hydrogels met verschillende stijfheid werden ontwikkeld voor de lange termijn uitbreiding van menselijke ES en iPS cellen handhaven hun pluripotent voor meer dan tien passages van xeno-vrij voorwaarden, alsmede voor de cultuur van menselijke cellen bij de AFS, advertenties cellen, en hematopoietische stamcellen25,28,32. P-IA hydrogels geïmmobiliseerd met oligoECM zijn een uitstekende kandidaat is voor d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd het gedeeltelijk ondersteund door het ministerie van wetenschap en technologie, Taiwan onder grant nummers 106-2119-M-008-003, 105-2119-M-008-006 en 104-2221-E-008-107-MY3. Dit onderzoek werd ook ondersteund door het Taiwan Landseed ziekenhuis Project (NCU-LSH-105-A-001). Een Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek (nummer 15K 06591) van het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie van Japan wordt ook erkend. A. Higuchi wil erkennen voor de internationale wetenschappelijke Partnership Program (IDPB-0062) Vice ceremoniezaal voor Graduate Studies en onderzoek, Universiteit van Koning Saoed Riyad 11451, Koninkrijk van Saoedi-Arabië.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
GTPGPQGIAGQRGVVPH JapannoneSpecificatie: Oligopeptide
Afkorting: Cyclisch RGD, cRGD
GACRGDCLGAPH JapannoneSpecificatie: Oligopeptide
Afkorting: FN1
KGGAVTGRGDSPASSPH JapannoneSpecificatie: Oligopeptide
Afkorting: CS1
EILDVPSTPH JapannoneSpecificatie: Oligopeptide
Afkorting: VN1
KGGPQVTRGDVFTMPPH JapannoneSpecificatie: Oligopeptide
Afkorting: HBP1
GKKQRFRHRNRKGPH JapannoneSpecificatie: Oligopeptide
Afkorting: HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKGPH JapannoneSpecificatie: Oligopeptide
Afkorting: VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMPPH JapannoneSpecificatie: Oligopeptide
Afkorting: VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMPPH JapannoneSpecificatie: Extracellulaire matrix
Afkorting: rVN
VitronectinThermo Fisher scientificA14700Specificatie: Extracellulaire matrix
Afkorting: FN
FibronectinSigma-AldrichF2006Specificatie: Commercieel beschikbaar coatingmateriaal
Afkorting: Synthemax II
Synthemax IICorning3535Specificatie: Polymeer
Polyvinylalcohol-co-itaconic acidJapan VAM & PovalAF-17Specificatie: Chemisch
GlutaraldehydeSigma-AldrichG5882Specificatie: Chemisch
Na2SO4Sigma-Aldrich239313Specificatie: Chemisch
H2SO4Sigma-Aldrich339741Specificatie: Chemisch
Afkorting: EDC
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma-AldrichE7750Specificatie: Chemisch
Afkorting: NHS
N-hydroxysuccinimideSigma-Aldrich56480Specificatie: Chemisch
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148Specificatie: Chemisch
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Specificatie: Celcultuurverbruiksartikel
Cell scraperCorning3008Specificatie: Celcultuurverbruiksartikel
Dispase IISigma-AldrichSI-D4693Specificatie: Celcultuurmedium
Essential 6Thermo Fisher scientificA1516401Specificatie: Celcultuurmedium
Essential 8Thermo Fisher scientificA1517001Specificatie: Celcultuurmedium
DMEM/F12Thermo Fisher scientific11330-032Specificatie: Celcultuurmedium
DMEMThermo Fisher scientific12800-017Specificatie: Celcultuurmedium
MCDB 201Sigma-AldrichM6770Specificatie: ES-cel
Human ES-celWiCell Research Institute, Inc..WA09Specificatie: iPS-cel
Human iPS-celRiken Cell BankHS0077Specificatie: 35 mm
Afkorting: TCP
TCP-schaalCorning353001Specificatie: 60 mm
Afkorting: TCP
TCP-schaalCorning353002Specificatie: 24-wellschaal
24-wellschaalCorning353047Specificatie: Blocking agent
Bovien serumalbumineSigma-AldrichA8806Specificatie: Detectiereagens
