Methodenartikel

Bijhouden van Drosophila larvale gedrag in reactie op de stimulatie van de Optogenetic van olfactorische neuronen

7.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57353

⸱

21 maart 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, MS-0314, University of Nevada, 2Integrated Neuroscience Graduate Program, University of Nevada

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol analyseert navigatie gedrag van Drosophila larve in reactie op de stimulatie van de gelijktijdige optogenetic van haar olfactorische neuronen. Licht van 630 nm golflengte wordt gebruikt voor het activeren van individuele olfactorische neuronen uitdrukken van een rood-verschoven kanaal rodopsine. Larvale verkeer gelijktijdig wordt bijgehouden, digitaal opgenomen en geanalyseerd met behulp van aangepaste-geschreven software.

Samenvatting

Het vermogen van insecten om te navigeren naar de bronnen van de geur is gebaseerd op de activiteiten van hun eerste-orde olfactorische receptor neuronen (ORNs). Terwijl een aanzienlijke hoeveelheid informatie is gegenereerd met betrekking tot ORN reacties op reukstoffen, blijft de rol van specifieke ORNs in gedrags reacties rijden slecht begrepen. Complicaties bij gedrag analyse ontstaan als gevolg van verschillende volatiliteit van odorant die activeren van individuele ORNs, meerdere ORNs geactiveerd door één reukstoffen, evenals de moeilijkheid bij het repliceren van natuurlijk waargenomen temporele variaties in olfactorische stimuli gebruiken conventionele geur-leveringsmethoden in het laboratorium. Hier beschrijven we een protocol dat Drosophila larvale gedrag in reactie op de stimulatie van de gelijktijdige optogenetic van haar ORNs analyseert. De hier gebruikte optogenetic-technologie zorgt voor specificiteit van ORN activering en nauwkeurige controle van temporele patronen van ORN activering. Overeenkomstige larvale beweging wordt bijgehouden, digitaal opgenomen en geanalyseerd met behulp van aangepaste software geschreven. Door vervanging van geur stimuli met lichte prikkels, voorziet deze methode een meer nauwkeurige controle van individuele ORN-activering om het effect ervan op de larvale gedrag te bestuderen. Onze methode kan verder worden uitgebreid om te bestuderen van de gevolgen van de tweede orde projectie neuronen (PNs) evenals lokale neuronen (LNs) op larvale gedrag. Deze methode zal dus een uitgebreide dissectie van olfactorische circuit functie inschakelen en aanvulling studies over hoe olfactorische neuron activiteiten vertalen naar gedrag reacties.

Inleiding

Olfactorische informatie in de omgeving van de larve van een Drosophila is gevoeld door slechts 21 functioneel verschillende ORNs, de activiteiten van die bepaalt uiteindelijk larvale gedrag1,,2,,3,4. Nog, is relatief weinig bekend over de logica die door die sensorische informatie is gecodeerd in de activiteiten van deze 21 ORNs. Er is dus behoefte aan de functionele bijdragen van elke larvale ORN gedrag experimenteel te meten.

Hoewel de zintuiglijke reactie-Profiel van het hele repertoire van Drosophila larvale ORNs is onderzocht in detail1,4,5, de bijdragen van individuele ORNs tot de olfactorische circuit en aldus te navigatie probleem blijven grotendeels onbekend. In de studie van de larvale gedrag, tot nu toe moeilijkheden als gevolg van het onvermogen om te activeren door het ruimtelijk en stoffelijk van één ORNs. Een panel van odorant die specifiek 19 van de 21 Drosophila larvale ORNs activeren werd recent beschreven1. Elke odorant in het deelvenster, in lage concentraties, lokt een fysiologische reactie alleen van haar cognaat ORN. Echter, bij hogere concentraties die normaal gesproken worden gebruikt voor conventionele gedrag testen, lokt elk odorant fysiologische reacties van meerdere ORNs1,5,6. Verder hebben odorant in dit deelvenster gevarieerd volatiliteiten die interpretatie van gedrag studies die afhangen van de vorming van stabiele geur verlopen7,8te bemoeilijken. Ten slotte, natuurlijk voorkomende geur prikkels hebben een temporele component die is moeilijk te repliceren onder laboratoriumomstandigheden. Daarom is het belangrijk om te ontwikkelen van een methode die larvale gedrag terwijl gelijktijdig het activeren van individuele ORNs in een ruimtelijke en temporele wijze kan meten.

