Methodenartikel

High Throughput SiRNA Screening voor chloorpikrine en waterstoffluoride-geïnduceerde hoornvlies epitheliale cel letsel

DOI:

10.3791/57372

⸱

16 juni 2018

 ,  ,  , 
1US Army Medical Research Institute of Chemical Defense

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoge-doorvoer kleine remmende RNA screening is een belangrijk instrument die helpen kan sneller het ophelderen van de moleculaire mechanismen van chemische hoornvlies epitheliale letsel. Hierin presenteren wij de ontwikkeling en validatie van blootstelling modellen en methoden mbt de hoge doorvoer screening van waterstoffluoride en chloorpikrine-geïnduceerde hoornvlies epitheliale letsel.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oogbeschadigingen en/of letsel veroorzaken-geïnduceerde is een ware oogbeschadigingen en/of noodsituatie omdat chemicaliën de potentie hebben om snel belangrijke weefselschade toebrengen. Behandelingen voor hoornvlies letsel veroorzaken-geïnduceerde zijn over het algemeen ondersteunende omdat niet geen specifieke therapeutische middelen beschikken voor de behandeling van deze letsels. In de inspanningen voor de ontwikkeling van behandelingen en therapeutics zorg voor blootstelling, kan het belangrijk om te begrijpen van de moleculaire en cellulaire mechanismen van deze verwondingen. Wij stellen voor dat gebruik van hoge-doorvoer kleine remmende RNA (siRNA) screening kan een belangrijke tool die bijdragen kan aan het sneller het ophelderen van de moleculaire mechanismen van chemische hoornvlies epitheliale letsel. siRNA zijn dubbele gestrande RNA molecules die 19-25 nucleotiden lang zijn en gebruik maken van het post-transcriptional gen silencing traject om te degraderen van mRNA die homologie aan siRNA hebben. De daaruit voortvloeiende vermindering van de expressie van de specifiek gen kan vervolgens worden bestudeerd in toxische blootgestelde cellen om na te gaan van de functie van dat gen in de cellulaire reactie op de veroorzaken. De ontwikkeling en validering van in vitro blootstelling modellen en methoden mbt de hoge throughput screening (HTS) van waterstoffluoride (HF) en chloorpikrine-(CP) geïnduceerde oogbeschadigingen en/of blessure worden gepresenteerd in dit artikel. Hoewel wij deze twee toxische stoffen geselecteerd, zijn onze methoden van toepassing tot de studie van andere toxische stoffen met kleine wijzigingen in het protocol van toxische blootstelling. Het grote T-antigeen van SV40 vereeuwigd menselijke hoornvlies epitheliale cellijn DIE SV40-HCEC werd geselecteerd voor de studie. Levensvatbaarheid van de cellen en de productie van IL-8 werden geselecteerd als de eindpunten in het protocol van de screening. Verschillende uitdagingen in verband met de ontwikkeling van toxische blootstelling en cel cultuur methoden geschikt voor HTS studies worden gepresenteerd. De oprichting van HTS modellen voor deze toxische stoffen voorziet in verdere studies om het mechanisme van letsel en scherm voor potentiële therapeutics voor chemische oogbeschadigingen en/of schade beter te begrijpen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oogbeschadigingen en/of letsel veroorzaken-geïnduceerde is een ware oogbeschadigingen en/of noodsituatie omdat chemicaliën de potentie hebben om snel belangrijke weefselschade toebrengen. Behandelingen voor hoornvlies letsel veroorzaken-geïnduceerde zijn helaas alleen in het algemeen ondersteunende omdat niet geen specifieke therapeutische middelen beschikken voor de behandeling van deze letsels. De huidige strategie van de behandeling is niet-specifieke en hoofdzakelijk bevat actuele therapeutische behandelingen zoals smeermiddelen, antibiotica, en cycloplegics gevolgd door ontstekingsremmers (bijv., steroïden) eenmaal het hoornvlies heeft opnieuw epithelialized1 ,2. Ondanks de beste huidige therapeutische behandelingsopties beschikbaar is op lange termijn prognose over het algemeen slecht als gevolg van progressieve hoornvlies vertroebelt en neovascularization2,3.

Dierlijke modellen hebben van oudsher gebruikt chemische toxiciteit onderzoeken en begrijpen van de mechanismen van de schade. Dierproeven zijn echter tijdrovend en duur. Er zijn ook inspanningen ter vermindering van dierproeven. REACH-wetgeving (EG 1907/2006) in de Europese Unie heeft bijvoorbeeld bepalingen ter verminderen van dierproeven. De voorschriften omvatten een eis dat bedrijven gegevens delen teneinde dierproeven en goedkeuring van het Europees Chemicaliënagentschap voorafgaand aan het verrichten van voorgestelde proeven op dieren. Krachtens de bepalingen van REACH moeten de dierproeven een laatste redmiddel. Er is ook de Europese cosmetica-verordening (EG 1223/2009), die geleidelijk het testen van cosmetica op dieren. Wanneer dierproeven zijn uitgevoerd, zij worden geleid door de beginselen van 3V (verfijning, vermindering en vervanging), die een kader bieden voor het uitvoeren van meer humane dierlijk onderzoek, vermindering van het aantal proefdieren en het gebruik van proefdiervrije alternatieven waar mogelijk. Om deze redenen heeft het gebied van toxicologie willen aannemen in vitro testen die kunnen inzicht geven in de moleculaire mechanismen van toxiciteit en kunnen worden gedaan in de hogere doorvoer4. Dit is een functionele toxicologie benadering waar toxische stoffen worden gedefinieerd door hun functie in plaats van uitsluitend door hun chemie. Een stapje verder, functionele toxicogenomics proberen te begrijpen van de rol(len) die specifieke genen in de werking van toxische stoffen5 spelen. Met de toepassing van siRNA technologie, kunnen schermen te onderzoeken van de genfunctie in de moleculaire en cellulaire reacties op toxische stoffen worden gedaan met hoge doorvoersnelheid. siRNA zijn dubbele gestrande molecules van RNA die 19-25 nucleotiden lang die profiteren van de post transcriptionele gene silencing pathway aanwezig in alle cellen van zoogdieren6. Dit zijn synthetisch gemaakt en ontworpen om te richten van een specifiek gen. Wanneer een cel binnengebracht, siRNA wordt verwerkt en een strand, het strand van de gids, wordt geladen in het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC). SiRNA stuurt de RISC naar een aanvullend gebied in een mRNA-molecuul en de RISC degradeert de mRNA. Dit resulteert in het terugdringen van de expressie van de specifiek gen. De daaruit voortvloeiende vermindering van de expressie van de specifiek gen kan vervolgens worden bestudeerd in toxische blootgestelde cellen om na te gaan van de functie van dat gen in de cellulaire reactie op de veroorzaken. Een dergelijke aanpak is verder inzicht in de mechanismen van ricine gevoeligheid en de AHR-afhankelijke inductie van CYP1A17,8gebruikt.

