Methodenartikel

Gel-seq: Een methode voor de voorbereiding van de bibliotheek van de gelijktijdige Sequencing van DNA en RNA met Hydrogel Matrices

DOI:

10.3791/57315

⸱

26 maart 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Engineering, University of San Diego, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 3Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gel-seq kan onderzoekers gelijktijdig bereiden bibliotheken voor beide DNA - en RNA-seq op de te verwaarlozen extra kosten vanaf 100-1000 cellen met behulp van een eenvoudige hydrogel-apparaat. Dit document stelt een gedetailleerde aanpak voor de fabricage van zowel het apparaat als het biologische protocol voor het genereren van gepaarde bibliotheken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alleen is er de mogelijkheid om te versterken en de opeenvolging van DNA of RNA van kleine startende steekproeven geboekt in de afgelopen vijf jaar. Helaas, de standaardprotocollen voor het genereren van genomic of transcriptomic bibliotheken stroken en onderzoekers moeten kiezen of u wilt de opeenvolging van DNA of RNA dat voor een bepaalde monster. Gel-seq is dit probleem opgelost doordat onderzoekers gelijktijdig voor te bereiden op bibliotheken zowel DNA en RNA beginnen met 100-1000 cellen met behulp van een eenvoudige hydrogel-apparaat. Dit document stelt een gedetailleerde aanpak voor de fabricage van zowel het apparaat als het biologische protocol voor het genereren van gepaarde bibliotheken. We ontworpen Gel-seq zo dat het eenvoudig konden worden geïmplementeerd door andere onderzoekers; vele genetica laboratoria hebben reeds de nodige apparatuur om te reproduceren van de Gel-seq apparaat fabricage. Ons protocol maakt gebruik van veelgebruikte kits voor beide geheel-transcript versterking (WTA) en voorbereiding van de bibliotheek, die ook kunnen worden vertrouwd voor onderzoekers reeds bedreven in genomic genereren en transcriptomic bibliotheken. Onze aanpak maakt het mogelijk onderzoekers aan het uitoefenen van de kracht van zowel DNA en RNA sequencing op één sample zonder splitsing en met te verwaarlozen extra kosten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgende generatie sequencing (NGS) heeft een diepgaande invloed gehad op de wijze genetica onderzoek wordt uitgevoerd. Waarin onderzoekers vooral eens gericht op rangschikkend het genoom van een hele diersoort, is het nu mogelijk om het genoom van een enkelvoudige tumor of zelfs een enkele cel in een experiment. 1 NGS heeft ook het kosteneffectief te sequentie van het RNA afschriften gevonden binnen een cel, een verzameling gegevens die als een transcriptome wordt bekend. Alleen is er de mogelijkheid om te versterken en de opeenvolging van DNA of RNA van kleine startende steekproeven geboekt in de afgelopen vijf jaar. 2 , 3 , 4 helaas standaard protocollen zijn niet compatibel en onderzoekers moeten kiezen of u wilt de opeenvolging van DNA of RNA dat voor een gegeven steekproef. Wanneer een eerste steekproef groot genoeg is, kan het in tweeën worden gesplitst. Op kleinere schalen, echter verlies van materiaal als gevolg van splitsing van monsters kan invloed hebben op de kwaliteit van de bibliotheek, en bundeling van monsters kan gemiddelde uit interessante verschillen tussen cellen. 5 voorts onderzoekers zijn steeds meer geïnteresseerd in het onderzoek van de monsters die niet kunnen worden gesplitst, zoals afzonderlijke cellen of kleine heterogene tumor biopsieën. 6

Om aan te pakken dit probleem, drie protocollen zijn onlangs ontwikkeld om zowel DNA en RNA van hetzelfde uitgangspunt monster volgnummer: Gel-seq7, G & T-seq8en9van de DR-seq. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor Gel-seq, die kan worden gebruikt om gelijktijdig het genereren van DNA en RNA bibliotheken uit zo weinig als 100 cellen op de te verwaarlozen extra kosten. De roman aspect van Gel-seq is de capaciteit om DNA en RNA uitsluitend gebaseerd op grootte met behulp van low-cost hydrogel matrices te scheiden. De innovatie van de kern van het Gel-Seq-protocol is de fysieke scheiding van DNA van RNA. Deze scheiding wordt bereikt electrophoretically met behulp van een combinatie van polyacrylamide membranen die van de verschillen van grootte tussen deze moleculen profiteren. Om deze grootte verschillen in context, overwegen hoe DNA en RNA zijn beeld: terwijl DNA op de micron-schaal bestaat en kan bekeken worden met behulp van traditionele microscopen, RNA bestaat op de nanometerschaal en moet worden beeld met behulp van complexe technieken zoals cryo-elektron microscopie. 10

