De rol van zelfkopiërende plasmiden testen in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica

Summary

Hier presenteren we een experimentele methode om te testen van de rol van zelfkopiërende plasmiden in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica.

Abstract

Zelfkopiërende plasmiden zijn zeer overvloedig in prokaryoten, maar hun rol in de bacteriële evolution blijft slecht begrepen. We toonden onlangs dat de toename van de gene exemplaaraantal per cel geboden door zelfkopiërende plasmiden de evolutie van de plasmide-gecodeerde genen kan versnellen. In dit werk presenteren wij een experimenteel systeem om te testen de mogelijkheid voor zelfkopiërende plasmiden ter bevordering van de evolutie van de gene. Met behulp van eenvoudige moleculaire biologiemethodes, we hebben een modelsysteem waar een antibiotica-resistentie gen kan worden ingevoegd in Escherichia coli MG1655, in het chromosoom of op een zelfkopiërende plasmide gebouwd. We gebruik van een experimentele evolutie aanpak te verspreiden van de verschillende stammen onder toenemende concentraties van antibiotica en we meten overleven van bacteriële bevolking na verloop van tijd. De keuze van het antibioticum molecuul en de weerstand-gen is zodat het gen slechts weerstand door de verwerving van mutaties verlenen kan. Deze "evolutionaire rescue"-aanpak biedt een eenvoudige methode om te testen het potentieel voor zelfkopiërende plasmiden ter bevordering van de verwerving van antibiotica-resistentie. In de volgende stap van het experimentele systeem, worden de moleculaire grondslagen van resistentie tegen antibiotica gekenmerkt. Ter identificatie van mutaties verantwoordelijk voor de verwerving van resistentie tegen antibiotica gebruiken we diep DNA sequentiebepaling van monsters die zijn verkregen van hele bevolkingsgroepen en klonen. Ten slotte, om te bevestigen de rol van de mutaties in het gen in onderzoek, we reconstrueren hen in de ouderlijke achtergrond en test het fenotype van de weerstand van de resulterende spanningen.

Introduction

Antibiotica-resistentie bij bacteriën is een belangrijke gezondheid probleem¹. Op een fundamenteel niveau is de verspreiding van resistentie tegen antibiotica in pathogene bacteriën een eenvoudig voorbeeld van evolutie door natuurlijke selectie^2,3. Simpel gezegd, het gebruik van antibiotica genereert selectie van resistente stammen. Daarom, is een belangrijk probleem in de evolutiebiologie, inzicht in de factoren die invloed hebben op het vermogen van bacteriële populaties te ontwikkelen resistentie tegen antibiotica. Selectie experimenten zijn voortgekomen als een zeer krachtig hulpmid....

Protocol

1. bouw van het experimentele systeem codering van antibiotica-resistentie gen

Opmerking: Hier E. coli MG1655 werd gebruikt als de ontvangende stam van de plasmide - of chromosoom gecodeerde antibiotica-resistentie gen. De antibiotica-resistentie gen is gecodeerd in het chromosoom of een zelfkopiërende plasmide in een anders isogene stam (Figuur 1).

1. Toevoeging van de antibiotica-resistentie gen in de lambda phage integratie site (attB)²⁰ van het chromosoom van MG1655.
   1. Versterken van 500 bp durende regio's aan beide zijden van de chr....

Results

In onze eerdere werk, werd de evolutie van de β-lactamase gene bla_TEM-1 naar overdracht van resistentie tegen de derde generatie cefalosporine Ceftazidim¹² onderzocht. Dit gen werd geselecteerd omdat, hoewel TEM-1 geen weerstand tegen Ceftazidim verleent, mutaties in bla_TEM-1 kunnen het bereik van de activiteit van de TEM-1 te hydrolyseren cefalosporines zoals Ceftazidim²⁹. Mutaties in de antibioticare.......

Discussion

Presenteren we een nieuw protocol combinatie van moleculaire biologie, experimentele evolutie en diepe DNA rangschikkend ontworpen te onderzoeken van de rol van zelfkopiërende plasmiden in de evolutie van antibiotica-resistentie bij bacteriën. Hoewel dit protocol technieken uit verschillende velden combineert, alle methoden die nodig zijn voor de ontwikkeling ervan zijn eenvoudig, en kunnen worden uitgevoerd in een laboratorium van de regelmatige microbiologie. De belangrijkste stappen in het protocol zijn waarschijnlijk.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thermocycler	BioRad	C1000
Electroporator	BiorRad	1652660
Electroporation cuvettes	Sigma-Aldrich	Z706078
NanoDrop 2000/2000c	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm
Incubator	Memmert	UF1060
Incubator (shaker)	Cole-Parmer Ltd	SI500
Electrophoresis power supply	BioRad	1645070	Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis chamber	BioRad	1704405	Agarose gel electrophoresis
Pippettes	Biohit	725020, 725050, 725060, 725070
Multi-channel pippetes	Biohit	728220, 728230, 728240
Plate reader Synergy HTX	BioTek	BTS1LF
Inoculating loops	Sigma-Aldrich	I8388
96-well plates	Falcon	351172
LB	BD Difco	DF0446-17-3
LB agar	Fisher scientific	BP1425-500
Phusion Polymerase	Thermo Fisher Scientific	F533S
Gibson Assembly	New England Biolabs	E2611S
Resctriction enzymes	Fermentas FastDigest
Antibiotics	Sigma-Aldrich
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	Plasmid extraction kit
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	gDNA extraction kit
DNeasy Blood & Tissue Kits	Qiagen	69506	gDNA extraction kit
Electroporation cuvettes	Sigma-Aldrich	Z706078
Petri dishes	Sigma-Aldrich	D9054
Cryotubes	ClearLine	390701
96-well plates (-80ºC storage)	Thermo Fisher Scientific	249945
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2670	Quantification of DNA concentartion
Agarose	BioRad	1613100	Agarose gel electrophoresis
50x TAE buffer	BioRad	1610743	Agarose gel electrophoresis
T4 Polynucleotide Kinase	Thermo Fisher Scientific	EK0031
T4 DNA Ligase	Thermo Fisher Scientific	EL0014