De lijst van chemische terrorisme Risk Assessment (CTRA) en de toxische industriële chemische stoffen (TIC) aanbiedingen hebben gespecificeerde select chemicaliën op basis van hun toxiciteit en potentieel tijdens een terrorist, oorlogvoering of arbeidsongeval gebeurtenis9worden vrijgegeven. We passen een siRNA hoge throughput screening (HTS) toxicogenomic benadering van de studie van CTRA lijst toxische stoffen, die zijn geïdentificeerd als hoog risico van gebruik in een terroristisch incident. Traditionele toxicologie tracht te begrijpen van de schadelijke effecten die chemicaliën op levende organismen hebben; we hebben echter een verdere verlangen om te begrijpen van de mechanismen van letsel met het oog op de ontwikkeling van therapeutics en therapeutische benaderingen, en eventueel ook te informeren ontdekken van moleculen die voor therapeutische ontwikkeling kunnen worden gericht. Deze inspanning in sommige opzichten kan vergelijkbaar met het gebruik van hoge-doorvoer siRNA screening en cellen gebaseerde testen in de drug discovery proces10worden beschouwd. Een groot verschil zou zijn dat drugontdekking meestal tot doel heeft een enkelvoud doel voor therapeutische ontdekking overwegende dat in onze aanpak is het enigszins onwaarschijnlijk dat er zou een enkelvoud doel met hoge therapeutische waarde voor de behandeling van toxische blootstelling. Wij verwachten dat elke effectieve behandeling paradigma voor toxische blootstelling zou vereisen een veelzijdige aanpak om te bereiken hoge therapeutische waarde, en toxicogenomic gegevens kan een effectieve behandeling paradigma vitaal in kennis stellen.

Benchtop automatisering brengt hoge doorvoer methodologie aan laboratoria buiten de farmaceutische of de biotech-industrie. De in vitro studies aan ons instituut geweest historisch traditionele testen die lage doorvoersnelheid11,12,13. Ons laboratorium heeft in de afgelopen jaren overgestapt naar het gebruik van benchtop robotica tot hoge doorvoer siRNA screening uit te voeren. Hierin presenteren we de verfijning van oogbeschadigingen en/of cel modellen en de ontwikkeling van in vitro blootstelling methoden voor waterstoffluoride (HF) en chloorpikrine (CP) geschikt voor hoge doorvoer siRNA screening. Ons doel is het identificeren van moleculen die regulering van cellulaire schade naar aanleiding van deze toxische stoffen. De doelstellingen van de bibliotheek van de siRNA die wij geselecteerd zijn G eiwit-gekoppelde receptoren, eiwit kinases, proteasen, fosfatasen genaamd, ionenkanalen en andere potentieel druggable doelen. HF en CP werden geselecteerd voor studie door kruisverwijzingen CTRA lijst agenten met de verslagen van de ToxNet van industriële ongevallen te vinden die het grootste risico van oogbeschadigingen en/of letsel via damp blootstelling9,14te presenteren. CP (chemische formule Cl3CNO2, CAS-nummer 76-06-2) werd oorspronkelijk gebruikt als een traangas in WWI15. Het wordt momenteel gebruikt als een agrarische fumigatiemiddel en functies als een insecticide, fungicide en nematicide16. Waterstoffluoride (HF) wordt gebruikt in processen zoals alkylatie in olieraffinaderijen en elektrochemische fluorering van organische stoffen17. HF (chemische formule HF, CAS-nummer 62778-11-4) is een gas, maar in de waterige vorm is fluorwaterstofzuur (HFA, CAS number 7664-39-3). Dus wij gekozen om HFA gebruiken in onze in cel blootstelling modellen. Het grote T-antigeen van SV40 vereeuwigd menselijke hoornvlies epitheliale cellijn DIE SV40-HCEC werd geselecteerd voor de studie. Levensvatbaarheid van de cellen en de inflammatoire IL-8-markering werden geselecteerd als de eindpunten omdat doelstellingen die bij cellulaire schade betrokken zijn moeten worden weerspiegeld in de dood van de cel en de ontstekingsreactie. In het bijzonder als een doelwit waren een beschermende rol te spelen in toxische blootstelling, moet celdood en/of inflammatoire cytokine productie verhogen wanneer de target-expressie door siRNA wordt geremd. Het omgekeerde zou gelden voor doelstellingen die een negatieve rol spelen. Ook lijkt chronische ontsteking een rol te spelen in de cornea pathologie na blootstelling, en de interventie in de cel dood wegen kan verbetering van klinische resultaten2,18.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. cel cultuur onderhoud

