Methodenartikel

Een eenvoudige Stroom Cytometry gebaseerd Assay om te bepalen In Vitro antilichaam afhankelijk verbetering van Dengue Virus met behulp van de herstellende Serum Zika-Virus

DOI:

10.3791/57371

⸱

10 april 2018

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, Uniformed Services University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beschrijven we een eenvoudig en gemakkelijk protocol voor het meten van antilichaam afhankelijk verbetering van infectie door Zika virus herstellende serum met Dengue virus verslaggever virale deeltjes.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antilichaam afhankelijk verhoging van de infectie is aangetoond dat een belangrijke rol spelen in Dengue virale pathogenese. Traditionele tests die meten van de capaciteit van antilichamen of serum om infectie in ontoelaatbaar cellijnen hebben vertrouwd op met behulp van virale uitvoer in de media gevolgd door plaque testen te kwantificeren van de infectie. Meer recentelijk hebben deze gehaltebepalingen Dengue virus (DENV) infectie in de cellijnen met behulp van fluorescently gelabelde antilichamen onderzocht. Deze beide benaderingen hebben beperkingen die het wijdverspreide gebruik van deze technieken beperken. Hier beschrijven we een eenvoudige in vitro -assay met Dengue virus verslaggever virale deeltjes (RVP) die uitdrukking geven aan groen fluorescent proteïne en K562 cellen te onderzoeken van antilichaam afhankelijk verbetering (ADE) van DENV-infectie met behulp van serum dat werd verkregen van rhesus Makaken 16 weken na infectie met Zika-virus (ZIKV). Deze techniek is betrouwbaar, minimale manipulatie van cellen gaat, gaat niet over het gebruik van live replicatie bevoegde virus en kan worden uitgevoerd in een hoge doorvoersnelheid formaat om een kwantitatieve uitlezing met behulp van stroom cytometry. Bovendien, kan deze bepaling gemakkelijk aangepast worden onderzoeken antilichaam afhankelijk verbetering (ADE) van andere flavivirus infecties zoals gele koorts-virus (YFV), Japanse Equine encefalitis virus (JEEV), West-Nijlvirus (WNV) etc. waar RVP beschikbaar zijn. Het gemak van het opzetten van de bepaling, de gegevens analyseren en interpreteren van de resultaten maakt het zeer vatbaar is voor de meeste instellingen van het laboratorium.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antilichaam afhankelijk verhoging (ADE) van de infecties is een proces waarbij gedeeltelijk cross-reactive antilichaam reacties veroorzaakt door een serotype van het virus verbetert de opname van een ander serotype van het virus, wat leidt tot meer virale replicatie en voorjaarsviremie. ADE is uitgebreid gedocumenteerd in Dengue virus (DENV) infecties waar vier belangrijke serotypen heersen. ADE is een subset van patiënten, gekoppeld aan Dengue hemorragische koorts (DHF). We hebben onlangs aangetoond dat Zika virus (ZIKV) infectie veroorzaakt aanzienlijk hoge niveaus van DENV cross-reactive antilichaam reacties die veroorzaakt ADE van DENV in vitro en waarschijnlijk bijgedragen aan de verhoging van de DENV voorjaarsviremie in vivo1 , 2. antilichaam-afhankelijke versterking testen zijn een waardevol instrument voor de beoordeling van de capaciteit van antilichamen te versterken van secundaire infectie met verwante virussen en bieden waardevolle inzichten in de pathogenese van flavivirus infecties en informeren de ontwikkeling van vaccins.

De assay beschreven gebruikt hier DENV RVP samen met K562 cellen, die normaliter ontoelaatbaar om infectie zijn. RVP zijn structureel intact replicatie incompetent DENV virale deeltjes die coderen van een sub-genomic groen fluorescente proteïne (GFP) replicon die na een ronde van replicatie3wordt uitgedrukt. Als zodanig, cellen die geïnfecteerd raken met RVP lichten groen op en kunnen gemakkelijk worden opgespoord met behulp van stroom cytometry of microscopie. De RVP gebruikt in deze test werden verkregen uit commerciële bronnen. Ze kunnen echter tegen andere virussen gegenereerd en gebruikt in de test die wordt beschreven in dit manuscript. K562 cellen zijn ondertussen een FcγIII-receptor-uiting geven aan leukemie cellijn die binden aan de Fc-regio van antilichamen en in het bijzijn van de concentraties van antilichaam4,5sub te neutraliseren besmet raken.