Wij tonen hier, een methode die voordelen ten opzichte van de eerder beschreven larvale tracking heeft testen1,8. De bepaling van de tracking beschreven in Gershow et al. gebruikt elektronisch gestuurde kleppen te handhaven van een stabiel verloop van geur in de gedrag arena8. Echter, als gevolg van het niveau van complexe engineering betrokken te bouwen de geur stimulans setup, deze methode is moeilijk te repliceren in andere laboratoria. Verder, de kwesties met betrekking tot het gebruik van odorant specifiek het activeren van één ORNs onopgelost blijven. De bepaling van de tracking beschreven in Mathew et al. een eenvoudigere geur leveringssysteem gebruikt, maar de resulterende geur verloop is afhankelijk van de volatiliteit van de test odorant en is instabiel voor lange duur van de test1. Dus, door vervanging van geur stimuli met lichte prikkels, onze methode kent de voordelen van specificiteit en nauwkeurige temporele controle van ORN activering en is niet afhankelijk van de vorming van geur gradiënten van verschillende weerstandsniveau's.

Onze methode is gemakkelijk aan opstelling en is geschikt voor onderzoekers kochten meten van aspecten van Drosophila larvale navigatie. Deze techniek kan worden aangepast aan andere modelsystemen, mits de onderzoeker in staat om te rijden de expressie van CsChrimson in hun favoriete systeem neuron(s) van keuze is. CsChrimson is een rood-verschoven versie van kanaal rodopsine. Het is geactiveerd bij golflengten die onzichtbaar voor de larve van phototaxis systeem zijn. Daarom zijn wij kundig voor het manipuleren van de activiteit van neuronen met specificiteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid9. Door aanpassing van de maat geschreven software ter verantwoording voor formaatwijzigingen van de onderwerpen, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast voor kruipen larven van andere insecten soorten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. opbouw van een gedrag Arena en het voorbereiden van de Hardware om de stimulatie van de Optogenetic in de Arena gedrag

  1. Bouwen om te bouwen van een licht-beroofd gedrag arena, een doos met een dimensie van 89 x 61 x 66 cm3 (35" L x 24-inch W x 26" H) gemaakt van zwart gekleurde plexiglas acrylplaten (3 mm dik) (Zie Tabel van materialen). Materialen om te bouwen van een dergelijke doos moet beschikbaar zijn op lokale bouwmarkten. Plaats dit vak op een tafelblad in de kamer gedrag(Figuur 1).
  2. Mount een monochroom USB 3.0 CCD camera met een IR-long pass 830 nm-filter en een 8 mm F1.4 C-mount lens uitgerust (Zie Tabel van materialen) naar het midden van het plafond van de zwarte doos. Plaats twee infrarode LED strips (Zie Tabel van materialen) op het tafelblad om het verlichten van de larven in de donkere arena(Figuur 1).
  3. Om te bouwen van de LED-platform, een 22 cm × 22 cm vierkante aluminiumplaat (bij voorkeur gespoten met een mat zwarte afwerking te elimineren alle reflecties) te verkrijgen. In het midden van de plaat, met behulp van een metalen cutter, een gat dat is groot genoeg om te passen rond de CCD-camera.
  4. De metalen afdekplaat met rode LED strip verlichting (Zie Tabel van materialen). Soldeer LED light strip draden in serie en voeden van de draden van de strip in een optocoupler relay bestuurd door de microprocessor van een Raspberry Pi 2B (Zie Tabel van materialen) (Figuur 1B en 2).
  5. Installeren en configureren van Ubuntu stuurman/Raspian Jesse/Linux gebaseerd besturingssysteem op de processor van de Raspberry Pi voordat u de estafette optocoupler aansluit op de LED strips. Hechten van een power supply voor het aandrijven van de LED strips en de optocoupler (Figuur 2) (Zie Tabel van materialen). Het monteren van de LED-platform rond de CCD-camera (Figuur 1B).
    Opmerking: Besturingssysteem van Ubuntu Mate v16.04 is vrij beschikbaar. Een aantal eenvoudige commando's van de Python gebaseerd kan gemakkelijk aangepast worden aan programma patronen van LED licht stimuli (Zie bestand van syntaxis).
  6. Zorgen voor homogene bestralingssterkte op verschillende punten in de arena van gedrag. De absolute bestralingssterkte op het oppervlak van de arena met de hulp van een Spectrometer meet en bepalen het ~1.3 W/m2 in het oppervlak van de arena.
    Opmerking: Bij deze intensiteit, geen significante veranderingen werden waargenomen in temperatuur in de loop van de experimenten. Een andere studie10 gebruikt een hogere bestralingssterkte van ~1.9 W/m2 en geen veranderingen in temperatuur waargenomen in de loop van de experimenten.