  1. Groeien de cellijn SV40-HCEC bij 37 ° C, 5% CO2, en 90% vochtigheid in DMEM F-12 met 15% foetale runderserum (FBS), 1% L-glutamine, 10 µg/L epidermale groeifactor (EGF) en 5 mg/L insuline.
  2. Passage de cellijn elke 3 tot 4 dagen (afhankelijk van de dichtheid van het seeding) om ervoor te zorgen dat confluentie nooit groter is dan 80% tijdens het onderhoud van de cultuur.
  3. Loskoppelen van de cellen van de kolven met behulp van een detachement solution (14 mL oplossing voor elke 150 cm2 kolf) en incubatie bij 37 ° C gedurende niet meer dan 8 minuten.
  4. Neutraliseren van het detachement oplossing met een gelijk volume cel kweekmedium- and -pellet cellen in 50 mL conische buizen door centrifugeren gedurende 7 minuten op 160 x g.
  5. Resuspendeer de pellet cel in medium (20 mL voor elke kolf 150 cm2 ).
  6. De cellen met een geautomatiseerde handheld cel teller en zaad in nieuwe kolven op een dichtheid die hen in staat te groeien voor 3 tot 4 dagen zonder meer dan 80% confluentie te tellen.

2. plaat cellen voor experimenten

  1. Selectievakje maatkolven van SV40-HCECs door de lichte microscopie van fase contrast om ervoor te zorgen dat confluentie is minder dan 80% en het beoordelen van de algemene cell gezondheid.
  2. Loskoppelen, pellet resuspendeer en SV40-HCECs van de kolven zoals beschreven in stap 1.3 naar de 1.6 van cel cultuur onderhoud tellen. Hiermee kunt u dat SV40-HCEC medium met 0,5 µg/mL hydrocortison (HCORT medium) resuspendeer de cellen.
  3. Maak een suspensie van SV40-HCECs bij 17,857 cellen/mL in voorverwarmde HCORT medium in een wegwerp middellange fles.
    1. Een voldoende hoeveelheid celsuspensie voorbereiden op het aantal platen te worden ontpit.
    2. Zaad van een minimum van 14 x 96-wells-platen met cellen voor elke siRNA bibliotheek plaat worden bestudeerd.
  4. Swirl van de fles om gelijkmatig opschorten van de cellen, een voldoende volume van de celsuspensie giet in een reservoir op het roteerschudapparaat nest van een geautomatiseerde vloeibare handler en opslaan van de fles met de celsuspensie op een 37 ° C plaat opwarming van de aarde tijdens de cel plating proces.
  5. Gebruik de geautomatiseerde vloeibare handler aan cellen toevoegen aan de platen bij een dichtheid van 1000 cellen per putje (5000 cellen/cm2) in 70 µL van medium per putje van een 96-wells-plaat. Gebruik een 50 µL/s pipetting snelheid voor alle stappen.
    1. De roteerschudapparaat op 100 rpm constant tijdens het seeding uitvoeren.
    2. Meng de celsuspensie drie keer (140 µL vermengen volume) met behulp van de geautomatiseerde vloeibare handler.
    3. 140 µL van de celsuspensie gecombineerd en afzien van 70 µL in elk putje van twee cel cultuur platen.
    4. Herhaal stap 2.5.3 en 2.5.4 totdat alle platen hebben is bezaaid met cellen.
    5. Bijvullen van het reservoir van de schorsing cel zo nodig tijdens het seeding.
  6. Nadat de platen hebben is uitgezaaid, verwijderen uit de geautomatiseerde vloeibare handler en broeden ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voordat u ze overbrengt naar een cel cultuur incubator.
  7. Evalueren van de celdichtheid van elke put voor elke plaat de volgende ochtend met behulp van een geautomatiseerd imaging systeem die is gehuisvest in een cel cultuur incubator en uitsluiten van alle platen uit de studie die interieur putten die niet tussen 15% en 22% heuvels.

