Kwantificering van lipide overvloed en evaluatie van de distributie van het lipide in Caenorhabditis elegans door Nile rood en olie Red O kleuring

Samenvatting

Nile rode kleuring van vaste Caenorhabditis elegans is een methode voor kwantitatieve meting van neutrale lipide deposito's, terwijl kwalitatieve beoordeling van lipide verdeling over weefsels olie rood O kleuring vergemakkelijkt.

Samenvatting

Caenorhabditis elegans is een uitzonderlijke modelorganisme waarin lipide metabolisme en energie homeostase te studeren. Veel van de lipide-genen zijn bewaard in mens en metabool syndroom of andere ziekten zijn gekoppeld. Lipide accumulatie in dit organisme kunnen worden onderzocht door kleefpoeders kleurstoffen of etiket-vrije methoden. Kleefpoeders vlekken zoals Nile rode en rode O olie zijn goedkope, betrouwbare manieren te kwantitatief meten van lipide niveaus en kwalitatief observeren lipide distributie in de weefsels, respectievelijk. Deze vlekken is bovendien voorzien van high-throughput screening van verschillende lipide metabolisme genen en trajecten. Bovendien hun hydrofobe natuur vergemakkelijkt lipide oplosbaarheid, interactie met de omringende weefsels vermindert en voorkomt dissociatie in het oplosmiddel. Al deze methoden effectief zijn in het onderzoeken van algemene vetgehalte, bieden ze geen gedetailleerde informatie over de chemische samenstelling en de diversiteit van lipide deposito's. Voor deze doeleinden, label-vrije methoden zoals microscopie van GC-MS en auto's zijn beter geschikt, hun kosten niettegenstaande.

Inleiding

Vetten zijn essentieel voor het leven. Ze vormen integrerende bestanddelen van membranen, fungeren als secundaire boodschappers signaal transductoren en cruciale functies hebben in de energie-opslag. Wanneer lipide metabolisme dysregulated is, leidt het tot ziekten als obesitas en diabetes type II, die zijn indrukken van de volksgezondheid betreft⁹. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een uitstekend model-organisme in te studeren lipide metabolisme omdat het heeft een relatief korte levenscyclus, een transparante body, een bekende cel afkomst en een volledig gesequenceerd genoom. Voornamelijk een hermafrodiet, C. elegans kunnen onderzoekers te verhogen van grote aantallen isogene dieren in korte perioden naar eroptoetezien high-throughput voorwaartse genetische schermen te bestuderen van een breed scala aan metabole genen en trajecten⁴. Deze aanpak is gebleken dat een hoge mate van instandhouding in 273 C. elegans lipide metabolisme genen tussen mens, muizen, ratten en drosophila. Bovendien hebben meer dan 300 lipide genen in C. elegans menselijke orthologues die gekoppeld aan ziekten die niets met metabool syndroom^{11 zijn}. Traditioneel heeft onderzoek van lipide-opslag in C. elegans meestal waarop de kleurstof-geëtiketteerden testen, die robuuste informatie om lipide accumulatie bieden. Minder voorkomende is een beschrijving van waar lipiden lokaliseren en gemeten verschillen in lipide overvloed over weefsels. Recent werk is echter gebleken dat lipide distributie zo belangrijk als lipide accumulatie^{6 zijn kan}.

Lately, studies zijn begonnen met het integreren van methoden zoals hoge prestatie vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (HPLC-MS), gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), en coherente anti-stokes Raman microscopie van de verstrooiing (auto's) wil de tekortkomingen van vlek gebaseerde benaderingen door direct het analyseren van de inhoud van lipide extracten, specifieke lipide breuken, en lipide deposito's, respectievelijk^10,11. Auto's microscopie is bovendien gebleken dat Nile rood alleen als een proxy voor vet accumulatie dienen kan wanneer gebruikt als een kleefpoeders kleurstof, voor het gebruik ervan als een vitale vlek leidt tot uit-target kleuring van auto-belichting fluorescerende organellen¹⁰. Echter, de vereiste technische deskundigheid en kosten in verband met deze chromatografie en Microscopie methodes benutten hun onhoudbaar voor veel onderzoeksvragen. In dit artikel bespreken we een handige en betrouwbare methode om te fixeren en neutrale lipide deposito's in C. elegans met behulp van de Nijl rode vlekken en rode O om te onderscheiden van lipide overvloed bij hele dieren en bij specifieke weefsels olie.