De aanpak van het scheiden van DNA en RNA in dit protocol is afgebeeld in Figuur 1. Het linker paneel toont DNA en RNA vrij zwevend in de oplossing in de buurt van een membraan. Wanneer een elektrisch veld wordt toegepast, zoals wordt weergegeven in het rechter paneel, ervaring DNA en RNA een elektroforetisch kracht die induceert van migratie door het membraan. Door de eigenschappen van de membraan tuning, hebben we een semi-permeabel membraan die scheidt van DNA van RNA. De DNA moleculen zijn tegen het membraan geduwd, maar geraakt aan de rand vanwege hun grote omvang. Kleine molecules van RNA, aan de andere kant, kunnen configureren en weven hun weg door het membraan. Dit proces, bekend als reptation, is vergelijkbaar met de manier waarop die een slang door gras beweegt. Uiteindelijk deze RNA-moleculen worden gestopt door een tweede, high-density membraan, dat is te moeilijk voor zelfs kleinere polymeren (> 200 basenparen) te onderuit door. Zodra fysiek gescheiden, kan DNA en RNA worden hersteld en verwerkt voor het genereren van informatie over zowel het genoom en de transcriptome. Terwijl we DNA en RNA scheiden kunt, hebben we vonden betere resultaten worden verkregen als de RNA via reverse wordt-herschreven als cDNA vóór scheiding. De cDNA/RNA-hybriden zijn stabieler dan RNA alleen en kunnen nog aan de lage dichtheid membraan passeren.

figure-introduction-1
Figuur 1 . Gel-seq operationele principe. Het onderliggende principe gebruikt voor fysiek gescheiden van DNA en RNA. In een toegepast elektrisch veld, kleine molecules van RNA worden gemigreerd door de lage dichtheid membraan maar grote DNA moleculen zitten op het oppervlak. Dit cijfer was van Ref. 7 gereproduceerd met toestemming van de Royal Society of Chemistry. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Deze paper beschrijft in detail zowel de fabricage van de Gel-seq-apparaat en het biologische protocol voor het genereren van gepaarde bibliotheken van DNA en RNA. Een overzicht van beide is afgebeeld in Figuur 2. Het apparaat is vervaardigd door gelaagdheid drie verschillende dichtheid polyacrylamide gels boven op elkaar in een proces gelijkend op het maken van standaard stapelvolgorde gels. 11 het biologische protocol begint met 100-1000 cellen gesuspendeerd in PBS. De cellen zijn lysed en RNA wordt omgezet in cDNA voordat het apparaat wordt gebruikt om te scheiden van de genomic DNA van de cDNA/RNA hybriden. Na de scheiding en terugwinning, genomic en transcriptomic zijn bibliotheken opgesteld op basis van een proces dat volgt op het geheel-genoom-standaardbibliotheek voorbereiding kit protocol. Verdere details over de ontwikkeling en validatie van Gel-seq kan worden gelezen in het Lab op een Chip publicatie "Gel-seq: geheel-genoom en de sequencing van de transcriptome door gelijktijdige lage-input DNA en RNA bibliotheek voorbereiding met behulp van semi-permeabel hydrogel belemmeringen ." 7

figure-introduction-2
Figuur 2 . Gel-seq Protocol. Een overzicht van de stappen voor het fabriceren van het Gel-seq-apparaat en het protocol bij gegenereerde gepaarde DNA en RNA bibliotheken. Gedeelten van dit cijfer waren van Ref. 7 gereproduceerd met toestemming van de Royal Society of Chemistry. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Voor het genereren van DNA en RNA bibliotheken van afzonderlijke cellen, onderzoekers overwegen G & T-seq of DR-seq. G & T-Seq, zoals Gel-seq te gebruiken, is afhankelijk van een fysieke scheiding van RNA van genomic DNA. Deze aanpak berust op messenger RNA (mRNA) 3 ' polyadenylated staart als een pull-down-doel. De mRNA wordt vastgelegd op een magnetische kraal met behulp van een biotinyleerd oligo-dT primer. Zodra het mRNA is gevangen de kralen zijn met een magneet op zijn plaats gehouden en het supernatant met de genomic DNA kan worden verwijderd en kan worden overgedragen aan een andere buis. Na deze fysieke scheiding voltooid is, kunnen de aparte bibliotheken worden gegenereerd vanuit de mRNA en DNA. 8 deze aanpak werkt goed als het RNA van belang polyadenylated, nochtans niet het worden gebruikt om te studeren van afschriften van de niet-polyadenylated, zoals ribosomaal RNA, tRNA, of RNA van prokaryoten.

DR-seq is afhankelijk van een versterking van de pre-stap waar zowel DNA en cDNA afgeleid van RNA worden versterkt in de dezelfde buis. Het monster wordt vervolgens in tweeën gesplitst en verwerkt parallel aan het bereiden van DNA - en RNA-seq bibliotheken. Om deze te onderscheiden van genomic DNA en cDNA afgeleid van RNA, neemt DR-seq een rekenkundige benadering. Sequenties waar alleen exons aanwezig zijn worden rekenkundig onderdrukt in de genomic DNA-gegevens, zoals die zou zijn ontstaan van DNA of RNA. 9 een voordeel van deze aanpak is dat het DNA en cDNA/RNA niet worden fysiek gescheiden moeten zoals is gedaan in Gel-seq en G & T-seq. Het nadeel is echter dat DR-seq een priori kennis van het genoom en de transcriptome (d.w.z., exons en introns vereist), en niet ideaal voor toepassingen zoals het rangschikken van kernen wellicht, waarin vele transcripties nog niet volledig zijn verbinding aan de randen en bevatten nog steeds introns. 12

De roman aspect van Gel-seq is de mogelijkheid om te scheiden van DNA en RNA in honderden cellen uitsluitend gebaseerd op grootte. Deze methode vereist geen a priori kennis van het genoom- of transcriptome, is robuust tegen onvolledig splicing, en is niet beperkt tot de afschriften van de poly-adenylated. Voor toepassingen waar een onderzoeker met ten minste 100 cellen beginnen kan, biedt Gel-seq een eenvoudige aanpak met behulp van goedkope en wijd-beschikbare materialen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. chemische oplossing voorbereiding

Opmerking: De volgende stappen zijn voor het voorbereiden van chemische oplossingen in latere stappen vereist. Deze kunnen worden gemaakt in bulk en opgeslagen voor enkele maanden.