2. voorbereiding van Drosophila larven gedrag Analyses

  1. Handhaven van de vliegen op standaard vliegen voedsel (Zie Tabel van materialen) bij 25 ° C, 50-60% RH en een 12/12 uur licht/donker cyclus.
  2. Om uit te drukken van CsChrimson in een paar van ORNs, kruis Maagd vrouwtjes uit een UAS-IVS-CsChrimson -lijn voor mannetjes van een OrX-Gal4 -lijn ('X' correspondeert met een van de 21 larvale geur-receptor (of) genen die uniek worden uitgedrukt in elk van 21 paren ORNs)9,11.
    1. Afwisselend, om uit te drukken CsChrimson in alle 21 larvale ORNs, cross Maagd vrouwtjes uit een UAS-IVS-CsChrimson lijn aan mannetjes uit een Orco-Gal4 -lijn ('Orco' is de co-receptor die wordt uitgedrukt in alle 21 ORNs).
    2. Gebruik UAS-IVS-CsChrimson lijn door zelf als een besturingselement in deze experimenten.
      Opmerking: De vliegen bestanden hier vermeld worden alle beschikbare op de Bloomington Drosophila voorraad Center (Zie Tabel van materialen).
  3. Zodra de mannelijke en vrouwelijke vliegen in een kruis zijn toegestaan om te paren en leggen eieren voor 48 h, overbrengen in volwassenen een frisse flacon.
    1. Aan de oppervlakte van de voedsel-flacon met eieren, Voeg 400 µL van een mengsel met 400 µM all-trans retinal (ATR) opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO) en 89 mM sacharose opgelost in gedestilleerd water.
      Opmerking: De kleine hoeveelheid sacharose bevordert larvale voederen van de ATR-oplossing. ATR is een cofactor vereist voor upregulating van CsChrimson expressie9,10. ATR is lichtgevoelig.
    2. Zodra ATR wordt toegevoegd aan de flesjes van de levensmiddelen die eieren bevatten, Incubeer de flesjes in het donker voor een extra 72 h.
      Opmerking: Terwijl deze studie en de bovenstaande twee studies niet effecten op het larvale gedrag als gevolg van ATR voeden waargenomen hebben, is het aanbevolen beheersen om de gevolgen van ATR voeden door lijnen van de test te onderwerpen aan dezelfde hoeveelheid het bovenstaande mengsel die geen ATR bevat.
  4. Uittreksel derde-instar-larven (~ 120 h na het leggen van eieren) van het oppervlak van vliegen voedsel door drijvend ze met behulp van een sacharoseoplossing hoge dichtheid (15%). Het gebruik van een P1000 micropipet naast de larven drijven op het oppervlak van de sacharoseoplossing in een bekerglas van 1000 mL glas.
  5. Wassen larven 3-4 keer door 800 mL vers gedestilleerd water in het glas bekerglas telkens uit te wisselen. Toestaan dat larven 10 min rusten alvorens hen te onderwerpen aan de bepaling van het gedrag.

3. gedrag Assay

  1. Consistente temperatuur (tussen 22 – 25 ° C) en luchtvochtigheid (tussen 50 en 60% relatieve vochtigheid) op de kamer gedrag.
  2. Bereiden larvale kruipende medium door gieten 150 mL gesmolten agarose (1,5%) naar een 22 x 22 cm vierkant petrischaal. Een petrischaal wordt gegoten voor elk afzonderlijk experiment voor de bepaling, 8 – 10 proeven per experiment. Toestaan agarose om te stollen en cool voor 1-2 h in de petrischaaltjes voordat u ze gebruikt in de analyse van gedrag.
    1. Overdracht van niet meer dan 20 van de geprepareerde derde-instar-larven naar het centrum van petrischaal (Figuur 1C). Dekking van de petrischaal met het deksel. Plaats de petrischaal in de arena gedrag onder de CCD-camera.
      Opmerking: Afhankelijk van het experiment, gedrag testen worden meestal uitgevoerd voor 3-5 min. Als er een odorant aan begeleiding aanwijzingen geven in de bepaling wordt gebruikt, heeft men opgemerkt dat het resulterende verloop van de geur stabiel voor ongeveer 5 min1 blijft. Langere assay tijden worden niet aanbevolen. Schadelijke effecten op de larven als gevolg van uitdroging of langdurige 630 nm rood-licht blootstelling zijn niet waargenomen binnen deze tijd punten.
  3. Turn ON the 850 nm infrarood LED lichtbron te visualiseren larven in de video. Start de CCD camera als u wilt opnemen van larvale beweging.
  4. Met behulp van de software gekoppeld aan de processor van de Raspberry Pi, wordt de procedure voor het beheer van passende patronen van rood licht stimulatie.
    Opmerking: Een aantal eenvoudige Python gebaseerd commando's kunnen gemakkelijk aan te passen om programma patronen van LED licht stimuli (Zie bestand van syntaxis).