Nile rood, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, is een benzophenoxazone kleurstof die gemakkelijk in verschillende organische oplosmiddelen oplost, maar meestal slecht in water oplosbaar is. Het is een uitstekende lysochrome kleurstof gebruikt om neutrale lipiden zoals triglyceriden vlek of cholesterol esters omdat het beschikt over een sterke kleur, Lost goed in lipiden, heeft verwaarloosbare interactie met de omringende weefsels en is minder oplosbaar in het oplosmiddel dan in lipiden. Het heeft een excitatie en emissie-maxima van 450-500 en 520 nm, respectievelijk¹. Wanneer Nile rood gebeitste C. elegans voor groene fluorescentie wordt bekeken, kunnen discrete lipide organen worden waargenomen in de darm en andere weefsels of in clusters of gelijkmatig verspreid, afhankelijk van het genotype van het dier of de experimentele behandeling ⁷.

Olie rood O is een lysochrome, vet oplosbare kleurstof gebruikt om vlek triglyceriden en lipoproteïnen. Het is een azo-kleurstof genoemd, omdat de chemische structuur twee azo groepen gekoppeld aan drie aromatische ringen bevat. Het is moeilijk te ioniseren, waardoor het zeer goed oplosbaar in lipiden. De vlek kleur is rood en de lichte absorptiemaximum 518 nm ³. C. elegans gekleurd met olie rood O Toon rode lipide druppels die opvallen tegen transparant lichaam van het dier, dat vergemakkelijkt de kwalitatieve beoordeling van lipide verdeling over de verschillende weefsels en⁶.