  1. Om te beginnen, bereid u 50 mL zuivere, gedeïoniseerd water door het steriliseren in een 254 nm UV crosslinking oven gedurende 15 minuten (15 mJ/cm2 totale blootstelling) te neutraliseren van eventuele contaminerende DNA. Verwarm tot 37 ° C voor gebruik in stappen uit te voeren.
  2. Breng 10 mL van een 40% totaal (T) en 3,3% crosslinker (C) (29:1) polyacrylamide voorloper oplossing. Weeg 3.867 g acrylamide monomeer en 0.133 g bis-acrylamide monomeer. Combineer en brengen volume tot 10 mL met warme gezuiverd water en vortex tot het is opgelost. Winkel beschermd tegen licht bij kamertemperatuur.
    Opmerking: Voorgemengde 40% T, 3,3% C (29:1) polyacrylamide oplossingen kunnen commercieel worden gekocht.
  3. Breng 10mL 50% T, 5% C gel oplossing. Weeg 4.750 g acrylamide monomeer en 0.250 g bis-acrylamide monomeer. Combineer en brengen volume tot 10 mL met behulp van gezuiverde warmwater en vortex tot het is opgelost. Winkel beschermd tegen licht bij kamertemperatuur.
  4. Breng 10 mL een sacharoseoplossing 50% (m/v). 5 g sacharose aan een gegradueerde cilinder toevoegt en warme gezuiverd water tot een totaal volume van 10 mL. Vortex tot het is opgelost en winkel bij kamertemperatuur.
  5. Breng 10 mL 10% APS (w/v). 1 g van ammoniumnitraat persulfate (APS) toevoegen aan een gegradueerde cilinder. Toevoegen van koud (~ 4° C) gezuiverd water tot een totaal volume van 10 mL en vortex tot het is opgelost. Onmiddellijk bevriezen in porties van 200 µL.

2. gel-seq Cassette Fabrication

Opmerking: Gel-seq werd oorspronkelijk ontwikkeld met rechtop cassettes (Zie Tabel van materialen voor meer informatie); Dit protocol kan echter aangepast om te werken met elke standaard gel elektroforese cassette.

  1. Voorbereiding gel precursoren in drie aparte plastic buizen door toevoeging van reagentia zoals hieronder getoond in de tabel 1. Niet toevoegen APS of Tetramethylethylenediamine (TEMED) tot regie in de volgende stappen. Vortex ingrediënten om meng.
Voorloper van de Gel van de vullerVoorloper van de Gel van hoge dichtheidVoorloper van de Gel van lage dichtheid
40 %T, 3.3%C Acrylamide Bisacrylamide oplossing1.6 mL50 %T, 5 %C Acrylamide Bisacrylamide oplossing2.4 mL40 %T, 3.3%C Acrylamide Bisacrylamide oplossing0,6 mL
Gedeïoniseerd Water10.2 mLGedeïoniseerd Water1,0 mLGedeïoniseerd Water4.8 mL
Sacharoseoplossing (50% g/v)2,6 mLSacharoseoplossing (50% g/v)0,6 mL
10 X Tris-boraat-EDTA1.6 mL10 X Tris-boraat-EDTA0,6 mL
Ammoniumnitraat persulfate (10% w/v)104.0 ΜLAmmoniumnitraat persulfate (10% w/v)50.0 ΜLAmmoniumnitraat persulfate (10% w/v)39.0 ΜL
TEMED6.0 ΜLTEMED1,0 ΜLTEMED2.2 ΜL
Totaal Volume16.1 mLTotaal Volume4.1 mLTotaal Volume6.0 mL

Tabel 1. Gel synthese reagentia. Polyacrylamidegel voorloper reagentia voldoende voor de fabricage van 2 cassettes.