Alkaline fosfatase levend kleurstofThermo Fisher scientificA14353Specificatie: Detectiereagens
Hematoxyline & eosinSigma-Aldrich1.05175Specificatie: EB-formatie schaal
6-well ultralow aanhechtingsschaalCorning3471Specificatie: Coatingmateriaal
gelatineSigma-AldrichG9391Specificatie: Coatingmateriaal
MatrigelCorning354230Specificatie: Muizen
NOD-SCID muizenNational Applied Research LaboratoriesNoneSpecificatie: Serum
Foetaal bovien serumBiological Industries04-001-1ASpecificatie: Antibioticum
antimycotisch antibioticumThermo Fisher scientific15240-062Specificatie: Antilichaam
Antilichaam voor NanogInvitrogenMA1-017Specificatie: Antilichaam
Antilichaam voor SSEA4Abcamab16287Specificatie: Antilichaam
Antilichaam voor OCT3/4InvitrogenPA5-27438Specificatie: Antilichaam
Antilichaam voor Sox2Invitrogen48-1400Specificatie: Antilichaam
Antilichaam voor Smooth Muscle ActinInvitrogenPA5-19465Specificatie: Antilichaam
Antilichaam voor AFPInvitrogenPA5-21004Specificatie: Antilichaam
Antilichaam GFAPInvitrogenMA5-15086Specificatie: Antilichaam
Alexa Fluor 555 – geconjugeerd Goat anti-Mouse antilichaamInvitrogenA-21422Specificatie: Antilichaam
Alexa Fluor 488 – geconjugeerd Goat anti-Rabbit antilichaamInvitrogenA-11008Specificatie: Antilichaam

Referenties

  1. Higuchi, A., Ling, Q. D., Chang, Y., Hsu, S. T., Umezawa, A. Physical cues of biomaterials guide stem cell differentiation fate. Chem. Rev. 113, 3297-3328 (2013).
  2. Higuchi, A., et al. Physical cues of cell culture materials lead the direction of differentiation lineages of pluripotent stem cells. J. Mater. Chem. B. 3, 8032-8058 (2015).
  3. Wen, J. H., et al. Interplay of matrix stiffness and protein tethering in stem cell differentiation. Nat Mater. 13, 979-987 (2014).
  4. Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat. Mater. 13, 547-557 (2014).
  5. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  6. Higuchi, A., et al. Polymeric design of cell culture materials that guide the differentiation of human pluripotent stem cells. Prog. Polym. Sci. 65, 83-126 (2017).
  7. Chen, W. Q., et al. Nanotopography Influences Adhesion, Spreading, and Self-Renewal of Human Embryonic Stem Cells. ACS Nano. 6, 4094-4103 (2012).
  8. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat. Mater. 9, 82-88 (2010).
  9. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
  10. Li, D., et al. Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions. J. Cell Biol. 191, 631-644 (2010).
  11. Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat. Protoc. 6, 187-213 (2011).
  12. Shih, Y. R. V., Tseng, K. F., Lai, H. Y., Lin, C. H., Lee, O. K. Matrix Stiffness Regulation of Integrin-Mediated Mechanotransduction During Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Bone Miner. Res. 26 (4), 730-738 (2011).
  13. Du, J., et al. Integrin activation and internalization on soft ECM as a mechanism of induction of stem cell differentiation by ECM elasticity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108, 9466-9471 (2011).
  14. Xue, R., Li, J. Y., Yeh, Y., Yang, L., Chien, S. Effects of matrix elasticity and cell density on human mesenchymal stem cells differentiation. J. Orthop. Res. 31 (9), 1360-1365 (2013).
  15. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  16. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on differentiation of umbilical cord stem cells. Acta Biochim. Pol. 59 (2), 261-264 (2012).
  17. Witkowska-Zimny, M., et al. Effect of substrate stiffness on the osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and bone-derived cells. Cell Biol. Int. 37 (6), 608-616 (2013).
