Implantatie van Electrospun vaattransplantaten met geoptimaliseerde structuur in een Rat-Model

Samenvatting

Hier presenteren we een gewijzigde electrospinning methode voor het fabriceren van PCL vaattransplantaten met dikke vezels en grote poriën en een protocol ter evaluatie van de prestaties in vivo in rat model van abdominale aorta vervanging beschrijven.

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te fabriceren macroporeuze PCL-vasculaire graft en beschrijven van een evaluatie-protocol met behulp van een model van de rat van vervanging van de abdominale aorta. De electrospun vaattransplantaten bezitten vaak relatief kleine poriën, die beperken cel infiltratie in de transplantaties en de regeneratie en verbouwing van de neo-aders belemmeren. In deze studie werden PCL vaattransplantaten met dikkere vezels (5-6 µm) en grotere poriën (~ 30 µm) vervaardigd met behulp van een gemodificeerde gegevensverwerking. De prestaties op lange termijn van de prothese werd beoordeeld door de inplanting in een rat abdominale aorta-model. Echografie-analyse toonde aan dat de transplantaten bleef octrooi zonder aneurysma of stenose die zelfs na 12 maanden innesteling intreedt. Macroporeuze structuur verbeterd de cel ingroei en dus bevorderd weefsel geregenereerd op 3 maanden. Wat nog belangrijker is, was er geen teken van nadelige Remodellerend, zoals verkalking binnen de stadsmuur van het transplantaat na 12 maanden. Daarom houdt electrospun PCL vaattransplantaten met gemodificeerde macroporeuze verwerking potentieel als een slagader substituut voor lange termijn implantatie.

Inleiding

Vaattransplantaten gemaakt van synthetische polymeren worden algemeen gebruikt in de kliniek voor de behandeling van cardiovasculaire aandoeningen (CVDs). Helaas, in het geval van kleine diameter vaattransplantaten (D < 6 mm) er zijn geen succesvolle producten beschikbaar vanwege de lage bij veroorzaakt door verminderde bloed stroomsnelheid, die vaak tot trombose, intima hyperplasie en andere leidt complicaties¹.

Weefselengineering biedt een alternatieve strategie te realiseren op lange termijn bij en homeostase op basis van een steiger geleide vasculaire regeneratie en wederopbouw. In detail, de vasculaire prothese, als een driedimensionale sjabloon, kon bieden mechanische ondersteuning en structurele begeleiding tijdens de regeneratie van vaatweefsel en invloed cellulaire functies, met inbegrip van cel adhesie, migratie, proliferatie, en secretie van extracellulaire matrix². Tot nu toe zijn verschillende synthetische polymeren geëvalueerd voor toepassingen in vaatweefsel engineering. Onder deze polymeren, is poly(ε-caprolactone) (PCL) intensief onderzocht vanwege goede cel compatibiliteit en langzame afbraak, variërend van enkele maanden tot twee jaar³. In een rat aorta model^4,5,6, PCL vaattransplantaten verwerkt door electrospinning tentoongesteld uitstekende structurele integriteit en bij, zo goed als continu verhoogde cel invasie en neovascularization in de Graft muur voor maximaal 6 maanden. Echter nadelige weefsel remodeling, met inbegrip van regressie van cellen en de haarvaten en verkalking, werden ook waargenomen bij langere timepoints, omhoog tot 18 maanden.

Cellularization van de vasculaire prothese is een sleutelfactor bepalen Weefselregeneratie en omvorming van⁷. Electrospinning, heeft als een veelzijdige techniek, grote schaal gewerkt voor de bereiding van vaattransplantaten met nano-vezelige structuur⁸. Helaas, de relatief kleine poriënstructuur leidt vaak tot onvoldoende cel infiltratie in de electrospun vasculaire prothese, waardoor de latere weefselregeneratie wordt beperkt. U kunt dit probleem oplossen, zijn diverse technieken geprobeerd poriegrootte en algehele porositeit, met inbegrip van het zout/polymeer uitloging^9,10, wijziging van verzamelaar apparaten, nabehandeling door laserstraling^{11 te verhogen} , enz. In feite, is de structuur van electrospun transplantaties (met inbegrip van de diameter van de vezel, poriegrootte en porositeit) nauw verwant aan de verwerking voorwaarden^12,13. Tijdens electrospinning, kan de diameter van de vezels gemakkelijk worden gecontroleerd door het veranderen van de parameters, zoals de concentratie van de polymeeroplossing, debiet, spanning, etc. ^{14 , 15}, en dus de poriën en porositeit dienovereenkomstig zijn verbeterd.

Onlangs meldden wij een gemodificeerde PCL electrospun transplantaat met macroporeuze structuur (vezels met diameter van 5-7 µm en poriën van 30-40 µm). In vivo implantatie door vervanging van de abdominale aorta rat toonde hoge tarief van bij, evenals de goede endothelialization en gladde spieren regeneratie op 3 maanden na operatie¹⁶. Wat nog belangrijker is, kon geen negatieve weefsel remodeling met inbegrip van verkalking en cel regressie worden waargenomen zelfs na een jaar van implantatie.