  1. Ambtshalve gas gel monomeer oplossingen door het invoegen van een naald door de dop van de tube en deze naald verbinden met een vacuüm lijn van huis. Onderdompelen van deze vergadering in een ultrasoon Badset op hoog en wacht tot bubbels stoppen met opkomende uit de vloeistof voordat u naar de volgende stap (~ 60 seconden / buis).
    Opmerking: De kwaliteit van het vacuüm en de macht van het ultrasoonbad is niet kritisch, zolang bubbels kunnen worden gezien uit de oplossing.
  2. Toevoegen TEMED en APS kort aan de voorloper van de gel van de vuller en vortex. Onmiddellijk vergroten met 6 mL van de voorloper van de gel vuller elke gel cassette waarbij de oplossing in de top van de cassette. Gebruik een micropipet van 1 mL toe te voegen de voorloper in zes stappen om te voorkomen dat morsen. De totale tijd voor deze stap moet minder dan 3 minuten.
  3. Waarborgen de vloeistof door de positionering van de cassettes rechtop op een niveau tafel. Vul de rest van de cassette met gedeïoniseerd, ontgaste water. Pipetteer van het water, opnieuw met behulp van de stappen van 1 mL, langzaam in het midden van de cassette te minimaliseren mengen. Het toestaan van het polymeer te genezen voor ten minste één uur, liefst om te overnachten.
  4. Nadat het polymeer is uitgehard, omkeren de cassettes van de gel over een gootsteen te verwijderen van de water-overlay. Een perslucht-pistool kan worden gebruikt om het zachtjes droog de interface door het blazen van lucht via de bovenste opening van de cassette op een afstand van 6 inch.
  5. Toevoegen TEMED en APS kort aan de voorloper van de high-density gel en vortex. Voeg onmiddellijk 320 µL van de high-density voorloper op de cassette, opnieuw met behulp van een pipet 1 mL. Zorg ervoor dat de vloeistof gelijkmatig jassen de vuller gel laag door de cassette schommelen heen en weer ongeveer 3 keer. Deze stap moet minder dan drie minuten duren.
  6. Vul de rest van de cassette met gedeïoniseerd, ontgaste water. Pipetteer langzaam met een pipet 1 mL in het midden van de cassette te minimaliseren mengen. Het toestaan van het polymeer te genezen voor ten minste vijftien minuten, bij voorkeur een uur.
  7. Nogmaals, omkeren de gel cassettes om te verwijderen van de water-overlay. Perslucht kan worden gebruikt om het zachtjes droog de interface. Toevoegen TEMED en APS kort aan de voorloper van low-density gel en vortex. Onmiddellijk Vul de rest van de cassette (~1.65 mL) met de voorloper van low-density gel en invoegen van de gel-kam.
  8. Pipetteer een overmaat aan reserve voorloper aan de bovenkant van de kam als het tijdens de polymerisatie zal worden geabsorbeerd. Het toestaan van het polymeer om te genezen van ten minste 4 uur, bij voorkeur 's nachts. Gels, kunnen worden opgeslagen voor een week of langer in een buffer van Tris-boraat-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) (TBE buffer).

3. de monstervoorbereiding en Reverse transcriptie

  1. Beginnen met een suspensie van de cellen van belang, en werken in een polymerase kettingreactie (PCR) laminaire flow hood, gebruik een hemocytometer of een automatische cel teller voor het berekenen van de concentratie van de cel. Verdun de cellen tot een concentratie van 100 tot 1000 cellen per µL in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    Opmerking: Dit protocol is gevalideerd op een bereik van cellen, met inbegrip van PC3, HeLa en muis lever cellen.
  2. Met behulp van reagentia geboden in de WTA kit (Zie Tabel of Materials), mix 19 µL van lysis buffer en 1 µL van RNase remmer voor te bereiden op een 10 X stockoplossing van reactie buffer. Maak een master mix van lysis van voldoende volume met 0,5 µL van reactie buffer en 2.75 / µL van nuclease gratis water voor elk monster.
  3. Pipetteer de celsuspensie op en neer 5 keer resuspendeer vaste cellen en Pipetteer vervolgens 1 µL van het monster in een 200 µL nuclease gratis strip buis gesteriliseerd door UV. Herhaal zo nodig afhankelijk van aantal monsters. Zorg dat u wilt opnemen van een negatieve controle door pipetting 1 µL van nuclease gratis water in plaats van cellen voor een reactie. Vervolgens 3,25 µL van lysis van de master mix toevoegen aan elk monster en meng door zachtjes op en neer 5 keer pipetteren.
  4. Verwarm een thermische cycler (met verwarmde deksel) tot 72 ° C. 1 µL RT primer en 1 µL van 20 µM willekeurige hexamer met WTA-adapter (5 '-AAGCAGTGGTAT-CAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3 ') toevoegen aan elk monster. Reserveren van ten minste één buis als positieve controle voor de voorbereiding van de bibliotheek van de gDNA en voeg 2 µL van water in plaats van inleidingen.
    Opmerking: Random hexamer met WTA-adapter is optioneel en heeft minimale impact op rangschikkend resultaten.
  5. Incubeer monsters bij 72 ° C in de voorverwarmde thermische cycler gedurende 3 minuten Lyse de cellen. Cellen verwijderen uit het thermische cycler en plaats op het ijs gedurende 2 minuten. Bewaar de positieve controle bij 4 ° C tot en met stap 5.
  6. Terwijl de cellen zijn lysing, een voldoende volume van omgekeerde transcriptie master mix voor alle RNA monsters met de volgende reagens verhoudingen maken: 2 µL van eerste onderdeel buffer, 0,5 µL van sjabloon switch oligonucleotide (TSO), 0,25 µL van RNase remmer en 1 µL van reverse-transcriptase (100 U/µL).
  7. Verwarm de thermische cycler tot 42 ° C. 3,75 µL van omgekeerde transcriptie master mix toevoegen aan de overige monsters, het totale monstervolume om 10 µL. Meng door pipetteren op en neer 5 keer.
  8. Omgekeerde transcriptie door het direct plaatsen van monsters in een voorverwarmde thermische cycler uitvoeren Voer het volgende programma: 42 ° C gedurende 90 min, 70 ° C gedurende 10 min, 4 ° C voor eeuwig. Dit is een veilige stopplaats.

