Methodenartikel

Titratie ELISA als een methode om te bepalen van de dissociatieconstante van Receptor-Ligand interactie

20.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57334

⸱

15 februari 2018

1Institute of Physiological Chemistry and Pathobiochemistry, University of Münster

In dit artikel

Samenvatting

Een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van een titratie ELISA wordt beschreven. Bovendien wordt een nieuw algoritme te evalueren van de titratie ELISAs en te verkrijgen van een dissociatieconstante van binding van een oplosbare ligand aan een receptor microtiterplaat plaat-geïmmobiliseerd gepresenteerd.

Samenvatting

De dissociatieconstante beschrijft de interactie tussen twee partners in de bindende evenwicht en is een maat voor hun affiniteit. Het is een cruciale parameter om te vergelijken verschillende liganden, bijvoorbeeld, concurrerende remmers, eiwit isoforms en mutanten, om hun bindende kracht aan een bindende partner. Dissociatieconstanten worden bepaald door het uitzetten van de concentraties van afhankelijke versus gratis ligand als bindende curven. Titratie curven, waarin een signaal dat evenredig is met de concentratie van afhankelijke ligand is uitgezet tegen de totale concentratie van toegevoegde ligand, zijn daarentegen veel gemakkelijker om te registreren. Het signaal kan worden opgespoord, spectroscopically en door de enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA). Dit is geïllustreerd in een protocol bij een titratie met ELISA die de binding van de snake venom afkomstige rhodocetin naar haar geïmmobiliseerdet doeldomein van α2β1 integrine meet. Titratie ELISAs zijn veelzijdig en gebruikte. Elk paar van interacterende eiwitten kan worden gebruikt als geïmmobiliseerdet receptor en oplosbare ligand, mits beide eiwitten zuiver zijn, en hun concentraties zijn bekend. Het probleem is tot nu toe geweest om de dissociatieconstante uit een titratiecurve. In deze studie, wordt een wiskundige functie die ten grondslag liggen aan de curven van de titratie ingevoerd. Zonder ieder vergissing-geneigd grafische schatting van een rendement van verzadiging kunt dit algoritme verwerken van de raw-gegevens (signaal intensiteit in verschillende concentraties van toegevoegde ligand) rechtstreeks door wiskundige evaluatie via niet-lineaire regressie. Dus verschillende titratie krommen kunnen gelijktijdig opgenomen en omgezet in een aantal karakteristieke parameters, waaronder de dissociatieconstante en de concentratie van bindende-actieve receptor, en ze statistisch kunnen worden geëvalueerd. Wanneer gecombineerd met dit algoritme, titratie ELISAs krijgen het voordeel van rechtstreeks presenteren de dissociatieconstante. Derhalve, ze mogen worden gebruikt efficiënter in de toekomst.

Inleiding

De dissociatieconstante K is een belangrijke parameter voor het beschrijven van de affiniteit van een receptor (R) voor haar ligand (L). Op basis van de wet van massa-actie, wordt K gedefinieerd voor het evenwicht, waarin de receptor-ligand complexe RL in de receptor R en de ligand L: dissocieert

figure-introduction-1            Vergelijking 1

met de indexcijfers f de gratis of ongebonden status van receptor en ligand. De concentratie van het complex van receptor-ligand, RL, is gelijk aan de concentratie van de receptor-gebonden ligand Lb. Als de totale concentratie van receptor Rt de som van de vrije receptor Rf en ligand-gebonden receptor Rb is = Lb, de dissociatieconstante kan ook geschreven worden als:

figure-introduction-2        Vergelijking 2

Dus, de verzadiging opbrengst Y, gedefinieerd als de breuk van afhankelijke ligand Lb ten opzichte van de totale concentratie van receptor Rt,

figure-introduction-3        Vergelijking 3

afhankelijk van de concentratie van gratis ligand Lf:

figure-introduction-4        Vergelijking 4

Deze hyperbolische relatie beschrijft de bindende curve van een receptor-ligand interactie en zijn plot toont de concentratie van afhankelijke ligand Lb als een functie van de concentratie van gratis ligand Lf. Van de bindende curve, kan de dissociatieconstante K worden afgeleid als de concentratie van gratis ligand op half-maximale verzadiging opbrengst. Bovendien zijn verschillende algoritmen linearize bindende curven vastgesteld, zoals de dubbele-wederkerige plot door Klotz1,2, of transformaties volgens Scatchard of Hanes (herzien door Bisswanger3). Maar lijdt alle algoritmen aan het probleem dat de maximale waarde van de verzadiging opbrengst, die asymptotisch bij hoge concentraties van gratis ligand in de bindende curve wordt benaderd, moet worden geraamd in een grafische pre evaluatie en daarom is vergissing-geneigd.