3. transfect cellen met siRNA

  1. Verwerven van siRNA bibliotheek platen van de leverancier vooraf geconfigureerd bevatten 80 siRNA doelstellingen per plaat (Zie Figuur 4), met de kolommen 1 en 12 leeg gelaten.
  2. Reconstrueren de siRNA bibliotheek plaat met siRNA buffer aan een definitieve concentratie van 2 pmol/µL voor elk putje van siRNA volgens de fabrikant instructies19.
  3. Transfect de cellen 24 h na het zaaien met 4 pmol/putje van siRNA en 0,3 µL per putje van transfectiereagens. Voer alle stappen uit volgens protocol van de transfectie reagens fabrikant (Zie Figuur 4 voor plaat lay-out)20.
    1. Alle de transfections met behulp van een geautomatiseerde vloeibare handler uitvoeren, en gebruik een 25 µL/s pipetting snelheid voor alle stappen. Gebruikt u vooraf geconfigureerde tip vakken te pakken alleen de putten die zal zijn transfected.
    2. Gebruik de top helft van de plaat van de bibliotheek aan de transfect een set van zes repliceren platen hierna aangeduid als de "Top plaat Set" (zes repliceert per siRNA, n = 6).
    3. Gebruik de onderste helft van de plaat van de bibliotheek naar een andere set van zes repliceren platen transfect hierna aangeduid als de "onderste plaat Set" (zes repliceert per siRNA, n = 6).
    4. Gebruik de term "Volledige plaat Set" om te beschrijven de 12 cell platen die met bibliotheek siRNA hebben zijn transfected.
    5. Transfect putten B2-B6 van alle platen in de volledige plaat Set met negatieve pool siRNA nadat alle boven- en onderkant plaat sets met bibliotheek siRNA hebben zijn transfected.
    6. Ook transfect putjes B2-B6 van een andere twee platen, die ontvangen geen bibliotheek siRNA en zal dienen als onbelicht besturingselementen (een voor de bovenplaat set) en één voor de bodem plaat set, met negatieve pool siRNA.
  4. Incubeer alle cel platen in een cel cultuur incubator voor 4 uur na alle transfectie mixen bijgekomen en mix door zachte tikken van elk uur.
  5. Gebruik een geautomatiseerde vloeibare handler te wassen alle putjes van de platen tweemaal met voorverwarmde HCORT medium verdund 1:5 in PBS. Gebruik een 50 µL/s pipetting snelheid voor alle stappen.
    1. Gecombineerd 100 µL van elk putje en gooi die in een afval reservoir.
    2. Toevoegen aan elke goed 100 µL per putje voorverwarmde HCORT medium verdund 1:5 in PBS die is opgenomen in een ander reservoir op een voldoende hoeveelheid voor het aantal platen.
    3. Herhaal stap 3.5.1 en 3.5.2 voor elke plaat.
      1. Desgewenst maakt u het afval reservoir leeg.
      2. Bijvullen van het reservoir met HCORT medium verdund 1:5 in PBS zo nodig.
    4. Gecombineerd 100 µL van elk putje en gooi die in het afval reservoir.
  6. Bijvoeding alle putjes van de platen met 100 µL per putje voorverwarmde HCORT medium, die is opgenomen in een ander reservoir op een voldoende hoeveelheid medium voor het aantal platen.
    1. Bijvullen van het reservoir met medium zoals nodig.
  7. Putjes C2-C6 van alle platen als niet-transfected besturingselementen gebruiken.
  8. Houd wells B7-B11 en C7-C11 van alle platen niet-transfected om te worden gebruikt als drugs- en voertuig besturingselementen voor toxische blootstelling.

4. bijvoeding de cellen de volgende dag

  1. Gebruik een geautomatiseerde vloeibare handler aan bijvoeding alle putjes van de platen. Gebruik een 50 µL/s pipetting snelheid voor alle stappen.
    1. Gecombineerd 100 µL van elk putje en gooi die in een afval reservoir.
    2. Bijvoeding elk goed met 100 µL per putje voorverwarmde HCORT medium dat is opgenomen in een ander reservoir en heeft een voldoende volume van medium voor het aantal platen te worden refed.
    3. Herhaal stap 4.1.1 en 4.1.2 desgewenst aan bijvoeding alle platen van de cel.
      1. Desgewenst maakt u het afval reservoir leeg.
      2. Bijvullen van het reservoir met medium zoals nodig.

5. de positieve controle toevoeging

  1. Twee dagen na de transfectie en twee uur voorafgaand aan blootstelling, bereid een 62,5 µM-oplossing van de positieve controle cardamonin in HCORT medium worden gebruikt voor HFA vorderingen en toevoegen aan rij B van een 8-rij verdunning reservoir.
    1. Voor CP blootstelling, bereiden en gebruiken van een oplossing van 25 µM van SKF 86002.
    2. Voorbereiden van een volume van positieve controle voldoende is voor het aantal platen te beproeven.
  2. Bereid een 0.625%-oplossing van DMSO in HCORT medium (voertuig control) en voeg aan rij C van de dezelfde reservoir.
    1. Voor CP blootstelling, bereiden en gebruiken van een 0,5%-oplossing van DMSO.
    2. Voorbereiden van een volume van voertuig controle voldoende is voor het aantal platen te beproeven.
  3. Gebruik de geautomatiseerde vloeibare handler positieve en voertuig besturingselementen toevoegen aan wells B7-B11 en C7-C11 van elke cel plaat en gebruik een 50 µL/s pipetteren snelheid voor alle stappen. Gebruikt u vooraf geconfigureerde tip vakken te pakken alleen de putten die de besturingselementen positief en voertuig ontvangt.
    1. 10 µL van medium verwijderen uit putten B7-B11 en C7-C11 van elke cel plaat en gooi het in rijen G en H van het reservoir 8-rij verdunning.
    2. Breng van 10 µL van de positieve en voertuig besturingselementen in die putjes en meng 3 keer.
  4. Deze cel platen terugkomen in de incubator.
  5. Herhaal stap 5.3 naar 5.4 totdat alle cel platen hebben ontvangen positieve en besturingselementen van het voertuig.

6. HF blootstelling van gekweekte cellen

Let op: HFA is corrosief en acuut toxisch.