Protocol

1. Nijl rood (NR) kleuring van lipiden

1. Bereiding van de stockoplossing NR 5 mg/mL
   1. In een fles van 500 mL, voeg 100 mg poeder NR tot 200 mL 100% aceton.
   2. Dekking van de fles met aluminiumfolie om te voorkomen dat de eventuele blootstelling aan licht.
   3. Roer de oplossing gedurende 2 uur in het donker voor gebruik.
   4. Voor langdurig gebruik, bewaar de stockoplossing van NR in een strak verzegelde fles zonder eventuele blootstelling aan licht. Schaal NR stockoplossing volgens onderzoeksbehoeften. Zorg ervoor dat het dezelfde stockoplossing over NR-kleuring experimenten wordt gebruikt om consistente kleuring en imaging resultaten te verkrijgen.
2. Voorbereiding van NR werkoplossing
   1. Voor elke 1 mL van 40% isopropanol (v/v), voeg 6 µL van de stockoplossing NR.
   2. Bereiden 600 µL NR werkende oplossing voor elk monster.
      Opmerking: Zorg verse NR werken oplossing recht vóór de kleuring. Afhankelijk van de behoeften van de stockoplossing van NR, een 15 mL of conische tube van 50 mL studeerde aan gebruiken.
3. Voorbereiding van wormen NR lipide kleuring
   1. Groeien wormen te vroeg stadium van de L4 bij 20 ° C op de nematode groeimedium (NGM) bezaaid met laat-log OP50 E. coli.
   2. Wassen van de wormen uit de plaat met 1 mL 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing + 0,01% Triton X-100 (PBST) oplossing en zet de opschorting van de worm in een 1,5 mL microfuge buis.
   3. Centrifuge die de wormen bij 560 x g gedurende 1 min. Verwijder de bovendrijvende vloeistof en herhaal deze stap tot en met E. coli is uitgeschakeld van schorsing.
   4. Voeg 100 µL van 40% isopropanol naar de worm pellet en na het bebroeden bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
   5. Centrifugeer de wormen bij 560 x g gedurende 1 minuut en schenk de bovendrijvende vloeistof verwijderen zonder het verstoren van de worm-pellet.
      Opmerking: Gebruik hogere volumes PBST te wassen de wormen uit de platen als met behulp van grotere platen of kleuring meer wormen per plaat. De wormen in PBST meer dan 15 min voordat de monster fixatie niet wassen. Voer extra wast als het supernatant niet van bacteriën gewist wordt. Voeren de incubatietijd in 40% isopropanol met behulp van een nutator of rocker. Altijd controleren de buizen om ervoor te zorgen volledige monster agitatie plaatsvindt.
4. Lipide kleuring met NR
   1. Voeg in het donker, 600 µL NR werkoplossing aan elk monster. De buizen drie keer omkeren en volledig Meng de wormen in NR oplossing.
   2. Het monster in het donker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur roteren.
   3. Na de incubatie, centrifugeer de wormen bij 560 x g gedurende 1 minuut en verwijder de bovendrijvende substantie.
   4. Voeg 600 µL van PBST en de monsters in het donker gedurende 30 minuten voor het verwijderen van overtollige NR vlek uit te broeden.
   5. Centrifugeer de monsters bij 560 x g gedurende 1 minuut en alle ongeveer 50 µL van de bovendrijvende vloeistof verwijderen.
      Opmerking: NR-incubatie vereist geen agitatie. Beslechting van wormen is gebruikelijk tijdens deze stap.
5. Voorbereiding van dia's voor Microscoop imaging
   1. Resuspendeer de pellet worm in de resterende supernatant.
   2. Plaats van 5 µL van worm schorsing op een microscoopglaasje en zet een dekglaasje aan op zorgvuldig om te voorkomen dat alle luchtbellen overvullen.
   3. Zegel van het dekglaasje aan met nagellak voor imaging wormen.
   4. Alleen een paar dia's tegelijk te bereiden. Dit zal ervoor zorgen NR imaging in verschillende steekproeven constant blijft. De kwaliteit van beelden NR gebeitste vermindert na 6 h. Discrete lipide druppels moeilijk zijn te observeren en achtergrond fluorescentie toeneemt, die interfereert met NR signaal detectie.
6. Beeldvorming van NR gebeitste wormen
   1. Het imago van de wormen bij 5 X vergroting te vangen verschillende dieren per gezichtsveld.
   2. Overschakelen naar 10 X vergroting voor betere kwantificering van individuele wormen.
   3. Gebruikmaken van FITC/GFP channel beeld NR gebeitste wormen en proberen verschillende belichtingstijden te bepalen van de optimale omstandigheden voor kwantificering.
   4. Bestanden opslaan in de TIF-indeling om te voorkomen dat het verlies van gegevens als gevolg van compressie.
      Opmerking: Typische blootstelling tijden variëren van 100-1000 ms. met een optimale belichtingstijd, gebruiken voor alle monsters imaging consistentie wordt gehandhaafd.
7. NR kleuring afbeelding kwantificering
   1. Upload microfoto aan ImageJ. In het pull-down menu van Plugins, door de Bio-formaten-functie te gebruiken als het afbeeldingsbestand niet wordt herkend.
   2. In de afbeelding pull-down menu, onder de stapels-functie, kunt beelden-naar-Stack een afbeeldingsstapel maken wanneer verschillende microfoto worden vergeleken.
   3. Pas helderheid/Contrast van de afbeelding stack in het zelfde pull-down menu, en propageren van wijzigingen in alle afbeeldingen door te klikken op toepassen.
   4. Dienst van het gereedschap Veelhoek af te bakenen elk verbeelde worm en gebruik van de functie onder het analyse pull-down menu te kwantificeren van de intensiteit van de fluorescentie die wordt uitgestoten door NR.
   5. Voor elke afbeelding, meten van de vijf locaties van de achtergrond en de intensiteit van de fluorescentie gemiddelde achtergrond te berekenen.
   6. Aftrekken van de intensiteit van de fluorescentie achtergrond van elk verbeelde worm met de formule N = G - (A x B), waarbij N staat voor netto fluorescentie, G voor bruto fluorescentie, A voor totale worm gebied en B voor gemiddelde achtergrond fluorescentie.
   7. Verdelen om de intensiteit van de fluorescentie normaliseren door de grootte van de worm, van elk worm net fluorescentie door haar totale oppervlakte. De resultaten worden gerapporteerd als intensiteit van de fluorescentie, in willekeurige eenheden (a.u.), per pixel.
      Opmerking: Vermijd het exporteren van afbeeldingen in JPEG-indeling. Terwijl compressie bestanden gemakkelijker te beheren om op te slaan maakt, wordt gegevensintegriteit gecompromitteerd door deze verkoopvorm. Zorg ervoor dat alle afbeeldingen worden bewerkt en geanalyseerd identiek. Vergeet niet om een bar schaal om de grootte in verschillende vergrotingen correct kan bepalen. Om de verschillen in de intensiteit van de fluorescentie met behulp van ImageJ beter te visualiseren, afbeelding schakelaartype van RGB naar 8-bits en selecteer brand in het Afbeeldingsmenu lookup tabellen (LUT). Hierdoor ontstaat een warmte-kaart beeld in welke verhoogde kleur helderheid met verhoogde fluorescentie intensiteit correleert.