Bovendien, vereist de vaststelling van een bindende curve de kwantificering van vrije en gebonden ligand tijdens het evenwicht bindend. Te dien einde moet de gratis ligand worden gescheiden van het ligand-receptor-gebonden en gekwantificeerd. Daarom moeten de ligand en receptor verschillen in hun eigenschappen, zoals een niet-protein ligand in tegenstelling tot een eiwit-receptor. Als beide partners bindend eiwitten zijn, moeten zij worden onderscheiden in hun formaat, kosten of andere moleculaire kenmerken. De kwantificering van de concentraties van het ligand in kleinschalige vrijblijvende aanpak is echter een moeilijke taak. Radioactieve labeling van het ligand behoefde vaak te detecteren de lage concentratie van afhankelijke ligand, vooral als aanzienlijke bedragen van receptoren niet beschikbaar of betaalbaar waren. Bovendien kan de receptor-gebonden ligand tijdens en na de isolatie op een niet te verwaarlozen wijze distantiëren. Vandaar, complexe methoden, zoals evenwicht gel filtratie4, capillaire elektroforese5en pulse proteolyse6, zijn vereist voor het kwantificeren van receptor-gebonden ligand en scheiden van gratis ligand.

In tegenstelling tot deze bindende analyses vereisen titratie experimenten geen kwantitatieve scheiding van afhankelijke en gratis ligand. Te dien einde wordt een receptor op een constante concentratie getitreerd met verschillende concentraties van toegevoegde ligand. Door binding aan de receptor heeft de afhankelijke ligand een biofysische eigenschap die zich onderscheidt van de gratis ligand en meetbaar door, bijvoorbeeld, fotometrie, fluorometry of antistofdetectie. Dus, een signaal van S, die evenredig is met de verzadiging opbrengst Y en bijgevolg ook de concentratie van receptor-gebonden ligand (L-b), wordt gedetecteerd als een functie van de totale concentratie van toegevoegde ligand (Lt). Parameters, het signaal S zowel de totale concentratie van toegevoegde ligand zijn gekwantificeerd op een directe en gemakkelijker manier dan de concentraties van afhankelijke en gratis ligand. Vooral het opsporen van receptor-gebonden ligand door enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) toegestaan de vermindering van de steekproef volumes tot onder 100 µL en parallelle metingen van verschillende concentraties van de ligand in multi goed microtiterplaat platen. In een titratie ELISA, is een receptor fysiek geadsorbeerd aan een plaat van de microtiterplaat op dezelfde concentratie en getitreerd met oplosbare ligand. De receptor is in wezen door hydrofobe adsorptie aan het plastic oppervlak geïmmobiliseerd. De oppervlakte concentratie van geïmmobiliseerdet receptor correlaten met de concentratie van de coating van de receptor in een niet-lineaire relatie, waarschijnlijk volgens Langmuir´s adsorptie] Thermo7. Naast het totale aantal geadsorbeerde receptor moleculen is hun activiteit staat een andere belangrijke parameter voor titratie testen. Alleen geïmmobiliseerd receptoren die ligand bindende activiteit hebben behouden, relevant zijn voor de bepaling van de titratie en uiteindelijk bijdragen aan de totale concentratie aan actieve receptoren Rt van de titratie assay, die direct kan niet worden bepaald.

Sites op het plastic oppervlak, die niet onder de geïmmobiliseerdet receptor vallen zijn gevoelig voor andere eiwitten, zoals de ligand adsorberen. Fysische adsorptie van het ligand dergelijke kunststof oppervlak sites zou resulteren in een vergelijkbaar signaal als het ligand-receptor-gebonden, maar toch in een niet-specifieke wijze. Om dit niet-specifieke signaal, het plastic oppervlak sites van de microtiterplaat platen die niet hebben zijn bekleed met eiwit nog wordt geblokkeerd met bovien serumalbumine (BSA). Echter voor sommige receptor-ligand titratie testen, kunnen niet-specifieke achtergrond signalen worden waargenomen. Dan, andere blokkerende makelaars, zoals een oplossing van 0,2% gelatine of van 0,04% Tween 20, worden aanbevolen.