4. verwerking van de gegevens en analyse

  1. De opgenomen video voor elk afzonderlijk experiment in elke beschikbare programmeersoftware zoals Matlab importeren.
  2. Het verkrijgen van XY-coördinaten van elke larve in een film als een functie van de tijd. Op basis van de grenzen van de opsporingssoftware, kunnen 15 – 20 derde-instar-larven worden bijgehouden in een enkele film1,8.
    Opmerking: Een aantal eenvoudige Matlab codes ('Tracklarva') dat kan gemakkelijk aangepast aan passende omstandigheden worden (Zie bestand van syntaxis) worden verstrekt. Dit programma combineert alle proeven in een experiment en de XY-coördinaten van elke larve uitgangen voor de gehele duur van de test (zie code volgens onderstaande syntaxis). Afwisselend, kan men gebruik maken van verschillende open source programma's die vrij beschikbaar voor onderzoekers zijn. Bv JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.
  3. Gebruik de gegenereerde XY-coördinaten plot larvale trajecten en larvale motoriek verder te analyseren.
    1. Voor gedrag analyses, kunt navigatie statistieken zoals snelheid, pad kromming, rubriek hoek, segmenteren individuele larvale trajecten in afwisselend sequenties van loopt en bochten.
    2. Punten worden gedefinieerd als ononderbroken periodes van voorwaartse beweging. Bochten scheiden opeenvolgende punten. Bochten worden gemarkeerd wanneer wijzigingen in traject richting hoeken waren > 45° (Zie bestand van syntaxis).
  4. Berekenen gemiddelde waarden voor stormloop snelheid, lengte, lopen richting en andere parameters worden uitgevoerd zoals vereist.
    Opmerking: Een aantal eenvoudige syntaxis voor het uittreksel 'loopt' en 'stopt' van larvale trajecten worden verstrekt (Zie bestand van syntaxis). Eenvoudige Matlab of Excel gebaseerde functies kunnen worden toegepast op de opgehaalde gegevens te berekenen van waarden voor 'stormloop speed', 'run lengte' enz.
  5. Gegevens voor elke gedrags-metric vertegenwoordigen zoals bedoel ± SEM.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om aan te tonen van de specificiteit van ORN activering, werd onze methode succesvol toegepast om te bepalen van het effect van twee verschillende ORN (ORN::7a & ORN::42a) (ORNs uiting van Or7a of Or42a) activering op larvale gedrag (Figuur 3). Overeenstemming met de recente studies dat individuele larvale ORNs zijn functioneel verschillende1,10,13, onze representati...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We beschreven hier, een methode die het mogelijk voor de meting van Drosophila larvale gedrag in reactie op de activering van de gelijktijdige optogenetic van olfactorische neuronen maakt. Eerder beschreven larvale bijhouden methoden1,8 verschillende geur levering technologie gebruiken om te activeren ORNs. Echter controle geen over deze methodes voor zowel de specificiteit of temporele patronen van ORN activering. Onze methode overwint deze tekorten met...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door opstarten middelen uit de University of Nevada in Reno en NIGMS van het National Institute of Health onder grant nummer P20 GM103650.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Video camera om larvale beweging vast te leggen
CCD Camera Edmund Optics106215
M52 naar M55 FilterdraadadapterEdmund Optics59-446
2" Vierkante draadfilterhouder voor beeldvormingslenzen Edmund Optics59-445
RG-715, 2" Vierkante LongpassfilterEdmund Optics46-066
Elektronica voor optogenetische opstelling
Raspberry Pi 2BRASPBERRY-PI.orgRPI2-MODB-V1.2
3-kanaals programmeerbare voedingnewegg.com9SIA3C62037092
8-kanaals optokoppelrelaisamazon.com6454319
630nm Quad-rij LED-stripverlichtingenvironmentallights.comred3528-450-reel
850nm LED-stripsenvironmentallights.comwp-4000K-CC5050-60x2-kit
Software 
MatlabMathworks Inc.
Ubuntu MATE v16.04Nubuntuhttps://github.com/yslo/nubuntu
Andere items
Plexiglas zwart acrylHome DepotMC1184848bl
Vliegvoer en andere reagentia
Nutrifly vliegvoerGenesee Scientific66-112
Agarose poederGenesee Scientific20-102
22cm X 22cm vierkante petrischaalVWR Inc.25382-327
DMSOSigma-AldrichD2650
SucroseSigma-Aldrich84097
All trans-retinaalSigma-AldrichR2500
Vliegen
UAS-IVS-CsChrimson Bloomington Drosophila Stock Center55134
Orco-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center26818
Or42a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center9970
Or7a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center23907

Referenties

  1. Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
  2. Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
  3. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
  4. Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
  5. Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
  6. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
  7. Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
  8. Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
  9. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
  10. Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
  11. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  12. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
  13. Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
  14. Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
  15. Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
  16. Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
  17. Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Functie van het olfactorische circuitrun lengthanalyseCsChrimson expressieinfrarood LED arenaagarose kruipmediumderde instarslarvenanalyse met aangepaste software

Gerelateerde artikelen