4. gel scheiding en proef van de terugwinning

  1. Voorzichtig schoon een gel elektroforese kamer met behulp van een product van de haarverwijdering van DNA. Toepassing van verschillende mL van het vloeibaar reinigingsmiddel op een wegwerp lint gratis veeg- en veeg over alle oppervlakken van de kamer, en vul vervolgens de zaal met schone 0,5 x TBE. Voor optimale resultaten, plaatst u het hele apparaat in een 254 nm UV crosslinking oven en steriliseren gedurende 15 minuten (15 mJ/cm2).
  2. Plaats de Gel-seq-cassette in de zaal van de Elektroforese van het gel en vergrendel het vastklikt. Verwijder langzaam de gel kam door te trekken recht omhoog. Beweeg langzaam om scheuren van de gel of rippen van een van de armen te vermijden.
  3. Houd de monsters uit stap 3 op ijs, reserveren ten minste één monster als positieve controle voor cDNA Bibliotheek generatie. Bewaar dit besturingselement bij 4 ° C tot en met stap 6. Voeg 2 µL van 6 X laden kleurstof aan de resterende samples, om het totale volume ~ 12 µL. grondig Meng de monsters door pipetteren op en neer 5 keer.
  4. Combineer 1 µL van een DNA-ladder met 2 µL van 6 x laden kleurstof en 7 µL van water. Pipetteer dit mengsel in baan 1 van de Gel-seq cassette als een controle-elektroforese. Pipetteer de monsters uit de vorige stap in gescheiden doorgangen van de Gel-seq-cassette. Wees voorzichtig om te voorkomen dat besmetting tussen putten door de pipet volledig in elk putje invoegen en verwijderen met behulp van alleen een verticale beweging.
  5. Met behulp van de voeding van een standaard gel-elektroforese, toepassing een elektrisch veld van 250 V over de Gel-seq cassette gedurende 30 minuten om te scheiden van de gDNA van de cDNA/RNA hybriden. Zodra gescheiden, verwijderen van de Gel-seq-cassette uit de zaal van de Elektroforese van het gel en de twee helften van de cassette door de randen met een schraperig gereedschap nieuwsgierige openen.
  6. Met behulp van een scalpel, snij de gel doormidden net onder de high-density laag. Gooi de helft waarin vuller gel door het oppakken van met uw gehandschoende hand. Schil voorzichtig de resterende gel off van de cassette door het schrapen met een schraper verf of andere soortgelijke tool. Plaats dit gedeelte van de gel in een schotel met 0,5 mL ~ 30 x TBE met 3 µL van gel vlek.
  7. Dekking van de container om te minimaliseren photobleaching en geniet van de gel terwijl de container voor 5 minuten zachtjes te schudden. Plaats de gel op plastic wrap en nemen een UV-beeld met behulp van een documentatiesysteem gel (voor verdere details zie Ref. 13). Een 30 seconde blootstelling doorgaans produceert heldere beelden. Controleer of dat scheiding is opgetreden.
  8. De gel met een UV-transilluminator om de visualisatie van de nucleïnezuren verplaatsen Een passende UV bril, bevestigen de resultaten van het documentatiesysteem gel. De gDNA moet worden gevestigd in het begin van de lage dichtheid gel en cDNA op het raakvlak van de regio's met een lage dichtheid en dichtheid.
  9. Gebruik een scalpel, uitknippen van de regio's van de gel met de gDNA en cDNA. Monsters worden best hersteld door het snijden van een 4 mm per 10 mm rechthoekige afdeling gel te vormen; de exacte geometrie zal echter afhangen van het systeem dat wordt gebruikt in de Elektroforese van het gel. Vergeet niet om ook het knippen van de rijstrook geladen met de negatieve controle.
  10. Plaats elke weggesneden sectie van gel in een strip buis met behulp van een paar botte uiteinde pincet. Wees voorzichtig niet teveel kracht of de gel wordt gesplitst in meerdere stukken. Dit moet gebeuren, gewoon pak elk stuk en toe te voegen aan de buis.
  11. Het malen van de gel in elke buis met behulp van het puntje van een pipet (200 µL Pipetteer tips werken goed) door het uiteinde van de pipet in een circulaire mode tegen de onderkant van de buis te bewegen. Nuclease gratis water (40 µL in de gDNA monsters en 80 µL in de cDNA monsters) aan elke buis toevoegen voordat u het uiteinde van de pipet gebruikt voor het vermalen van de gel om te minimaliseren van monster verlies verwijdert.
  12. Plaats de strip buizen naar een vortex-mixer binnenkant van een 37 ° C incubator en schud gedurende 8-12 uur. Hierdoor wordt de nucleïnezuren te verspreiden uit de gel en is een natuurlijke stopplaats voor dit protocol multi dag.
  13. Pipetteer van de monsters in een 8 µm mesh filter plaat en draai de plaat bij 2600 x g gedurende 5 minuten aan spanning uit de gel-fragmenten. Til de mesh filter plaat uit de buurt van de plaat van de huisvesting en de gel-vrije watermonsters Pipetteer in een nieuwe 200 µL strip buis.
  14. Voeg 1 µL van protease (0.9 AU/mL) toe aan elk monster met gDNA, meng goed door op en neer, pipetting en Incubeer bij 50 ° C gedurende 15 minuten gevolgd door een inactivering van warmte bij 70 ° C gedurende 15 minuten. Deze stap is essentieel voor het afbreken van de nucleosomes en de gDNA toegankelijk voor latere reactie stappen maakt.
  15. Met behulp van een naald 18 gauge, poke gaten in de doppen van alle monster buizen. Leg de monsters in een vacufuge om vloeibare volume. gDNA monsters moeten worden verminderd tot 5 µL en cDNA monsters teruggebracht tot 10 µL.
  16. Afhankelijk van de vacufuge en het aantal monsters, zal de totale verdamping tijd variëren tussen 30 en 60 minuten. Als het monstervolume daalt tot onder het doelvolume, simpelweg toevoegen nuclease gratis water te verhogen van het monstervolume.