Na binding aan de receptor, wordt de gratis ligand verwijderd door twee wassen stappen. Afhankelijke ligand blijft met de receptor, dat is geïmmobiliseerd tot het plastic oppervlak van de microtiterplaat put en eventueel versterkt door chemische fixatie. Voor de latere covalente Kruis-koppeling van afhankelijke ligand en geïmmobiliseerdet receptor met Glutaaraldehyde, wordt de buffer stof TRIS vervangen voor HEPES, zonder enige verandering in de ligand bindende. HEPES, in tegenstelling tot TRIS, doet niet inactivering van Glutaaraldehyde. De covalente Kruis-koppeling met Glutaaraldehyde corrigeert de afhankelijke ligand met de receptor en voorkomt dat de dissociatie tijdens opeenvolgende wassen en incubatie stappen. Dus, de receptor-ligand interactie is chemisch bevroren en garandeert een titratiecurve die beïnvloed door de opeenvolgende stappen van wassen en incubatie wordt. Glutaaraldehyde fixatie kan echter chemisch wijzigen de ligand en receptor op zodanige wijze dat hun interactie is verlaagd of afgeschaft. Bovendien, wijziging van epitopes binnen de ligand kan veranderen de bindende affiniteit van het antilichaam detecteren, vooral als een monoclonal antilichaam wordt gebruikt om te kwantificeren afhankelijke ligand. Hoewel geen van deze negatieve effecten van Glutaaraldehyde fixatie in deze titratie ELISA optreedt, moet de gevoeligheid van de test naar Glutaaraldehyde elke receptor-ligand interactie vóór de titratie experiment worden getest. Na fixatie, overtollige Glutaaraldehyde verwijderd in drie stappen van het wassen met TRIS-bevattende buffer. TRIS inactiveert overige aldehyde-groepen, die nonspecifically reageren misschien met het opsporen van antilichamen in de volgende stap.

Het bedrag van de afhankelijke ligand wordt gekwantificeerd met enzym-verbonden antilichamen, waarmee een fotometrische ELISA signaal S. Dit is uitgezet tegen de totale ligand concentratie Lt toegevoegd aan elk putje. Ondanks zijn gemakkelijker aanwinst is de titratiecurve niet een hyperbolische functie in tegenstelling tot de bindende curve. Bovendien is onduidelijk hoe de berekening van de dissociatieconstante K uit een titratiecurve. Hoewel algoritmen linearize spectroscopically verworven titratie curven zijn onafhankelijk gemeld door Stockell8 en Heyn en Weischet9, ze viel kort vanwege hun onzekerheid van de schatten van het signaal maximale waarde die de verzadiging opbrengst benaderingen bij hoge concentraties van toegevoegde ligand.

Hier, zijn een titratie ELISA en een niet-lineaire regressie-algoritme beschreven voor het afleiden van de dissociatieconstante K voor een receptor-ligand interactie van een titratiecurve. Dit protocol wordt geïllustreerd voor de interactie van het collageen-bindende A-domein van het integrine-α2β1 met een slang GIF-afgeleide-remmer. Verschijnsel zijn cel celadhesie-moleculen, die de ankerplaats van cellen aan de omliggende extracellulaire matrix of de onderliggende kelder membraan10,11 bemiddelen. Bovendien overbrengen verschijnsel belangrijke signalen tussen cellen en de extracellulaire matrix door de indienstneming van extra signalering van moleculen en de vorming van nieuwe organellen van de cel, adhesomes, op cel-matrix interactie12,13, 14. collageen, de ligand van integrine α2β1, is de meest voorkomende eiwit van het menselijk lichaam en is een onderdeel van de cruciale steigers van het bindweefsel15. De interactie tussen α2β1 integrine en collageen wordt gemedieerd door de A-domein van de integrine alpha2 subeenheid. Het integrine α2A-domein bevat een divalente kationen, die is vereist voor collageen bindende en stabiliseert de structuur. De wild-type formulier, evenals de mutanten van het domein van de α2A, zoals die waarin het residu van oppervlak-blootgesteld Y216 was vervangen voor een glycine, kunnen gemakkelijk worden recombinantly in een bacteriële expressie systemen geproduceerd en geïsoleerd via hun oligo-zijne-tags met een NiNTA superflow kolom met een latere dialyse tegen TRIS-gebufferde zoutoplossing (TBS; 50 mM TRIS/HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl) met 2 mM MgCl216. De concentraties ervan werden vastgesteld met de bicinchoninic zure test (BCA) en hun purities zijn getest door conventionele SDS-PAGE en gekleurd met Coomassie-Brilliant Blue R250.

De interactie tussen α2β1 integrine en collageen wordt geblokkeerd door de binding van de snake venom component, rhodocetin, van de Malayan pit-viper (Calloselasma rhodostoma)16,17. Gebruikt als een oplosbare ligand in deze titratie ELISA, rhodocetin was gezuiverd van de ruwe venom zoals eerder beschreven16. Het wordt ontbonden in HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS; 10 mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 150 mM NaCl) en worden opgeslagen bevroren bij-20 ° C. De concentratie ervan werd bepaald door BCA en haar zuiverheid werd bewezen door SDS-PAGE. Als een antagonist, rhodocetin niet alleen geblokkeerd collageen te binden aan het integrine α2β1 A-domein, maar ook de inactieve conformatie van het integrine waardoor elke signalering van collageen in cellen of trombocyten18stabiliseert. Het is van groot belang is voor het bepalen van de dissociatieconstante van rhodocetin met haar doelstelling van receptor en dus het ontrafelen van het moleculaire mechanisme en farmaceutische potentiële bvals antitrombotica agent biomedische. Te dien einde een titratie ELISA wordt beschreven, met inbegrip van de evaluatie, die is van toepassing op bijna elke receptor-ligand interactie met een 1:1 interactie stoichiometrie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. stamoplossingen