2. olie kleuring rode O (ORO) van lipiden

1. Bereiding van de stockoplossing van ORO
   1. In een fles van 250 mL, voeg 500 mg van ORO poeder tot 100 mL voor 100% isopropanol en meng het goed.
   2. Zodra voorbereid, slaan de oplossing strak verzegeld met geen blootstelling aan licht.
2. Voorbereiding van de ORO werkoplossing
   1. Verdun ORO stockoplossing in 60% isopropanol en water (3:2).
   2. Vóór gebruik, de werkoplossing ORO wordt gefiltreerd door een 0,2 µm celluloseacetaat steriele injectiespuit filter.
      Opmerking: Voor de beste oplossing kwaliteit ORO werkoplossing eergisteren voorbereiden, en laat het 's nachts mengen. Echter als oplossing nodig dezelfde dag, verdunnen en mengen van ORO oplossing op een rocker gedurende ten minste 2 uur vóór gebruik. Wikkel voordat schommelen, conische buis in paraffine tape om te voorkomen lekkage van ORO oplossing.
3. Voorbereiding van wormen ORO lipide kleuring
   1. Groeien de wormen bij 20 ° C op de nematode groeimedium (NGM) met laat-log OP50 E. coli naar gewenste leven fase agarvoedingsbodem.
   2. Voeg 1 mL PBST oplossing aan de plaat en swirl totdat alle wormen uit de plaat zijn. Kantelen van de plaat en wassen met 1 mL PBST. Breng de worm een 1,5 mL microfuge buis.
   3. Centrifuge die de wormen bij 560 x g gedurende 1 min. Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder verstoring van de pellet en herhaal het wassen stap met 1 mL PBST driemaal. Verwijder alle supernatant maar 100 µL.
   4. 600 µL van 40% isopropanol toevoegen aan de worm pellet en rock bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
   5. Centrifugeer de wormen op 560 x g voor 30 s en verwijder alle supernatant maar 100 µL zonder de worm pellet te verstoren.
      Opmerking: Gebruik hogere volumes PBST te wassen wormen uit platen als doet high-throughput kleuring. Wormen in PBST meer dan 15 min vóór monster fixatie niet wassen. Doen extra wast als supernatant niet van bacteriën gewist wordt. Incubation in 40% isopropanol met behulp van een nutator of rocker verrichten. Altijd controleren buizen om ervoor te zorgen volledige monster agitatie plaatsvindt.
4. Lipide kleuring met ORO
   1. 600 µL ORO werkoplossing aan elk monster toevoegen. De buis drie keer omkeren en meng de wormen goed in ORO.
   2. Draaien van de monsters bij 30 omwentelingen per minuut gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
   3. Centrifugeer de monsters bij 560 x g gedurende 1 minuut en elimineren alle supernatant maar 100 µL.
   4. Resuspendeer de monsters in 600 µL van PBST en draai de buizen bij 30 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten voor het verwijderen van overtollige ORO vlek.
   5. Centrifugeer steekproeven bij 560 x g gedurende 1 minuut en elimineren alle maar 50 µL van de bovendrijvende substantie.
   6. Om een beter onderscheid de locatie van het dier germline en intestinale cellen, te beitsen kernen door toevoeging van 1 µL van (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-indole-6-carboxamidine) (DAPI) voor elke 1 mL van de werkoplossing ORO. Verrichten ORO kleuring voor 2 h met het toevoegen van de DAPI vóór montage van dia's voor imaging. Intestinale kernen zijn groter in omvang en de gonaden onderscheidt zich door de ontwikkelingslanden geslachtscellen.
      Opmerking: Na ORO kleuring, wormen kunnen houden aan de zijkanten van de microfuge buis en niet een merkbaar pellet vormen. Als dit gebeurt, de wormen nogmaals centrifugeren of toestaan van wormen te regelen door de zwaartekracht voor minstens 10 min.
5. Voorbereiding van de dia's van worm imaging
   1. Resuspendeer de wormen in het resterende supernatant en meng de oplossing goed.
   2. 5 µL van worm schorsing op een microscoopglaasje zetten en plaats een dekglaasje aan zorgvuldig, ervoor te zorgen dat geen lucht belletjes vorm.
   3. Zegel van het dekglaasje aan met nagellak en afbeelding wormen.
      Opmerking: Na vaststelling en kleuring, wormen kunnen worden zeer rigide en moeilijk te Pipetteer. Om te omzeilen dat, wide-boring pipetten te maken door het afsnijden van hun tips.
   4. De dia's opslaan in een micro-centrifuge rek bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur als niet onmiddellijk na de kleuring imaging.
6. Beeldvorming van ORO gebeitste wormen
   1. Gebruik een kleur-compatibele camera naar afbeelding ORO gebeitste worms.
   2. 5 X vergroting gebruiken om het imago van de verschillende wormen in één gezichtsveld.
   3. Overschakelen naar 10 X vergroting voor betere behandeling van individuele wormen.
   4. Afbeeldingen in de TIF-indeling om te voorkomen dat gegevens verloren gaan als gevolg van compressie exporteren.
      Opmerking: Als de kleuring met ORO + DAPI, de kleur-compatibele camera kunnen overschakelen naar één die fluorescentie vangen kan.
7. Beeldanalyse van ORO gebeitste worms
   1. Upload micrograph(s) naar ImageJ. In het pull-down menu van Plugins, door de Bio-formaten-functie te gebruiken als het afbeeldingsbestand niet wordt herkend.
   2. In de afbeelding pull-down menu, onder de stapels-functie, kunt beelden-naar-Stack een afbeeldingsstapel maken wanneer verschillende microfoto worden vergeleken.
   3. Aanpassen Helderheid/Contrast onder het zelfde pull-down menu om de zichtbaarheid van lipide druppels te verbeteren.
   4. De beelden volgens lipide accumulatie in hele lichaam van het dier of in specifieke weefsels te categoriseren.
   5. Voor betere evaluatie van lipide lokalisatie en voor de identificatie van niet-specifieke afbeelding artefacten met behulp van ImageJ, selecteert u de functie van de kleur onder het beeld pull-down menu en klik op Stack naar RGB te tonen van de signalen van elke component RGB.