5. gDNA bibliotheek voorbereiding

  1. Met behulp van een Fluorimeter of vergelijkbare technologieën, kwantificeren de DNA-concentratie in elk monster gDNA uit stap 4, alsmede de positieve controle uit stap 3. Zie voor een gedetailleerde protocol de Fluorimeter reference manual. 14
  2. Verdun de monsters naar 0,2 ng/µL van DNA. Afhankelijk van de startende celtype en de kwaliteit van de resultaten nodig, kunnen lagere concentraties nog produceren levensvatbare bibliotheken. Sommige experimenten zal worden vereist; echter, de auteurs succes gehad met bibliotheken zo laag als 0,1 ng/µL.
  3. Voltooi gDNA bibliotheek voorbereiding door het protocol van bibliotheek voorbereiding halve reactie volume in stap 7.

6. cDNA Bibliotheek voorbereiding

  1. Beginnen met de 10 µL cDNA monsters en positieve controle uit stap 4, Voeg 12,5 µL van 2 X qPCR-mix, 0.5 µL cDNA PCR primers, en 2 µL nuclease-gratis water.
  2. Uitvoeren van PCR in een real-time thermocycler met behulp van de onderstaande voorschriften: hot-start bij 95 ° C gedurende 3 min, gevolgd door de 20-30 cycli van 98 ° C voor 10 s, 65 ° C voor 30 s, en 72 ° C voor 3 min. totale monstervolume is 25 µL. controleert de reactie bochten en stopt de versterking voor th e reacties laat de exponentiële fase (verhoging van de lineaire signaal versus cyclus nummer) om te voorkomen dat PCR artefacten als gevolg van overamplification. Zie voor meer informatie over het vermijden van overamplification, de sectie discussie van dit papier, alsmede Ref. 15.
  3. Reinig na versterking, het product met behulp van de vaste fase omkeerbare immobilisatie (SPRI) kralen volgens het protocol in stap 8. Zodra voltooid, gaat u verder met de volgende stap.
  4. Met behulp van een Fluorimeter of vergelijkbare technologieën, de DNA-concentratie in elk monster cDNA evenals de positieve controle uit stap 4 te kwantificeren. Verdun de monsters eventueel bevatten ongeveer 0,2 ng/µL van DNA. Iets lagere concentraties produceren nog levensvatbare bibliotheken. Sommige experimenten zal nodig zijn, maar de auteurs succes gehad met bibliotheken zo laag als 0,1 ng/µL.
  5. Optionele stap: uitvoeren van een standaard polyacrylamide-gel-elektroforese scheiding op 1-2 µL van elk product van de qPCR voor het valideren van de bibliotheek generatie reactie werkte. Een voorbeeldafbeelding van succesvolle resultaat wordt weergegeven in Figuur 4. Zie voor een gedetailleerde protocol betreffende de wijze van uitvoering van polyacrylamide gelelektroforese, Ref. 16.
  6. Voltooi cDNA Bibliotheek voorbereiding door de bibliotheek voorbereiding kit helft volume reactie protocol in stap 7.

7. bibliotheek voorbereiding met de helft Volume reacties

  1. Voorbereiding van de bibliotheek volgt de bibliotheek voorbereiding kit protocol gebruikt een half volume reacties. 17 alle reagentia waarnaar wordt verwezen in deze sectie van het protocol worden van de bibliotheek voorbereiding kit (Zie Tabel van materialen). Allereerst UV steriliseren van een voldoende aantal strip buizen voor het aantal monsters worden verwerkt.
  2. De reactie van de transposase door 5 µL transposase buffer toe te voegen aan elke strip buis moet worden gebruikt in de test uitvoeren Voeg vervolgens 2.5 µL ingang DNA op 0,2 ng/µL (0,5 ng totaal) gevolgd door 2,5 µL transposase. Meng door pipetteren op en neer 5 keer.
  3. Incubeer bij 55 ° C gedurende 5 minuten, dan houd bij 10 ° C. Nadat het monster 10 ° C bereikt, verwijderen uit de thermocycler en onmiddellijk 2.5 µL transposase stop buffer toe te voegen aan elk monster. Houd de monsters bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
  4. De PCR-reactie op het versterken van het monster transponeren behandeld door toevoeging van 7,5 µL bibliotheek prep PCR mix, 2.5 µL van een primer index 1 en 2,5 µL van een index 2 primer voor te bereiden. Deze inleidingen zijn eigendom en worden geleverd door de fabrikant van de kit bibliotheek voorbereiding. Meng goed door pipetteren op en neer 5 keer.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de unieke primer combinaties voor elk monster worden gebruikt. Er zijn 12 verschillende index 1 primers en 8 andere index 2 primers, waardoor het kan een unieke label maximaal 96 verschillende monsters. Kies een unieke combinatie van inleidingen voor elk monster.
  5. PCR het volgende programma gebruikt op een thermocycler uitvoeren Het monstervolume is 25 µL.
    72 ° C gedurende 3 minuten
    95 ° C gedurende 30 seconden
    12 cycli van:
    95 ° C gedurende 10 seconden
    72 ° C gedurende 30 seconden
    55 ° C gedurende 30 seconden
    72 ° C gedurende 5 minuten
    Houd bij 10 ° C
  6. Reinig de bereid bibliotheken met behulp van SPRI kralen volgens het protocol in stap 8. De bibliotheken moeten worden gevalideerd met behulp van de Elektroforese van het gel of een soortgelijke bepaling. Raadpleeg de handleiding bibliotheek voorbereiding kit voor meer informatie over het valideren van bibliotheken. 17