  1. Ter voorbereiding van 100 mL 10 x TBS pH 7.4 oplossing, los 6.06 g TRIS en 8.77 g NaCl in 90 mL gedeïoniseerd water, breng de pH op 7.4 met 37% HCl-oplossing, het volume tot 100 mL Vul met gedeïoniseerd water en filtreer de oplossing.
  2. Ter voorbereiding van 100 mL 1 M HEPES/NaOH, pH 7.4 oplossing, los 23.83 g HEPES in 90 mL gedeïoniseerd water, breng de pH op 7.4 met 1.5 M NaOH, vul het volume tot 100 mL met gedeïoniseerd water en filtreer de oplossing.
  3. Los op te stellen 100 mL NaCl-oplossing van 5 M, 29.2 g NaCl in 90 mL gedeïoniseerd water. Vul het volume tot 100 mL met gedeïoniseerd water en filtreer de oplossing.
  4. Ter voorbereiding van 100 mL 1 M MgCl2 oplossing, los 20.33 g MgCl2 · 6H2O in 90 mL gedeïoniseerd water. Vul het volume tot 100 mL met gedeïoniseerd water en filtreer de oplossing.
  5. Om voor te bereiden 5% BSA warmte-geïnactiveerd in water, weeg 2,5 g van BSA (deel V, pH 7,0) in een tube van 50 mL en los het op in 45 mL gedeïoniseerd water. Vul de oplossing tot 50 mL met gedeïoniseerd water en verwarm de oplossing in een waterbad bij 68 ° C voor 45 min. in een ijsbad afkoelen en opslaan bij-20 ° C.
  6. Waterige oplossing van 25% Glutaaraldehyde bereiden.
    Let op: Glutaaraldehyde is schadelijk als slikte, vergiftig bij inademing, en veroorzaakt brandwonden. Draag beschermende kleding, handschoenen, en de ogen/het gezicht bescherming.
  7. Het konijn-antiserum als eerder beschreven19verhogen. De titer van het antiserum werd vastgesteld volgens standaardprotocollen20.
  8. Anti-konijn immunoglobuline-antistoffen bereiden van geit geconjugeerd met alkalische fosfatase.
  9. Ter voorbereiding van 100 mL 0,1 M glycine oplossing, Los 0,75 g glycine in 90 mL gedeïoniseerd water. Breng de pH op 10.4 met 1.5 M NaOH-oplossing, het volume tot 100 mL Vul met gedeïoniseerd water en filtreer de oplossing.
  10. Ter voorbereiding van 100 mL 0,5 M Zn (II)-acetaat oplossing, Los 10.98 g van Zn (II)-acetaat · 2H2O in 90 mL gedeïoniseerd water. Vul het volume tot 100 mL met gedeïoniseerd water en filtreer de oplossing.
  11. Los op te stellen 100 mL van 1,5 M NaOH-oplossing, 6.0 g NaOH in 90 mL gedeïoniseerd water. Vul het volume tot 100 mL met gedeïoniseerd water en filtreer de oplossing.

2. voorbereiding van de Buffers en oplossingen

  1. Verdun 5 mL van de 10 x TBS pH 7.4, met 45 mL gedeïoniseerd water en voeg 100 µL van een stamoplossing van 1 M MgCl2 . Houd het bij kamertemperatuur. De TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 oplossing is voor immobilisatie van de receptor en wassen van de microtiterplaat plaat.
  2. Verdun 10 mL 5% van de warmte-geïnactiveerd BSA in water en 5 mL van de 10 x TBS, pH 7.4 met gedeïoniseerd water tot 50 mL. Voeg 100 µL van 1 M MgCl2 stockoplossing en meng de oplossing goed. Houd het op ijs en op te slaan voor verdere experimenten bij-20 ° C. Opmerking dat 2,5 mL van de 1% BSA in TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 zijn vereist voor elke titratiecurve.
  3. Verdun 2,5 mL van de 1 M HEPES/NaOH, pH 7.4 en 1.5 mL 5 M NaCl-oplossing tot 50 mL met gedeïoniseerd water, voeg 100 µL 1 M MgCl2 oplossing, en meng de oplossing grondig voor te bereiden van 50 mL HBS, pH 7.4: 50 mM HEPES/NaOH , 150 mM NaCl.
  4. Voeg 5 µL van 1M MgCl2 stockoplossing en 2 µL 0.5 M Zn (II)-acetaat-stockoplossing tot 5 mL 0,1 M glycine oplossing, pH 10.4 te bereiden alkalisch fosfatase (AP) buffer (0,1 M glycine oplossing, pH 10.4, 1 mM MgCl2, 0,2 mM Zn(II)-acetate).