ADE testen zijn uitgebreid gebruikt in studies die onderzoeken de risicofactoren voor ernstige dengue en af te bakenen de mechanismen van in vitro ADE6,7,8. De bepaling van de ADE beschreven hier snel en eenvoudig inzetbaar om te bepalen van de capaciteit van het serum te versterken in vitro infectie met behulp van de RVP en stroom cytometry, in vergelijking met andere testen momenteel gebruikt waarvoor hetzij de bepaling van de vorming van tandplak eenheden (FPU) in Vero-cellen of het antilichaam kleuring van geïnfecteerde cellen6,7,8,9,10,11, die beide tijdrovend en arbeid zijn intensieve.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De serummonsters gebruikt om aan te tonen van het protocol die hier beschreven werden verkregen rhesus makaken die gehuisvest en verzorgd volgens lokale, staat en federale beleid in een vereniging voor de beoordeling en de accreditatie van Laboratory Animal Care waren International (AAALAC)-geaccrediteerde faciliteit. Alle dierproeven zijn gecontroleerd en goedgekeurd door institutionele Animal Care en gebruik Comité en monsters werden verworven door middel van een weefsel protocol voor het delen.

1. dag 1

Opmerking: Alle hieronder beschreven in een steriele laminaire flow bioveiligheid kabinet gebruikt voor weefselkweek in het laboratorium van een BSL-2 stappen uitgevoerd.

  1. Ontdooi de serummonsters bij kamertemperatuur en breng 100 µL van elke serummonster aan een steriele buis. Warmte inactivering gedurende 30 minuten op 56° C in een waterbad of een temperatuur-verstelbare thermomixer. Maken 10-fold seriële verdunningen van het serummonster variërend van 1:1 tot 1:1,000 met behulp van koude RPMI-10 (RPMI met 10% foetale runderserum).
  2. Breng 10 µL van serieel verdunde serummonster aan elk putje van een steriele 96-Wells-V-bodemplaat. Twee reeksen controleputjes, RPMI-10 met RVP bevatten alleen en zonder serummonster, en RPMI-10 alleen zonder RVP en zonder serummonster. Elke serummonster en RPMI-10 controles in triplicates instellen.
  3. Verwijderen van de Dengue-1, 2, 3 en 4 RVP uit de diepvries-80 ° C en de dooi hen in een waterbad 37 ° C. Overdracht van de ontdooide RVP onmiddellijk aan het ijs. Verkrijgen van ongeveer 170 µL RVP voor elke serummonster (10 µL van RVP x 3 putten voor elke serumverdunning (1:1, 1:10, 1:100, 1:1, 000) en 10 µL van RVP x 3 putten voor elk van de RPMI-10 met RVP controle alleen wells).
  4. Pipetteer 10 µL van RVP in elk van de 96-Wells V-bodemplaat met het serummonster en met de RPMI-10 met de RVP (geen serum)-controleputjes. Voeg geen RVP aan de RPMI-10 alleen (geen serummonster en geen RVP) wells. Meng grondig door omhoog en omlaag pipetteren 5 tot 10 keer. Voeg 10 µL koude RPMI-10 in plaats van de RVP aan elke koude RPMI-10 slechts (geen serummonster en geen RVP) controle putten.
  5. De 96-Wells-V-bodemplaat overbrengen in een incubator en de plaat Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in de aanwezigheid van 5% CO2. Terwijl de 96-Wells-V-bodemplaat is aan het broeden, het reinigen van het oppervlak van het biosafety kabinet met 70% ethanol en uitvoeren van het UV-licht gedurende 15 minuten.
  6. Een volledig confluente T75 kolf van K562 cellen verwijderen uit de incubator, meng de cellen goed met behulp van een steriele 5 mL-pipet en 5 mL van cellen overbrengen in een steriele 15 mL conische buis.
    Opmerking: De K562 cellen zijn onderhouden in RPMI-10 en overgeënt op 1 x 106/mL.
  7. Het aantal cellen tellen 10 µL cellen verwijderen uit de conische buis van steriele 15 mL en meng met 10 µL tryphan blauw. Met behulp van een hemocytometer om te bepalen van het totale aantal cellen in de conische tube van 15 mL cellen tellen.
  8. De 15 mL kegelvormig met cellen bij ~ 1.200 x g gedurende 10 minuten centrifugeren, decanteren van het supernatant en resuspendeer de cellen in de warme RPMI-10 bij een concentratie van 80.000 cellen/30 µL van media (2,66 x 106 cellen /mL).
  9. De 96-Wells-V-bodemplaat verwijderen uit de incubator (stap 1.6), breng 30 µL van K562 cellen aan elk putje van de 96-Wells-V-bodemplaat en meng door omhoog en omlaag pipetteren 5 tot 10 keer. De 96-Wells-V-bodemplaat overbrengen in een incubator en de plaat Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in de aanwezigheid van 5% CO2.
  10. Na incubatie gedurende 1 uur, door de 96-Wells-V-bodemplaat van de incubator en centrifuge op ~ 1.200 x g gedurende 5 minuten te verwijderen. Na het centrifugeren, decanteren in de media van de putten door te draaien aan de plaat ondersteboven in een container met 10% bleekwater.
  11. Wassen van de cellen in elk putje door resuspending hen in 125 µL van warme RPMI-10, meng met een pipet en centrifugeer de plaat bij ~ 1.200 x g gedurende 5 min. Decant de media door te draaien aan de plaat ondersteboven in een container met 10% bleekwater. Herhaal deze stap was twee keer.
  12. Na het wassen, voeg 100 µL van warme RPMI-10 tot elk meng goed, omhoog en omlaag met de pipet en Incubeer de plaat gedurende 48 uur bij 37 ° C in de aanwezigheid van 5% CO2.