Protocol

Het gebruik van proefdieren werd goedgekeurd door het dier experimenten ethisch comité van Nankai Universiteit en uitgevoerd in overeenstemming met de gids voor zorg en gebruiken van proefdieren.

1. fabricage van Electrospun PCL transplantaten

Opmerking: Hierin een electrospinning techniek werd gebruikt om het fabriceren van vaattransplantaten.

1. PCL-oplossingen van 25 wt % en 10% van de wt, bereiden door PCL in een mengsel van methanol en chloroform, respectievelijk ontbinding (1:5 volumeverhouding), bij kamertemperatuur (RT) voor 12u.
2. Laad de PCL-oplossing in een glas 10 mL spuit.
3. Plaats de injectiespuit met een naald 21-G.
4. Plaats de as van roestvrij staal (2 mm in diameter en 25 cm in lengte) op het instrument van de collectie.
5. Voor dikkere-vezel transplantaten, gebruiken de PCL-oplossing van 25% van de wt, de afstand van 17 cm vanaf de naald tip om verzamelaar, debiet van 8 mL/h, en spanning van 11 kV als de parameters van de electrospinning. Voor dunner-vezel transplantaten, gebruik de PCL-oplossing van 10% van de wt, afstand van 20 cm vanaf de naald tip aan verzamelaar, een debiet van 2 mL/h en spanning van 18 kV als de parameters van de electrospinning.
6. Ervoor zorgen dat de verkregen transplantaties zijn geplaatst in vacuüm 's nachts aan Verwijder het resterende oplosmiddel. Steriliseren van alle instrumenten vóór de ingreep en onderhouden van aseptische techniek in.
7. Voorafgaand aan de implantatie, de protheses te ontsmetten door ze onder te dompelen in 10 mL van 75% ethanol voor 30 min en dan zij worden blootgesteld aan UV-licht 's nachts.
8. Vezels en porie-grootte-metingen: Bereken de diameter van de gemiddelde vezel ImageJ softwarematig op basis van scanning elektronen microscopie (SEM) beelden.
9. Mechanische testen van steigers:
   1. Snijd de tubulaire steigers in secties van de 3 mm in lengte met een scheermesje. Het meten van de dikte van steigers met behulp van een micrometer.
   2. Plaats de tubulaire steigers op een treksterkte-testen machine met een laadvermogen van 100 N.
   3. Klem de steigers met een 1 mm tussen klem afstand en pull lengterichting met een snelheid van 10 mm/min tot breuk. De treksterkte en de ultieme breukrek meten. Youngs modulus uit de eerste lineaire regio berekenen (tot 5% stam) van de spanning-spanning-curve.

2. rat abdominale Aorta implantatie Model

Opmerking: Alle materialen en instrumenten die worden gebruikt in de chirurgie zijn steriel. Tijdens de operatie, door ervoor te zorgen dat de exploitant draagt een masker van gaas en steriele handschoenen om te voorkomen dat infecties. Verzekert de kamertemperatuur is bij 27-30 ° C om de dierlijke lichaamstemperatuur te houden. Volg lokale IACUC richtsnoeren met betrekking tot analgesie.