3. de immobilisatie van de Receptor (integrine α2A-domein) op een bord van de microtiterplaat

  1. Verdun de stockoplossing van integrine-α2A-domein in TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 voor een eindconcentratie van 5 µg/mL.
    Opmerking: Het volume van de oplossing van de coating is 650 µL voor één titratiecurve bestaande uit een 12 goed-rij van een halve gebied-microtiterplaat plaat.
  2. Vul elk putje van een rij op een halve gebied-microtiterplaat plaat met 50 µL per putje van de 5 µg/mL coating oplossing van integrine-α2A-domein (wild-type of mutant). Uitvoeren van elke rij titratie minstens dubbele (in dit voorbeeld als vierling; Zie lay-out van de microtiterplaat plaat in Figuur 1).
  3. Afdichting van de plaat met folie of het te sluiten met een deksel. Laat de plaat bij 4 ° C's nachts.

4. Wash gecoat putjes van de plaat twee keer met TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2

  1. Verwijderen van oplosbare receptor moleculen, die hebben niet is geïmmobiliseerd tot het plastic oppervlak door fysische adsorptie, verwijderen van de coating-oplossing en vul elk goed met 50 µL van TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2.
  2. Verwijder de wash-oplossing. Zorg ervoor dat de putten niet droog worden. Daarom niet tikt u op de microtiterplaat plaat op een doek van weefsel te verwijderen van de resterende vloeistof. Gebruik een meerstaps pipet of een meerkanaals-pipet te snel de putjes vullen.
  3. Deze wassen stap eenmaal herhaald.

5. niet-specifieke bandplaatsen blokkeren

  1. TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 aan elk putje 50 µL van 1% BSA-oplossing toevoegen.
  2. De putjes met folie verzegelen of sluiten met een deksel.
  3. Incubeer de putjes gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    Opmerking: De stappen van de incubatie van dit protocol kan worden uitgevoerd op een platform rockende of schudden. Echter dit is niet vereist en doet niets af aan de uitkomst van het experiment.

6. bereiding van de rij van een seriële verdunning van het Ligand, Rhodocetin

  1. Varieert de concentratie van de start van de rhodocetin en de verdunningsfactor van de seriële verdunning, het verkrijgen van een passend aantal ligand concentraties en het optekenen van een volledige titratiecurve met een minimale en maximale signaal. Gebruiken in dit experiment, een concentratie van de start van 243 nM rhodocetin en een verdunningsfactor van 2.3. Verdun de stockoplossing van de rhodocetin bij de hoogste concentratie van het ligand van de seriële verdunning rij. Voor elke titratiecurve met een verdunningsfactor van 2.3, bereiden 115 µL van 243 nM (d.w.z., 15,2 µg/mL) rhodocetin-oplossing in 1% BSA/TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 in reageerbuis #1.
  2. Vul 65 µL van 1% BSA-oplossing in TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 10 reageerbuisjes, Label #2 t/m #11.
  3. Overdracht van 50 µL van de rhodocetin-verdunning van reageerbuis #1 te reageerbuis #2, meng beide oplossingen (total volume: 115 µL; verdunningsfactor: 1:2. 3) door verpulvering, waarna overdracht 50 µL van dit mengsel reageerbuis #3, enz.
  4. Blijven deze seriële verdunning tot reageerbuis #11.
    Opmerking: De volumes gegeven in stappen 6.1-6.4 zijn voldoende voor een titratiecurve. Deze volumes te vermenigvuldigen met het aantal replicatieonderzoeken. In dit geval acht titratie curven (vierling van twee α2A-domein vormen) uitvoeren en voorbereiden van de volgende volumes: 920 µL van rhodocetin oplossing met de hoogste concentratie van de teststof in de proefbuis #1; 520 µL van 1% BSA in TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2 te vullen in elk van de reageerbuisjes #2 t/m #11; en 400 µL van volume van de overdracht van een buis naar de volgende.

7. de binding van Ligand (Rhodocetin) met verschillende concentraties aan geïmmobiliseerd Receptor (integrine α2A-domein)

  1. Verwijder de blokkerende oplossing uit de wells microtiterplaat plaat door een vacuüm lijn.
  2. Voeg onmiddellijk 50 µL van de oplossing van de rhodocetin in 1% BSA/TBS, pH 7.4/MgCl2 oplossing van reageerbuis #1 in putjes van kolom 1, oplossing van reageerbuis #2 in putjes van kolom 2,etc. toevoegen 50 µL van 1% BSA in TBS, pH 7.4 , 2 mM MgCl2 (blokkeren en verdunning buffer) als een ligand-gratis besturingselement aan putjes van kolom 12 (Zie lay-out van de microtiterplaat plaat, Figuur 1).
  3. De putjes met folie verzegelen of sluiten met een deksel.
  4. Incubeer de putjes gedurende 1,5 uur op kamertemperatuur (ongeveer 20-22 ° C).