2. dag 3

  1. Verwijderen van de 96-Wells V-bodemplaat met 100 µL van cellen en media/putje van de incubator en verplaats het naar een kabinet bioveiligheid. Met behulp van een meerkanaalspipet, mix de inhoud van elk goed en overdracht van de cellen en media op een 96 goed U-bodem plaat of aan het label vooraf polypropyleen buizen van 5 mL.
  2. Spoel na elk putje in de 96-Wells V-bodemplaat met 100 µL van 1% Paraformaldehyde (PFA) in 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en overdracht aan de respectieve putjes in de 96 goed U-bodemplaat of gelabelde 5 mL polypropyleen buizen uit stap 2.1 opleveren een definitieve concentratie van 0,5% PFA/putje of buis. Meng grondig met behulp van een meerkanaalspipet, de afdekplaat met aluminiumfolie en laat het zitten in de incubator voor 30 minuten om te lossen van de cellen.
  3. De stroom cytometer bereiden (Zie Tabel van materialen bijvoorbeeld) door onbevlekt K562 cellen als u wilt kalibreren van de kant en de voorwaartse scatter samen met de fluorescentie-instellingen uit te voeren. Het enige fluorescentie-kanaal vereist is FL1, zoals GFP de enige fluorescentie uitgestoten uit de cellen is. Verwerven van ~ 30, 000-50.000 cellen van elk monster.
    Opmerking: Elke staat van het lezen van een enkele fluorescentie stroom-cytometer kan worden gebruikt voor het verkrijgen van de gegevens, zoals cellen geïnfecteerd met RVP zal alleen groene fluorescentie als gevolg van de aanwezigheid van GFP uitstoten, en geen andere fluorescentie-kanaal nodig zijn.