  1. Alle chemische blootstelling bewerkingen uitvoeren in een chemische zuurkast een laboratorium jas, wegwerp polyethyleen mouwbeschermers, dubbele nitril handschoenen en veiligheidsbril dragen.
    1. Verwerven HFA als een 48% oplossing.
    2. Verdun HFA tot 1% met ultrazuiver water en op te slaan in 5 mL aliquots in flesjes van 10 mL dikke muur polyethyleen om veiligheid te verbeteren.
    3. Decontaminatie Pipetteer tips en reservoirs die met HFA en eventuele overgebleven vloeibare HFA met 2,5% calcium gluconaat voorafgaand aan verwijdering in de stroom van gevaarlijke afvalstoffen in contact zijn gekomen.
  2. Voor elke siRNA bibliotheek plaat onderzochte, bereid een 0.0036% HFA middellange-oplossing door het toevoegen van 288 µL van 1% HFA tot 80 mL voor voorverwarmde HCORT medium in een fles van 150 mL.
    1. Swirl van de fles en de verdunde HFA in een incubator van de 37 ° C in de chemische zuurkast gedurende 10 minuten uit te broeden.
  3. Meng de middellange HFA-oplossing opnieuw door de fles zwenken en voeg de HFA middellange oplossing aan een reagens reservoir op een schotelverwarmer.
  4. De blootstelling met twee technici werken in tandem uitvoeren.
    1. Hebben de technicus op de juiste aspirate 100 µL van elk van de interieur putjes van de plaat van een cel met behulp van een pipet 12 kanaal en geef vervolgens de plaat aan de technicus aan de linkerkant.
    2. De technicus aan de linkerkant Voeg 100 µL per putje van de middellange oplossing van HFA heb.
    3. Herhaal stap 6.4.1 en 6.4.2 voor alle cel-platen die worden blootgesteld aan veroorzaken.
    4. Ook Herhaal stap 6.4.1 en 6.4.2 voor onbelichte controle platen, met behulp van verse HCORT medium in plaats van de middellange HFA-oplossing.
  5. Plaats de platen in de chemische fume hood incubator voor 20 min en vervolgens terugsturen naar de cel cultuur incubator.
  6. Herhaal de stap van de positieve controle inzake toevoeging (stappen 5.1 tot 5,5) zoals eerder getoond zodra alle platen zijn blootgesteld en keerde terug naar de cel cultuur incubator.

7. CP blootstelling van gekweekte cellen

Let op: CP is acuut toxisch en een irriterend.

  1. Alle chemische blootstelling bewerkingen uitvoeren in een chemische zuurkast een laboratorium jas, wegwerp polyethyleen mouwbeschermers, dubbele nitril handschoenen en veiligheidsbril dragen.
    1. Verwerven van CP.
    2. Verdun CP tot 5% in DMSO en op te slaan in 10 mL aliquots in flesjes van 10 mL Scintillatie om veiligheid te verbeteren.
    3. Decontaminatie Pipetteer tips en reservoirs die met CP en eventuele overgebleven vloeibare CP met 2,5% natrium bisulfiet voorafgaand aan verwijdering in de stroom van gevaarlijke afvalstoffen in contact zijn gekomen.
  2. Voorbereiden van een voldoende hoeveelheid voorverwarmde HCORT medium met 1 x Pen/Strep en voorverwarmde PBS voor het aantal platen te worden blootgesteld.
  3. Voor elke set Top plaat instellen of bodemplaat, voeg 8.04 µL van 5% CP in DMSO naar een hoeveelheid van 50 mL van voorverwarmde HCORT medium en mix goed voor een eindconcentratie van de CP van 0,0008%. Cap de buis strak en Incubeer de oplossing in een incubator van de 37 ° C in de chemische zuurkast gedurende 1 uur.
    1. De tijd van de toevoeging van CP aan de 50 mL aliquots van medium zodat elk blootgesteld Top plaat ingesteld en veroorzaken precies 1 h bodem plaat ingesteld ontvangt nadat CP werd toegevoegd aan het 50 mL monster van medium.
  4. Een Top plaat ingesteld en 1 onbelicht controle plaat verwijderen uit de cel cultuur incubator en plaats ze in de chemische zuurkast in de buurt van het einde van de incubatieperiode.
  5. Meng de CP-oplossing door het omkeren van de buis en decanteren het vervolgens naar een reagens reservoir aan het eind van de incubatieperiode van 1 h.
  6. De blootstelling met twee technici werken in tandem uitvoeren.
    1. Hebben de technicus op de juiste aspirate 100 µL van elk van de interieur putjes van de plaat van een cel met behulp van een pipet 12 kanaal en geef vervolgens de plaat aan de technicus aan de linkerkant.
    2. De technicus aan de linkerkant Voeg 100 µL per putje van de CP middellange oplossing hebben.
    3. Herhaal stap punten 7.6.1 en 7.6.2 voor alle platen van de cel van de Set van Top plaat worden blootgesteld aan veroorzaken.
    4. Ook Herhaal punten 7.6.1 en 7.6.2 voor onbelichte controle platen, met behulp van verse HCORT medium in plaats van de CP middellange oplossing.
  7. Plaats de platen in een incubator van de 37 ° C in de chemische zuurkast gedurende 10 minuten.
  8. Voeg een voldoende hoeveelheid PBS en HCORT medium met 1 x Pen/Strep aan reagens stuwmeren in de buurt van het einde van de incubatieperiode van 10 min.
  9. De CP-oplossing uit cel platen met behulp van een pipet 12 kanaal verwijderen en het vervangen van 100 µL per putje van PBS aan het eind van de incubatietijd van 10 min.
  10. Onmiddellijk de PBS uit cel platen te verwijderen en te vervangen door 100 µL per putje HCORT medium dat 1 x Pen/Strep.
  11. Ook Herhaal 7.9 en 7.10 voor de onbelichte controle platen.
  12. De platen van de cel terug naar een standaard cel cultuur incubator.
  13. Herhaal stap 7.3 naar 7.12 voor de bodem plaat Set.
  14. Herhaal de stap van de positieve controle inzake toevoeging (stappen 5.1 tot 5,5) zodra alle platen zijn blootgesteld en keerde terug naar de cel cultuur incubator zoals hiervoor is beschreven.