Resultaten

SKN-1 is een bZip, cytoprotective transcriptiefactor dat homologie deelt met zoogdieren NRF2 en oxidatie van de vetzuren is gebleken. Afhankelijk van de concentratie van glucose in hun dieet Toon worms met een constitutively geactiveerd skn-1 allel verschillende lipidengehalte wanneer gekleurd met Nile rood⁷. Figuur 1A -C toont geactiveerd skn-1 dieren onderhevig zijn aan invloeden die leiden tot een ...

Discussie

De toename van zwaarlijvigheid en stofwisselingsziekte tarieven maakt C. elegans een geschikt model te bestuderen van de mechanismen die vet accumulatie in cellen en weefsels regelen. Recent bewijs suggereert dat de veranderingen in lipide-niveaus zijn gecorreleerd met cellulaire processen variërend van insuline⁸, de activering van hormoon receptoren², tot voortplantingsresultaat⁵signalering. In vergelijking tot label-vrije microscopie en ch...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescentiemicroscoop
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Kleur-capabel
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescentie-capabel
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipide kleurstof
Oil red O	Alfa Aesar	A12989	Lipide kleurstof
DAPI	Thermo Fisher	D1306	DNA kleurstof
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixeeroplossing
0.2 µm seterile spuitfilter	VWR	28145-477	Cellulose acetaat filter
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Shaker Rotisserie	Lab Quake	400110Q	Shaker
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator
K2HPO4	Sigma-Aldrich	7758-11-4	NGM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	7778-77-0	NGM
MgSO4	Alfa Aesar	7786-30-3	NGM
CaCl2	Sigma-Aldrich	10035-04-8	NGM
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5	NGM
Cholesterol	Sigma-Aldrich	57-88-5	NGM
Peptone	BD Biosciences	211677	NGM
Agar	Teknova	L9110	NGM
LB media	Sigma-Aldrich	L3147	Bacteriegroei