3. de gegevensanalyse

  1. Verkregen op de cytometer van de stroom met behulp van een software van de analyse van de cytometry van de stroom gegevens analyseren (zie tabel van materialen).
    1. Set de eerste poort gebaseerd op FSC-A (forward scatter-gebied) vs FSC-H (forward scatter-hoogte) aan afzonderlijke cellen te nemen en exclusief auto-belichting fluorescerende paren van analyse12. Vervolgens gate singlet-gated cellen op basis van SSC-A (kant scatter-gebied) vs FSC-A uit te sluiten van het puin van een autofluorescent.
    2. Analyseren van SSC-A vs FSC-A gated cellen voor de expressie van GFP gebaseerd op WS-A vs GFP-A. Bepaal het percentage GFP + cellen voor elke verdunning van het serum en controle monsters door een hek rond GFP + cellen.
  2. Bepaal het gemiddelde percentage van GFP + cellen voor elk serum monsterverdunning en controleputjes door het verdelen van het totale percentage aan GFP + cellen in de drievoudige putten door 3.
  3. Berekenen vouw-verbetering van infectie door te delen het gemiddelde percentage van GFP + cellen in het serummonsters voor elke verdunning gedeeld door het gemiddelde percentage van GFP + cellen in de RPMI-10 met de RVP (geen serummonster)-controleputjes.
  4. Grafiek vouw-toebehoren (y-as) versus verdunning (x-as), en het uitvoeren van statistische analyse met ANOVA gevolgd door de Tukey post hoc test voor meerdere vergelijkingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sera van 4 rhesus makaken waren verzameld 16 weken na infectie met ZIKV en getest op hun potentieel om te verbeteren DENV-1, 2, 3 en 4 infecties in K562 cellen. De dieren had piek voorjaarsviremie van ~ 1 x 105 exemplaren ZIKV RNA/ml plasma door dag 3 na infectie die gedaald tot een niveau dat onder de limiet van detectie door 7 dagen na infectie. Geen voorjaarsviremie werd ontdekt in het plasma op 16 weken na infectie. Vervolgens de RVP assay werd uitgevoerd en de verzamelde g...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Flavivirussen zoals DENV en ZIKV delen significante aanwijzingen dat de homologie in beide hun structurele en niet-structurele eiwitten die het genereren van antilichamen die met elkaar13,14 cross-react. Deze antwoorden cross-reactive antilichaam is aangetoond dat het verbeteren van besmetting zowel in vivo en in vitro met een heteroloog serotype of een andere gerelateerde flavivirussen1,2

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beschreven project werd gesteund door fondsen van de Uniformed Services University van de gezondheidswetenschappen aan JJM. De adviezen of beweringen hierin zijn de privé van de auteurs en zijn niet te worden opgevat als officiële of reflecterende de standpunten van het Department of Defense, de Uniformed Services University van de Health Sciences of enige andere instantie van de VS Regering.

WGV alle experimenten uitgevoerd en analyseren van de gegevens; JJM ontworpen en begeleid de studie; WGW en JJM schreef het papier.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DENV 1-4 RVPIntegral MolecularRVP-501
K562 cellenATCCCCL-243
RPMICorning10-040-CV
FBSGE lifesceincesSH 30910.0310% FBS in RPMI-10
Penicillin-StreptomycinMP biomedicals1670049100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10
HEPESCellegro25-060-Cl0.025M in RPMI-10
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×)SigmaM71451x in RPMI-10
NatriumpyruvaatCellegro25-000-Cl1mM in RPMI-10
L-glutamineFisher ScientificMT25005CI 
Steriele V-bodemplatenThomas Scientific333-8001-01V
BD Falcon Polypropyleen 5 ml FACS buizenVWR60819-728
Niet-steriele U-bodemplatenFalconRef 353910Een high throughput alternatief voor FACS buizen
5mL, steriele, serologische pipetDenvilleP7127
200uL steriele pipettipsDenvilleP3020 CPS
20uL steriele pipettipsDenvilleP1121
50-200uL multikanaals pipetDenvilleP3975-8-B
5-50uL multikanaals pipetDenvilleP3975-9-B
20% formaldehydeTousimis #1008B
WaterbadThermoFisherTSCOL35
thermomixerEppendorf2231000387Een alternatief voor een waterbad voor hitte-inactivatie
CO2 IncubatorThermoFisher13-998-213
EthanolSigma AldrichE7023
Vloeibare bleekFisher ScientificNC9724348
Flowjo 9.8TreeStar, Inc.Flow cytometrie analyse software
BD FACSDiva 6.1.2Becton Dikinson
BD LSR II flow cytometerBecton Dikinson
Vloeibare bleekFisher ScientificNC9724348

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498(2017).
  2. Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
  3. Mattia, K., et al. Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes. PLoS One. 6 (11), e27252(2011).
  4. Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).
  5. Klein, E., et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).
  6. Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).
  7. Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).
  8. Wang, T. T., et al. IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity. Science. 355 (6323), 395-398 (2017).
  9. Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
  10. Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro. J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).
  11. Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).
  12. Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
  13. Priyamvada, L., et al. B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts. J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).
  14. Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Reporter virusdeeltjesK562 cellenZika virusserumseri le verdunningGFP expressiehigh throughput assayflavivirusinfectie

Gerelateerde artikelen