8. voorbeeld van de collectie en cel levensvatbaarheid Assay

  1. Vierentwintig uur na de blootstelling, bereid een oplossing van 0, 5 mg/mL MTT substraat in PBS met 10 g/L glucose en warm tot 37 ° C21. Bereiden van 10 mL substraat voor elke plaat te worden bepaald.
  2. Voeg een voldoende hoeveelheid MTT substraat oplossing naar een reservoir van een geautomatiseerde vloeibare-handler voor het aantal platen worden bepaald.
  3. Gebruik de geautomatiseerde vloeibare handler monster verzameld en toevoegen van MTT substraat met behulp van een 50 µL/s pipetteren snelheid voor alle stappen. Vooraf configureren van tip vakken om alleen die putten te worden bepaald.
    1. Aspirate 95 µL van medium uit de innerlijke 60 putten uit de cel plaat, en de storting 42,5 µL in elk van de twee platen van 384-well-opslag.
    2. Onmiddellijk 100 µL per putje van de MTT substraat oplossing toevoegen aan de cel platen, en hen Incubeer bij 37 ° C in een cel cultuur incubator voor 1,5 h.
    3. Het bijvullen van het reservoir met MTT substraat oplossing zo nodig.
  4. Incubeer de platen van de cel bij 37 ° C in een cel cultuur incubator voor 1 h.
  5. Zegel van de platen 384-well opslag en bewaar ze bij-80 ° C voor latere analyse.
  6. Herhaal stap 8.3 naar 8,5 voor alle boven- en onderkant plaat sets en de bijbehorende onbelicht besturingselementen.
    1. Hergebruik tips tussen wordt gerepliceerd als gewenst, maar ze was bij het toevoegen van MTT substraat oplossing en als schakelen tussen plaat wordt ingesteld.
  7. Na de incubatie 1 h toevoegen een voldoende hoeveelheid DMSO naar een reservoir van een geautomatiseerde vloeibare handler.
  8. Gebruik de geautomatiseerde vloeibare handler toevoegen van DMSO en gebruik een 50 µL/s pipetteren snelheid voor alle stappen.
    1. Gecombineerd 100 µL van elk van de innerlijke putten van de cel-platen en gooi de MTT substraat oplossing in een afval reservoir.
      1. Desgewenst maakt u het afval reservoir leeg.
    2. Overlay elk putje met 100 µL DMSO.
      1. Bijvullen van het reservoir DMSO zo nodig.
  9. Schud de platen op een plaat shaker gedurende 3 minuten.
  10. Meet de extinctie op 570 en 690 nm met behulp van een plaat spectrofotometer.
  11. Aftrekken van de achtergrond en de levensvatbaarheid van de cellen van de % door de blootgestelde absorptie-waarden te delen door de onbelichte besturingselementen te berekenen. Gebruik het gemiddelde onbelicht negatieve pool siRNA besturingselement voor het berekenen van de levensvatbaarheid van de cellen van de % voor alle doelen.

9. maatregel IL-8 concentratie in cel cultuur supernatant

  1. Maatregel de concentratie van IL-8 in de cel cultuur supernatant met behulp van een no wassen kraal gebaseerde bepaling volgens22instructies van de fabrikant. Maak een lay-out van het plaat assay voor monsters en standaard curve.
  2. Verwijderen van de 384-well opslag platen uit de diepvries-80 ° C, ontdooien bij kamertemperatuur en kort centrifugeren de platen voor het verzamelen van het monster in de bodem van de putten.
  3. Voor het aantal assay platen moet worden uitgevoerd, een voldoende hoeveelheid anti-IL-8 acceptor kralen en biotinyleerd anti-IL-8 antilichaam in assay buffer inbegrepen in de kit te maken. De verhouding van 50 µL van anti-IL8 acceptor kralen en 50 µL van biotinyleerd anti-IL8 antilichaam aan 9.9 milliliters assay buffer gebruiken.
    1. Met behulp van een meerkanaals Pipet, parel/antilichaam mengsel aan een plaat met zwarte 384-well opslag toevoegen.
      1. Acceptor parel/antilichaam aan de putten die bestemd zijn voor gebruik voor monsters en standaard curve volgens de assay plaat lay-out toevoegen.
      2. Voeg een voldoende volume per putje voor het aantal assay platen moet worden uitgevoerd.
  4. Reconstrueren van IL-8-norm tot 1000 pg/mL met behulp van cel kweekmedium dat 354 µM NaCl. Maak een voldoende volume voor het aantal assay platen moet worden uitgevoerd.
  5. Acht tweevoudige seriële verdunningen van de standaard curve maken
  6. De standaard curve in drievoud toevoegen aan de juiste putjes van de plaat van een zwarte 384-well opslag volgens de assay plaat lay-out. Voeg een voldoende volume per putje voor het aantal assay platen moet worden uitgevoerd.
    1. Op dezelfde manier toevoegen cel kweekmedium dat 354 µM NaCl met IL-8 voor de meting van de achtergrond.
  7. Gebruik een geautomatiseerde vloeibare-handler voor het uitvoeren van de test. Gebruikt u vooraf geconfigureerde tip vakken te pakken alleen de putten die zijn aangewezen door de assay plaat lay-out. Gebruik een 50 µL/s pipetting snelheid voor alle stappen.
    1. 8 µL van het mengsel van de kraal-antilichaam acceptor overbrengen in de putten van de witte ondiepe 384-well goed assay-platen.
      1. Alleen toevoegen aan de putjes aangewezen voor monsters en de standaard curve volgens de assay plaat lay-out.
    2. Breng 2 µL van de standaard curve aan de juiste putjes van de ondiepe goed assay platen volgens de assay plaat lay-out.
    3. Bereid een 3.54 M NaCl-oplossing en een voldoende volume voor het aantal platen te worden bepaald naar een ondiep reservoir van de geautomatiseerde vloeibare-handler toevoegen.
    4. Aanpassen van de zoutconcentratie van de monsters naar overeenkomen met die van de standaard curve door de overdracht van 4.5 µL van de NaCl-oplossing aan de monsters in de zwarte 384-well opslag platen.
    5. Meng de monsters driemaal met een mengen volume van 30 µL en overdracht 2 µL van de monsters naar de ondiepe wit goed assay platen volgens de assay plaat lay-out.
      1. Tips tussen monster platen wijzigen
    6. Incubeer gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur.
    7. Voor het aantal assay platen moet worden uitgevoerd, een voldoende hoeveelheid acceptor kralen in assay buffer te maken. De verhouding van 200 µL van secundaire acceptor parels aan 12.3 mL assay buffer gebruiken.
    8. Met behulp van een meerkanaals Pipet, secundaire kralen aan een plaat met zwarte 384-well opslag toevoegen.
      1. Secundaire kralen aan de putten die bestemd zijn voor gebruik voor monsters en standaard curve volgens de assay plaat lay-out toevoegen.
      2. Voeg een voldoende volume per putje voor het aantal assay platen moet worden uitgevoerd.
    9. Met behulp van de geautomatiseerde vloeibare handler, overdracht 10 µL van de secundaire parels aan de putjes van de witte ondiepe 384-well goed assay platen.
      1. Alleen aan de putten die ontvangen van monsters en standaard curve volgens de assay plaat lay-out toevoegen en wassen van de tips tussen elke plaat.
    10. Incubeer gedurende een uur in het donker bij kamertemperatuur.
  8. Het zegel van de test platen met duidelijk plaat zeehonden en scannen met behulp van een afleesapparaat compatibel met de test. 0.2 mm afstand tussen de plaat en detector, 180 ms excitatie tijd en 550 ms meting tijd gebruiken voor de scan.
  9. Importeren van de ruwe gegevens van de IL-8 testen in een werkblad.
  10. Gebruik van geautomatiseerde curve passend voor de standaard curve van de tests van de IL-8, en vervolgens de onbewerkte gegevens omzetten in pg/mL voor elk monster.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het ontwikkelen van de methoden van blootstelling