8. Wash putjes van de plaat tweemaal met HBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2

  1. Als u wilt verwijderen niet-gebonden ligand moleculen, verwijderen de bindoplossing en vul elk goed met 50 µL van HBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Verwijder vervolgens de wash-oplossing.
  2. Zorg dat de putten niet droog worden. Daarom niet tikt u op de microtiterplaat plaat op een doek van weefsel te verwijderen van de resterende vloeistof. Gebruik een meerstaps pipet of een meerkanaals-pipet te snel de putjes vullen.
  3. Deze wassen stap eenmaal herhaald.

9. fix de Ligand-Receptor-gebonden met 2,5% Glutaaraldehyde in HBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2

  1. Bereid een verse 2,5% Glutaaraldehyde oplossing door mengen 1 deel van 25% Glutaaraldehyde oplossing en 9 delen van HBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2.
  2. Vul elk putje van de microtiterplaat plaat met 50 µL van de 2,5% Glutaaraldehyde oplossing in HBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Laat de plaat van de microtiterplaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur inwerken.

10. wassen putjes van de plaat driemaal met 50 µL per putje van TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2

  1. Om te verwijderen en inactivering van overtollige Glutaaraldehyde, verwijderen van de fixatie oplossing en vul elk goed met 50 µL van TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Verwijder de wash-oplossing.
    Let op: Giet de fixatie Glutaaraldehyde-bevattende oplossing van de microtiterplaat plaat in een schotel en negeren de fixatie oplossing nadat het heeft zijn geïnactiveerd door een gelijk volume van TBS, pH 7.4.
  2. Zorg dat de putten niet droog worden. Daarom niet tikt u op de microtiterplaat plaat op een doek van weefsel te verwijderen van de resterende vloeistof. Gebruik een meerstaps pipet of een meerkanaals-pipet te snel de putjes vullen.
  3. Herhaal deze stap wassen tweemaal.

11. kwantificering van Receptor-gebonden Ligand door ELISA

  1. Voeg 50 µL per putje van de primair antilichaam-oplossing in 1% BSA in TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Het primaire antilichaam-oplossing is een konijn-antiserum opgeworpen tegen rhodocetin19, 1:2,000 in 1% BSA in TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2verdund.
  2. Incubeer de plaat voor 75-90 min bij kamertemperatuur. Was alle putjes van de plaat driemaal met 50 µL per putje van TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Tijdens de drie stappen wassen, tikken van de microtiterplaat plaat op een weefsel is doek niet vereist.
  3. Voeg 50 µL per putje van de oplossing van secundair antilichaam in 1% BSA in TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2. Verdun de secundair antilichaam, konijn immunoglobuline-targeting geit antilichamen geconjugeerd met alkalische fosfatase, te 1:2,000 in 1% BSA in TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2te dien einde. Incubeer de plaat voor 75-90 min bij kamertemperatuur.
  4. Bereid AP-opsporing-oplossing door het oplossen van een tablet van 5 mg met 4-nitrofenyl fosfaat Dinatrium zout-hexahydraat (fosfatase substraat) in 5 mL AP buffer (0,1 M glycine oplossing, pH 10.4, met 1 mM MgCl2 en 0,2 mM Zn(II)-acetate).
  5. Was alle putjes van de plaat driemaal met 50 µL per putje van TBS, pH 7,4, 2 mM MgCl2, onmiddellijk voordat u de volgende stap uitvoert. Tik op de microtiterplaat plaat op een doek van weefsel na de laatste stap van het wassen om alle sporen van vloeistof te verwijderen.
  6. Voeg toe 50 µL per putje van de AP-opsporing oplossing aan de putjes van de microtiterplaat plaat. Voeg AP-opsporing oplossing onmiddellijk aan alle putjes om te beginnen de enzymatische conversie zo gelijktijdig mogelijk. Gebruik daarom een meerkanaals pipet.
  7. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur totdat de oplossing in de putjes met de hoogste concentratie van de ligand geel.
    Opmerking: De incubatietijd kan variëren tussen 5 min en 1 h afhankelijk van de intensiteit van het signaal.
  8. Conversie van het substraat fosfatase stoppen door 50 µL per putje van 1,5 M NaOH-oplossing toe te voegen. Laat de plaat staan gedurende enkele minuten om streeploze mengen van beide oplossingen. Om te rechtvaardigen de dezelfde incubatietijd in alle putjes, gebruik van een meerkanaals-pipet en de 1.5 M NaOH in dezelfde volgorde toegevoegd aan de putjes goed als die van het substraat AP-opsporing in stap 11,8 toevoegen.
  9. Meet de optische dichtheid (OD) op 405 nm van elk putje door een ELISA-lezer.