  18. Macri-Pellizzeri, L., et al. Substrate stiffness and composition specifically direct differentiation of induced pluripotent stem cells. Tissue Eng. Part A. 21 (9-10), 1633-1641 (2015).
  19. Cozzolino, A. M., et al. Modulating the Substrate Stiffness to Manipulate Differentiation of Resident Liver Stem Cells and to Improve the Differentiation State of Hepatocytes. Stem Cells Int. , 5481493(2016).
  20. Mattei, G., Ferretti, C., Tirella, A., Ahluwalia, A., Mattioli-Belmonte, M. Decoupling the role of stiffness from other hydroxyapatite signalling cues in periosteal derived stem cell differentiation. Sci. Rep. 5, 10778(2015).
  21. Zouani, O. F., Kalisky, J., Ibarboure, E., Durrieu, M. C. Effect of BMP-2 from matrices of different stiffnesses for the modulation of stem cell fate. Biomaterials. 34 (9), 2157-2166 (2013).
  22. Ye, K., Cao, L., Li, S., Yu, L., Ding, J. Interplay of Matrix Stiffness and Cell-Cell Contact in Regulating Differentiation of Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 8 (34), 21903-21913 (2016).
  23. Hogrebe, N. J., Gooch, K. J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. J. Biomed. Mater. Res. A. 104 (9), 2356-2368 (2016).
  24. Olivares-Navarrete, R., et al. Substrate Stiffness Controls Osteoblastic and Chondrocytic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Exogenous Stimuli. PLoS One. 12, e0170312(2017).
  25. Kumar, S. S., et al. The combined influence of substrate elasticity and surface-grafted molecules on the ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 34, 7632-7644 (2013).
  26. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol) membranes. Polymer. 26, 1207-1211 (1985).
  27. Higuchi, A., Iijima, T. DSC investigation of the states of water in poly(vinyl alcohol-co-itaconic acid) membranes. Polymer. 26, 1833-1837 (1985).
  28. Higuchi, A., et al. Long-term xeno-free culture of human pluripotent stem cells on hydrogels with optimal elasticity. Sci Rep. 5, 18136(2015).
  29. Wang, P. Y., et al. Pluripotency maintenance of amniotic fluid-derived stem cells cultured on biomaterials. J Mater Chem B. 3, 3858-3869 (2015).
  30. Muduli, S., et al. Proliferation and osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells. J Mater Chem B. 5, 5345-5354 (2017).
  31. Muduli, S., et al. Stem cell culture on polyvinyl alcohol hydrogels having different elasticity and immobilized with ECM-derived oligopeptides. JPoly Eng. 37, 647(2017).
  32. Chen, Y. M., et al. Xeno-free culture of human pluripotent stem cells on oligopeptide-grafted hydrogels with various molecular designs. Sci Rep. 7, 45146(2017).
  33. Higuchi, A., Ling, Q. D., Ko, Y. A., Chang, Y., Umezawa, A. Biomaterials for the feeder-free culture of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Chem Rev. 111 (5), 3021-3035 (2011).
  34. Higuchi, A., et al. Design of polymeric materials for culturing human pluripotent stem cells: Progress toward feeder-free and xeno-free culturing. Prog Polym Sci. 39, 1348-1374 (2014).
  35. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for myocardial infarction in clinical trials: bioengineering and biomaterial aspects. Lab Invest. 97, 1167-1179 (2017).
  36. Higuchi, A., et al. Stem cell therapies for reversing vision loss. Trends Biotechnol. 35, 1102-1117 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Humane pluripotente stamcellenP-IA-hydrogelsxeno-vrije kweekcontrole van hydrogelstijfheidoligopeptide-entingdifferentiatie van stamcellenfluorescentiemicroscopieprotocol voor celpassagesynthese van biomaterialenextracellulaire matrix
Menselijke pluripotente stamcel cultuur op Polyvinyl Alcohol-Co-itacon zuur Hydrogels met verschillende stijfheid onder voorwaarden Xeno-gratis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.