We verfijnd en de geschiktheid van de menselijke hoornvlies epitheliale cellijn SV40-HCEC voor gebruik in HTS studies geëvalueerd. SV40-HCEC zijn vereeuwigd met behulp van het SV-40 grote T antigeen en waren een geschenk van Dhanajay Pal23. Er waren te veel variabelen onderzocht in het blootstelling Methodiekontwikkeling bondig hierin pres...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hierin beschrijven we onze methoden en de resultaten op de ontwikkeling van een hoge doorvoersnelheid hoornvlies epitheliale cel screening model voor de studie van HF en CP verwondingen. Ook presenteren we de resultaten van het scherm van de primaire siRNA voor HF letsel. Er waren veel uitdagingen aan de ontwikkeling van HTS modellen voor de studie van TIC verwondingen. Methoden die we in de literatuur aan de studie van HF, HFA of CP in cel cultuur modellen gerelateerde vinden konden waren weinig hulp. Meeste in vitr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

DISCLAIMER: de meningen uitgedrukt in dit artikel zijn die van de auteur (s) en komen niet overeen met het officiële beleid van de afdeling van het leger, ministerie van defensie en de Amerikaanse regering. Dit onderzoek werd ondersteund door een interdepartementale overeenkomst tussen NIH/NIAID en de USAMRICD, en gedeeltelijk door een afspraak aan de Postgraduate onderzoeksprogramma voor deelname aan het Amerikaanse leger medisch onderzoek instituut van chemische defensie wordt beheerd door de eik Ridge Instituut voor wetenschap en onderwijs door een interdepartementale overeenkomst tussen het Amerikaanse ministerie van energie en USAMRMC.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid tegengaan programma Interagency overeenkomst # AOD13015-001. Wij wil Stephanie Froberg en Peter Hurst bedanken voor hun inspanningen en expertise op videoproductie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bravo liquid handing platformAgilent of gelijkwaardigG5409A
Bravo plate shakerAgilent of gelijkwaardigOptie 159
Bravo 96LT disposable tip headAgilent of gelijkwaardigOptie 17896-kanaals grote tip pipetteringseenheid
Bravo 96ST disposable tip headAgilent of gelijkwaardigOptie 17796-kanaals kleine tip pipetteringseenheid
Bravo 384ST disposable tip headAgilent of gelijkwaardigOptie 179384-kanaals kleine tip pipetteringseenheid
Bravo 96 250 μL steriele barrière tipsAgilent of gelijkwaardig19477-022
Bravo 384 30 μL steriele barrière tipsAgilent of gelijkwaardig19133-212
Bravo 384 70 μL steriele barrière tipsAgilent of gelijkwaardig19133-212
EnSpire multimode plate readerPerkin Elmer of gelijkwaardig2300-0000AlphaLISA assay detector met hoge vermogenslaserexcitatie
IL-8 (mens) AlphaLISA Detection Kit Perkin Elmer of gelijkwaardigAL224Fgeen-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus witte 384-shallow well microplatesPerkin Elmer of gelijkwaardig6008359
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen of gelijkwaardig13778500Transfectie reagens
Opti-MEM 1 Reduced Serum MediumInvitrogen of gelijkwaardig31985070
TrypLE ExpressGibco of gelijkwaardig12605010Celdetacheringsoplossing
IncuCyte ZoomEssen Instruments of gelijkwaardigESSEN BIOSCI 4473Incubator-gehuiste geautomatiseerde microscoop
ChloropicrineTrinity Manufacturing of gelijkwaardigN/AAcute toxiciteit en irriterend
DMEM-F12 celcultuurmediumInvitrogen of gelijkwaardig11330-057Bevat HEPES
Fetaal bovien serumInvitrogen of gelijkwaardig1891471
Menselijke epidermale groeifactor (celcultuurkwaliteit)Invitrogen of gelijkwaardigE9644-.2MG
Recombinant menselijk insuline (celcultuurkwaliteit)Invitrogen of gelijkwaardig12585-014
Penicilline-Streptomycine oplossing (celcultuurkwaliteit)Invitrogen of gelijkwaardig15140122
Hydrocortison (celcultuurkwaliteit)Sigma of gelijkwaardigH0888-10G
Glucose  (celcultuurkwaliteit)Sigma of gelijkwaardigG7021
PBS  (celcultuurkwaliteit)Sigma of gelijkwaardigP5493
siRNADharmacon of gelijkwaardigdiverse
Thiazolyl blauw tetrazoliumboormideSigma of gelijkwaardigM5655MTT assay substraat
siRNA bufferThermo of gelijkwaardigB002000
96-well celcultuur platenCorning of gelijkwaardigCLS3595
T150 celcultuur flaskenCorning of gelijkwaardigCLS430825
BSL-2 celcultuur kapNuaire of gelijkwaardigNU-540
300 mL robotische reservoirsThermo of gelijkwaardig12-565-572 
96 baffled automatiseringsreservoirsThermo of gelijkwaardig1064-15-8
500 mL steriele wegwerp opslagflessenCorning of gelijkwaardigCLS430282
Microplate warmtesealerThermo of gelijkwaardigAB-1443A
Microplate warmtesealing folieThermo of gelijkwaardigAB-0475
CardamonineTocris of gelijkwaardig2509Anti-inflammatoire, gebruikt als positieve controle
SKF 86002 Tocris of gelijkwaardig2008Anti-inflammatoire, gebruikt als positieve controle
DMSOSigma of gelijkwaardigD8418
48% fluorwaterstoffzuurSigma of gelijkwaardig339261Corrosief en acute toxiciteit
1000 μL Enkelkanaals pipettersRainin of gelijkwaardig17014382
200 μL Enkelkanaals pipettersRainin of gelijkwaardig17014391
20 μL Enkelkanaals pipettersRainin of gelijkwaardig17014392
1000 μL 12-kanaals pipettersRainin of gelijkwaardig17014497
200 μL 12-kanaals pipettersRainin of gelijkwaardig17013810
20 μL 12-kanaals pipettersRainin of gelijkwaardig17013808