12. evaluatie van de titratie signalen

  1. Open de tabel van raw-gegevens, de OD405nm waarden, met Excel. Als deze waarden van het signaal van de titratie curven worden gelezen in rijen, omzetting de waarden voor een kolom en een label met de concentraties van toegevoegde ligand in een andere kolom.
  2. Open het Graphpad prisma 5 (versie 5.0). Open een nieuw projectbestand in het hoofdmenu. Kies het formaat van de XY onder nieuwe gegevens & grafiek. Kies de optie Enter en plot één aanspreekpunt voor elke waarde voor de y-as.
  3. Kopieer de twee kolommen, concentratie van toegevoegde ligand en signaal waarden (OD405nm ) uit het excel bestand en plak ze in de data sheet van GraphPad prisma als X en Y-waarden, respectievelijk.
  4. Open het programma analyse sub GraphPad prisma 5 en kies de optie niet-lineaire regressie onder XY-analyse. Kies gebruiker gedefinieerde vergelijking en druk op de knop Nieuw om een nieuwe vergelijking.
  5. Typ de titratie curve vergelijking in de vorm: Y =(Smax-Smin)*((X+R+K)-sqrt((X+R+K)^2-4*R*X)) /(2*R) Smin + B * X in het onlangs geopende sjabloon blad, met Y wordt het signaal waarde S, X wordt de concentratie van toegevoegde ligand L , R wordt de concentratie van geïmmobiliseerd receptor, wordt de dissociatieconstante, K en B wordt de achtergrond helling. Definieer de passende beperkingen, zoals K > 0 en R > 0.
    Opmerking: Deze vergelijking is de dezelfde vergelijking van vergelijking 9 in een andere vorm.
  6. Het analyseren van de waarden van het gegevensblad door te kiezen voor de gebruiker gedefinieerde vergelijking, die onlangs werd opgericht. Open de tabel met de waarden van de berekende onderlinge aanpassing (K, R,t, S-maxSminen B) die worden weergegeven onder de sectie van het resultaat aan de linkerzijde van het scherm software.
    Opmerking: De software bepaalt de 5 parameters door het iteratieve aanbrengen van de niet-lineaire regressie alleen als de titratiecurve uit ten minste 5 gegevenspunten bestaat.
  7. De parameters K, Rt, S-max, Sminen B voor elke groep van titratie krommen statistisch te evalueren, en de parameters correleren met de specifieke functie van de groep (gemuteerde of chemisch gemodificeerde ligand of receptor).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na de ELISA heeft ontwikkeld, de gele kleur van het geconverteerde alkalische fosfatase substraat, para- nitrophenolate, geeft aan dat de hoeveelheid afhankelijke rhodocetin ligand afneemt met toegevoegde rhodocetin van PM10 kolommen 1 tot en met 11 (Figuur 1). De kleurloze wells in de rhodocetin-vrije putten in kolom 12 Toon het signaal van een lage achtergrond.

Fotometrische kwantificerin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De titratie ELISA is een veelzijdige testsysteem om te bepalen van de dissociatie van een receptor-ligand interactie. Als de titratie ELISA omzeilt de noodzaak om te scheiden van vrije en gebonden liganden effectief en te analyseren hun concentraties kwantitatief, aanzienlijk meer studies en publicaties titratie ELISAs hebt gebruikt in plaats van het opnemen van bindende curven . Bovendien, titratie ELISAs zijn eenvoudig uit te voeren en redelijk lage hoeveelheden receptor en ligand vereisen. Voor nauwkeurige analyse van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteur heeft niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Het protocol en het algoritme zijn ontwikkeld binnen een project gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG grant SFB1009 A09 en EB177/13-1). De auteur dankt Barbara Schedding en Felix Schmalbein voor technische ondersteuning en Dr. Niland voor het kritisch lezen van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
TRISneoFrox1125KG001
HEPESSigma-AldrichH4034
NaClApplichem1,316,591,214
MgCl2Merck172571
integrin a2A, wild-type en mutant, recombinantgeïsoleerd in het lab van de auteur
NiNTA superflow kolom Qiagen, Duitsland30821
Coomassie-Brilliant Blue R250Serva35050
bicinchoninezuur assay (BCA), kit voor bepaling van de eiwitconcentratieFisher Scientific23225
boviens serumalbumine (BSA), fractie VApplichemA1391
25 % oplossing van glutaaraldehydeMerck354400
anti-konijn immunoglobuline-antilichamen van geit, geconjugeerd met alkalische fosfataseSigma-AldrichA9919
GlycineApplichemA1377
Zn(II)-acetaatApplichemA4324
NaOHApplichemA1551
Alkaline fosfatase substraat tablet (5 mg)Sigma-AldrichS0942
Costar half-area microtiterplaatThermo ScientificCorning 3690
micro reactiebuisjesEppendorf30120086
Microplate ELISA-lezerBioTekSynergy HT