8. vaste fase omkeerbare immobilisatie kraal bibliotheek schoonmaken

  1. Vaste fase omkeerbare immobilisatie (SPRI) kralen in 1,5 mL aliquots moeten worden opgeslagen en moeten worden gebracht op kamertemperatuur vóór elk gebruik. Het is ook aanbevolen om het bereiden van verse 80% ethanol voor elk experiment. De volgende stappen zijn gebaseerd het SPRI kraal protocol in de WTA kit handboek. 18
  2. Voeg 1 µl van het WTA-kit lysis-buffermengsel aan elke PCR-product. Vortex de SPRI kralen totdat gelijkmatig gemengd, voeg dan 50 µl van SPRI parels aan elk monster. Meng door het monster op en neer 10 keer pipetteren en vervolgens de monsters bij kamertemperatuur Incubeer gedurende 8 minuten.
  3. Kort draaien de monsters te verzamelen van de vloeistof van de kant van de buizen. Plaats de monsters op een magnetische scheiding apparaat ~ 5 minuten totdat de vloeistof wordt heel duidelijk weergegeven.
  4. Terwijl de monsters op de magnetische scheiding apparaat, langzaam Pipetteer af de bovendrijvende substantie en negeren - wees voorzichtig niet te verstoren, de ring van de kralen op de buis. Voeg vervolgens 200 µL van 80% ethanol toe aan elk monster zonder verstoring van de kralen. Wacht 30 seconden en vervolgens zorgvuldig Pipetteer af het supernatant. Herhaal deze stap (ethanol wash) zodra.
  5. Toestaan dat de monsters te drogen voor 30 s - 1 min. Niet teveel droog de monsters als grote glasscherven zal permanent worden gebonden aan de kralen.
    Opmerking: Een korte droogtijd wordt aanbevolen om ervoor te zorgen dat alle sporen van ethanol worden verwijderd. Sporen van ethanol moeten achterblijven kunnen ze iets stroomafwaarts reacties remmen.
  6. Verwijderen van de monsters van de magnetische scheiding apparaat en 15 µL van water toevoegen aan elk monster te elueren het DNA van de kralen. Pipetteer op en neer en zorg ervoor de parels uit de zijkanten van de buizen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Kort draaien de monsters en plaats ze dan op het apparaat magnetische scheiding ~ 1 minuut totdat de oplossing duidelijk blijkt.
  7. Terwijl de monsters op de magnetische scheiding apparaat, langzaam Pipetteer omhoog het supernatant en overbrengen naar schone buizen. Wees voorzichtig niet te verstoren, de ring van de kralen op de buis. Gooi de buizen met kralen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De fysieke scheiding van gDNA en cDNA/RNA hybriden in de Gel-seq-apparaat kan worden gevisualiseerd door middel van fluorescerende gel imaging; een representatief resultaat is afgebeeld in Figuur 3. Paneel A toont het verzonnen Gel-seq-apparaat; foute kleuren is toegevoegd om te onderscheiden van de verschillende gel-regio's. Paneel B toont een close up van vier verschillende kleurscheidingen gebruikt voor validatie. De derde rijstrook, een negatieve controle...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende kritische stappen die zijn gekoppeld aan de Gel-seq apparaat fabricage, alsmede het protocol zelf. Tijdens fabricage, is het raadzaam te beginnen met de voorgeschreven laagdiktes voor de verschillende regio's van de gel. We tijd aanzienlijke testen verschillende fabricage opties en het protocol hier beschreven produceert de beste apparaten voor de cassettes vermeld in de tabel van materialen en reagentia. Als onderzoekers een alternatieve cassette systeem gebruiken, kunnen zij vinde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KZ is mede-oprichter en wetenschappelijk adviseur van Singlera Genomics Inc.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Financiering voor dit werk werd door de Universiteit van San Diego, de National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program, NIH grant R01-HG007836 en door het Koreaanse Ministerie van wetenschap, ICT en Planning van de toekomst.