Pipettor tips 1000 μLRainin of gelijkwaardig17002920
Pipettor tips 200 μLRainin of gelijkwaardig17014294
Pipettor tips 20 μLRainin of gelijkwaardig17002928
Chemische afzuigkapJamestown Metal ProductsMHCO_229
384-well monsteropslag platenThermo of gelijkwaardig262261
NatriumchlorideSigma of gelijkwaardigS6191
50 mL kegelbuizenThermo of gelijkwaardig14-959-49A
Serologische pipetten 50 mLCorning of gelijkwaardig07-200-576
Serologische pipetten 25 mLCorning of gelijkwaardig07-200-575

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Randleman, B. Drugs, Diseases and Procedures. Hampton, R. , Medscape. (2011).
  2. Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
  3. Wang, X. A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects. Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).
  4. Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing. Frontiers in Genetics. 5, 110(2014).
  5. North, M., Vulpe, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).
  6. McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).
  7. Bassik, M. C. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
  8. Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).
  9. Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , U.S. Department of Homeland Security, Science and Technology Directorate, Chemical Security Analysis Center. Aberdeen Proving Ground, MD. (2012).
  10. Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).
  11. Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture. Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).
  12. Ruff, A. L., Dillman, J. F. 3rd Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).
  13. Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).
  14. Toxnet. , https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
  15. Bancroft, W. D. The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, Otis Historical Archives, National Museum of Health and Medicine. (1926).
  16. Chloropicrin Risk Characterization Document. , California Environmental Protection Agency. (2012).
  17. Aigueperse, J., et al. Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , Wiley-VCH. (2000).
  18. Sotozono, C. Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair. Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).
  19. Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/sirna-libraries-guidelines.pdf (2015).
  20. Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-culture/pdfs.par.72509.file.dat/Lipofectamine%20rnaimax%20protocol%20v2.0.pdf (2017).
  21. Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).
  22. IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , http://www.perkinelmer.com/searchresult?searchName=AL224F&_csrf=dd35c533-8dc4-4005-a87f-c5ab3a519bf3 (2016).
  23. Araki-Sasaki, K. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  25. Ruff, A. L. Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression. Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).
  26. GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/00-0372?SID=srch-srp-00-0372 (2018).
  27. Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
  28. He, H. Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells. Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).
  29. Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).
  30. Pesonen, M. Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells. Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).
  31. Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H. Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. Seiber, J. N., et al. 652, American Chemical Society. Ch. 8 (1997).
  32. Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).
  33. Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).
  34. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice. Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).
  35. Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).
  36. Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4. Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).
  37. van der Poll, T., Lowry, S. F. Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone. Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).
  38. Solomon, A. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).
  39. Mishra, P. K. Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells. International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).
  40. Stockholm, D. The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro. PLoS One. 2 (4), e394(2007).
  41. ATCC Animal Cell Culture Guide. , American Type Culture Collection. Manassas, VA. (2014).
  42. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  43. Mpindi, J. P. Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data. Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).
  44. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cornea epitheelcellenblootstelling aan fluorwaterstofzuurchloropicrine toxiciteitcellevensvatbaarheidsassayIL 8 productiegeautomatiseerd vloeistofbehandelingssysteemzaaien van 96 wellsplatenMTT assayprotocolbead gebaseerde IL 8 detectie

Gerelateerde artikelen