Referenties

  1. Klotz, I. M. The application of the law of mass action to binding by proteins; interactions with calcium. Arch Biochem. 9, 109-117 (1946).
  2. Klotz, I. M. Ligand-receptor complexes: origin and development of the concept. J Biol Chem. 279 (1), 1-12 (2004).
  3. Bisswanger, H. Ch. 1: Multiple Equilibria, Principles and Derivations. Enzyme Kinetics: Principles and Methods. , Wiley VCH Verlag GmbH. 1-26 (2017).
  4. Shimura, K., Kasai, K. Affinity gel titration: quantitative analysis of the binding equilibrium between immobilized protein and free ligand by a continuous titration procedure. Anal Biochem. 149 (2), 369-378 (1985).
  5. Gong, M., Nikcevic, I., Wehmeyer, K. R., Limbach, P. A., Heineman, W. R. Protein-aptamer binding studies using microchip affinity capillary electrophoresis. Electrophoresis. 29 (7), 1415-1422 (2008).
  6. Hanes, M. S., Ratcliff, K., Marqusee, S., Handel, T. M. Protein-protein binding affinities by pulse proteolysis: application to TEM-1/BLIP protein complexes. Protein Sci. 19 (10), 1996-2000 (2010).
  7. Latour, R. A. The Langmuir isotherm: a commonly applied but misleading approach for the analysis of protein adsorption behavior. J Biomed Mater Res A. 103 (3), 949-958 (2015).
  8. Stockell, A. The binding of diphosphopyridine nucleotide by yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J Biol Chem. 234 (5), 1286-1292 (1959).
  9. Heyn, M. P., Weischet, W. O. Circular dichroism and fluorescence studies on the binding of ligands to the α subunit of tryptophan synthase. Biochem. 14 (13), 2962-2968 (1975).
  10. Campbell, I. D., Humphries, M. J. Integrin structure, activation, and interactions. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (3), (2011).
  11. Zeltz, C., Gullberg, D. The integrin-collagen connection--a glue for tissue repair? J Cell Sci. 129 (4), 653-664 (2016).
  12. Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468 (7323), 580-584 (2010).
  13. Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annu Rev Immunol. 25, 619-647 (2007).
  14. Luo, B. H., Springer, T. A. Integrin structures and conformational signaling. Curr Opin Cell Biol. 18 (5), 579-586 (2006).
  15. Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978(2011).
  16. Eble, J. A., Tuckwell, D. S. The α2β1 integrin inhibitor rhodocetin binds to the A-domain of the integrin α2 subunit proximal to the collagen-binding site. Biochem J. 376 (Pt 1), 77-85 (2003).
  17. Eble, J. A., et al. The α2β1 integrin-specific antagonist rhodocetin is a cruciform, heterotetrameric molecule. FASEB J. 23 (9), 2917-2927 (2009).
  18. Eble, J. A., et al. Dramatic and concerted conformational changes enable rhodocetin to block α2β1 integrin selectively. PLoS Biol. 15 (7), e2001492(2017).
  19. Bracht, T., Figueiredo de Rezende, F., Stetefeld, J., Sorokin, L. M., Eble, J. A. Monoclonal antibodies reveal the alteration of the rhodocetin structure upon α2β1 integrin binding. Biochem J. 440 (1), 1-11 (2011).
  20. Harlow, E., Lane, D. Chapter 5: Immunizations. Antibodies, a laboratory manual. 5, Cold Spring Harbor Laboratory. 53-138 (1988).
  21. Lu, D. Analyzing interactions between SSB and proteins by the use of fluorescence anisotropy. Methods Mol Biol. 922, 155-159 (2012).
  22. Fielding, L. NMR methods for the determination of protein-ligand dissociation constants. Curr Top Med Chem. 3 (1), 39-53 (2003).
  23. Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr Opin Struct Biol. 11 (5), 560-566 (2001).
  24. McDonnell, J. M. Surface plasmon resonance: towards an understanding of the mechanisms of biological molecular recognition. Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 572-577 (2001).
  25. Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Curr Opin Biotechnol. 11 (1), 54-61 (2000).
  26. Pesquero, N. C., et al. Real-time monitoring and kinetic parameter estimation of the affinity interaction of jArtinM and rArtinM with peroxidase glycoprotein by the electrogravimetric technique. Biosens Bioelectron. 26 (1), 36-42 (2010).
  27. Scheuermann, T. H., Padrick, S. B., Gardner, K. H., Brautigam, C. A. On the acquisition and analysis of microscale thermophoresis data. Anal Biochem. 496, 79-93 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Niet lineaire regressieDetectie van alkalische fosfataseSeri le verdunningFixatie met glutaaraldehydeMeting van de optische dichtheidProteinbindingsaffiniteitAnalyse met ELISA lezer

Gerelateerde artikelen