1. Gebruik mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht van 240-270 g als ontvangers van vasculaire prothese. Zorg ervoor dat de rat heeft gevast 24 uur voor de ingreep. De vasten ratten gedurende 24 uur wil leeg de uitwerpselen in het darmkanaal voldoende, aldus verbreden de exploitant van de horizon.
2. Begrijpen van de rat rug nek en houd zijn hoofd naar beneden, de springe naald in de buikholte van de onderbuik invoegen. Het opwekken van de rat voor anesthesie met Chloraalhydraat (330 mg/kg) door een intraperitoneale injectie.
3. Bevestigen voldoende afstomping door ervoor te zorgen dat de rat heeft ontspannen spieren en regelmatige ademhaling. Plaats de rat onder de operationele Microscoop in een liggende positie.
4. Toepassing petrolatum ophthalmic dierenarts zalf op de ogen om te voorkomen dat droogte terwijl onder verdoving. Beheren antistolling (100 UI/kg) met fysiologische zoutoplossing EDTA-oplossing (50 UI/mL) door staart veneuze injectie voor de operatie.
5. De vacht in de voorste buikwand met behulp van een scheermesje afscheren, en reinig de huid met behulp van jodiumoplossing en medische alcohol oplossing.
6. Een middellijn laparotomie incisie uitvoeren met een chirurgische schaar en ervoor zorgen dat de incisie ongeveer 4-5 cm lang, en vervolgens bloot de buikholte.
7. Intrekken en wikkel de darmen met gaas bevochtigd met zoutoplossing bij voorkeur.
8. Ontleden van de abdominale aorta zorgvuldig.
9. Identificeren en afbinden van alle kleine takken met 9-0 monofilamenten nylon hechtingen.
10. Klem het geïsoleerde gedeelte (maximaal 1 cm in lengte) van de aorta met behulp van twee vasculaire klemmen. De aorta kan blijven geklemd voor 20-30 min.
11. Transect van de abdominale aorta tussen twee klemmen de anastomotic sites maken met behulp van micro-schaar.
12. De twee uiteinden van de aorta met behulp van EDTA saline (50 UI/mL) oplossing voor het verwijderen van de resterende bloed te spoelen.
13. De adventitia met behulp van de micro-schaar afschilferen.
14. Anastomose de prothese met 2 mm binnendiameter en 1 cm in de lengte van de rat abdominale aorta met een cijfer-van-8 hechtdraad patroon met 9-0 monofilamenten nylon hechtingen.
15. Ten eerste, bouw van vier anastomoses volgens de volgorde van 9, 3, 12 en 6 uur posities op de proximale zijde, dan anastomose gesneden randen in 4 steken tussen twee hechtingen. Na het beëindigen van de proximale hechtdraad, suture de distale zijde door de dezelfde methode.
    Opmerking: Elke steek is vereist om ervoor te zorgen dat de inheemse kant iets is ingebed in de prothese.
16. De distale klem zodat het bloed stromen naar de prothese te verwijderen en deze vervolgens verwijdert de proximale klem.
17. Druk op de uiteinden van de hechtdraad om te stoppen met het bloeden met een steriel katoenen bal of een kleine gaas spons. Druk gedurende ongeveer 3 minuten, tot de hemostase.
18. De darmen in de buikholte retourneren
19. Spoel de buikholte met behulp van warme fysiologische zoutoplossing oplossing met gentamicine (320 U/mL).
20. Naai op de buikwand met een 3-0 Nylon hechtdraad in de spieren en huid laag, respectievelijk.
21. Plaats de rat in een kooi schoon en droog en zet een verwarming pad onder de kooi te handhaven van dierlijke lichaamstemperatuur; dan wacht op de rat om te herstellen van de verdoving. Wonen aan het dier totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen.
22. Nadat het terugkrijgt bewustzijn, zet u de rat in een enkele kooi met voedsel en water. Breng jodium op de wond om infecties te voorkomen na de operatie. Terug de rat naar het gezelschap van andere dieren tot het volledig herstelt.
23. Euthanaseren ratten volgens institutionele richtsnoeren op vooraf bepaalde tijdstippen.

Resultaten

De PCL-transplantaties waren transplanteren op 3 maanden en 12 maanden post-operatively en geanalyseerd door histologische standaardtechnieken voor haematoxyline en eosine (H & E), Masson trichrome, Verhoeff-van Gieson (VVG), Von Kossa en immunofluorescentie kleuring voor α-SMA, MYH, vWF en elastine. De histologische beelden werden genomen met behulp van een rechtop Microscoop, en de immunofluorescentie beelden werden genomen met behulp van een microscoop met fluorescence.

Discussie

Cel infiltratie is kritisch voor de regeneratie en remodelleert van de vasculaire graft in vivo¹⁶. Beperkte cel infiltratie is vaak gerelateerd aan de relatief kleine poriën van de prothese, die een belemmering vormen voor de migratie van de cellen in de wand van de prothese. Om aan te pakken dit probleem, we een gewijzigde methode ontwikkeld om electrospun PCL vaattransplantaten met grote-poriënstructuur bereiden. In detail, de poriegrootte toegenomen met de toename van de dikte van de v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80.000)	Sigma	704067
Methanol	Tianjin Chemical Reagent Company	1060
Alcohol	Tianjin Chemical Reagent Company	1083
Chloroform	Tianjin Chemical Reagent Company	A1007
Sucrose	Tianjin Fengchuan Company	2296
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
Sprague Dawley-ratten	Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences
Normale zoutoplossing	Hebei Tiancheng Pharmaceutical company
Chloraalhydraat	Tianjin Ruijinte chemical company	2223
Heparine-natriuminjectie	Tianjin Biochem Pharmaceutical company
Gentamicinesulfaatinjectie	Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company
Muis anti-α-SMA primaire antilichaam	Abcam	ab7817
Muis anti-smooth MYH primaire antilichaam	Abcam	ab683
Konijn polyklonaal anti-ratten-elastine-antilichaam	Abcam	ab23748
Konijn anti-von Willebrand-factor primaire antilichaam	Abcam	ab6994
Geit anti-muis IgG (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150117
Geit anti-konijn IgG (Alexa Fluor 488)	Invitrogen	ab150077
5% normaal geitenserum	Zhongshan Golden bridge	ZLI9022
Hematoxyline en eosine (H&E)	Beijing leagene biotech	DH0006
Masson's trichrome	Beijing leagene biotech	DC0032
Verhoeff-van Gieson (VVG)	Beijing leagene biotech	DC0059
Von Kossa	Beijing leagene biotech	DS0003
Chirurgische hechtnaalden met draad, 3-0 zijde	Shanghai Jinhuan medical supplies company	G3002b
Chirurgische hechtnaalden met draad, 9-0 zijde	Shanghai Jinhuan medical supplies company	H901