Eerdere versies van een aantal cijfers werden voor het eerst gepubliceerd in "Hoople, G. D. et al. Gel-seq: geheel-genoom en de sequencing van de transcriptome door gelijktijdige lage-input DNA en RNA bibliotheek voorbereiding met behulp van semi-permeabel hydrogel belemmeringen. Lab op een Chip 17, 2619-2630, doi:10.1039 / c7lc00430c (2017). " Lab op een Chip heeft bestraft het hergebruik van de cijfers in deze publicatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents
Acrylamid MonomeerSigma AldrichA8887-100G
Ammonium PersulfaatSigma AldrichA3678-25G
Ampure XP BeadsBeckman CoulterA63880Verwezen in de tekst als solid phase reversible immobilization (SPRI) beads
DNA Gel Loading Dye (6x)ThermoFisher ScientificR0611Verwezen in de tekst als 6X loading dye
Ethyl alcoholSigma AldrichE7023-500ML
KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR KitsKapa BioSystems7959613001Verwezen in de tekst als 2X qPCR mix
N,N′-Methyleenbis(acrylamide) Sigma Aldrich146072-100GOok bekend als bis-acrylamide
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (verwezen in de tekst als library preparation kit)IlluminaFC-131-1024Bevat: TD (verwezen in de tekst als transposase buffer), ATM (verwezen in de tekst als transposase), NT (verwezen in de tekst als transposase stop buffer) en NPM (Verwezen in de tekst als library prep PCR mix)
Nuclease Free WaterMillipore3098
ProteaseQiagen19155
SMART-Seq v4 Kit (verwezen in de tekst als whole-transcript amplification (WTA) kit)Takara/Clontech634888Bevat: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (verwezen in de tekst als RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (verwezen in de tekst als first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (verwezen in de tekst als template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (verwezen in de tekst als reverse transcriptase) en PCR Primer II A (verwezen in de tekst als cDNA PCR primer)
Random hexamer met WTA adapter IDTn/a5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
SucroseSigma AldrichS0389-500G
TEMEDSigma AldrichT9281-25ML
DNA AWAY Surface DecontaminantThermoFisher Scientific7010PK  Verwezen in de tekst als DNA removal product
Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentratie)Sigma AldrichT4415-1L
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10.000X Geconcentreerd in DMSO)ThermoFisher ScientificS11494Verwezen in de tekst als gel stain
Equipment
BD Precisionglide syringe naalden, maat 18Sigma AldrichZ192554Elk equivalent hardware is acceptabel
Branson CPX series ultrasoon badSigma AldrichZ769363Elk equivalent hardware is acceptabel
Lege Gel Cassettes, mini, 1,0 mmThermoFisher ScientificNC2010Elk equivalent hardware is acceptabel
Mesh Filter Plate - Corning HTS Transwell 96 well permeabele supports - 8,0 µm poriegrootteSigma AldrichCLS3374Verwezen in de tekst als 8 um mesh filter plate
PowerPac HC Power SupplyBio-Rad1645052Elk equivalent hardware is acceptabel
Qubit FluorometerThermoFisher ScientificQ33216Elk equivalent hardware is acceptabel
Vacufuge ConcentratorEppendorf22822993Elk equivalent hardware is acceptabel
XCell SureLock Mini-Cell systeemThermoFisher ScientificEI0001Elk equivalent hardware is acceptabel
Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBio-Rad1855195 Elk equivalent hardware is acceptabel
Amersham UVC 500 Ultraviolet CrosslinkerGE Healthcare Life SciencesUVC500-115VUit productie, elk equivalent hardware is acceptabel
Gel Doc XR+ Gel Documentatie SysteemBio-Rad1708195Verwezen in de tekst als gel imager
Dark Reader TransilluminatorClare Chemical ResearchDR89Verwezen in de tekst als UV transilluminator
 Ultrasoon BadBransonic1207K35Elk equivalent ultrasoon bad is acceptabel.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mawy, T. Single-cell sequencing. Nat Methods. 11 (1), 18(2014).
  2. Gole, J., et al. Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells. Nat Biotech. 31 (12), 1126-1132 (2013).
  3. Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA-Seq reveals non-genetic gene expression heterogeneity. Genome Biol. 14 (4), 31(2013).
  4. Ramsköld, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
  5. Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
  6. Navin, N., et al. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing. Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).
  7. Hoople, G. D., et al. Gel-seq: whole-genome and transcriptome sequencing by simultaneous low-input DNA and RNA library preparation using semi-permeable hydrogel barriers. Lab Chip. 17, 2619-2630 (2017).
  8. Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nat Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
  9. Dey, S. S., Kester, L., Spanjaard, B., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Integrated genome and transcriptome sequencing of the same cell. Nat Biotechnol. 33 (3), 285-289 (2015).
  10. Gopal, A., Zhou, Z. H., Knobler, C. M., Gelbart, W. M. Visualizing large RNA molecules in solution. RNA. 18 (2), 284-299 (2012).
  11. SDS-PAGE Gel. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), 087908(2015).
  12. Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), at http://science.sciencemag.org/content/352/6293/1586 (2016).
  13. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923(2012).
  14. Qubit 3.0 Fluorometer Manual. MAN0010866. Life Technologies. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pd (2017).
  15. Vitak, S. A., et al. Sequencing thousands of single-cell genomes with combinatorial indexing. Nat Methods. 14 (3), 302-308 (2017).
  16. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040 Rev B. Bio Rad. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf (2017).
  17. Illumina. Nextera ® XT DNA Library Preparation Kit. , (2017).
  18. Takara Bio USA Inc. SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing User Manual. , (2016).
  19. Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nat Protoc. 2 (3), 739-752 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gel seqDNA RNA SequencingHydrogel MatricesLibrary PreparationGel ElectrophoresisWhole AmplificationNuclease Free WaterPolyacrylamide GelUV CrosslinkingVortex Mixer

Gerelateerde artikelen