Methodenartikel

Een eiwit Microarray Assay voor serologische bepaling van antigeen-specifieke antilichaam reacties volgende Clostridium difficile -infectie

DOI:

10.3791/57399

⸱

15 juni 2018

 ,  , 
1Breast Surgery Group, Division of Medical Sciences and Graduate Entry Medicine, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham, 2Medical Microbiology and Immunology Department, Faculty of Medicine, Mansoura University, 3Nottingham Digestive Diseases Centre and NIHR Nottingham Digestive Diseases Biomedical Research Centre, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel bevat een beschrijving van een eenvoudige eiwit microarray methode voor profilering humorale immuunreacties aan een 7-plex panel van sterk gezuiverd Clostridium difficile antigenen in menselijke sera. Het protocol kan worden uitgebreid voor de bepaling van specifieke antilichaam reacties in preparaten van polyklonale intraveneuze immunoglobuline.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij bieden een gedetailleerd overzicht van een nieuwe high-throughput eiwit microarray test voor de bepaling van anti -Clostridium difficile antilichaam niveaus in menselijke sera en in afzonderlijke preparaten van polyklonale intraveneuze immunoglobuline (IVIg). Het protocol beschrijft de methodologische stappen die betrokken zijn bij de bereiding van de monsters, afdrukken van matrices, assay procedure en data-analyse. Bovendien, kan dit protocol verder worden ontwikkeld om te nemen van uiteenlopende klinische monsters, met inbegrip van plasma en supernatant van cultuur van de cel. We laten zien hoe eiwit microarray kan worden gebruikt om te bepalen van een combinatie van isotype (IgG, IgA, IgM), subklasse (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), en stam-specifieke antilichamen tegen sterk gezuiverd hele C. difficile toxines A en B (toxinotype 0, stam VPI 10463, ribotype 087), toxine B van een C. difficile toxine-B-only waarin stam (CCUG 20309), een vorm van de voorloper van een B-fragment van binaire toxine, pCDTb, ribotype-specifieke hele toplaag eiwitten (SLPs; 001, 002, 027), en de controle van eiwitten (tetanus tetanustoxoïd en Candida albicans). Tijdens het experiment zijn microarrays gesondeerd met sera uit individuen met C. difficile infectie (CDI), mensen met cystic fibrosis (CF) zonder diarree, gezonde controles (HC), en individuen pre en post-IVIg therapie voor de behandeling van chronische inflammatoire demyeliniserende polyradiculopathy, CDI en gecombineerde immunodeficiëntie stoornis. We ondervinden aanzienlijke verschillen in toxine neutralisatie efficacies en multi-isotype specifiek antilichaam niveaus tussen patiëntengroepen, commerciële preparaten van IVIg, en sera vóór en volgende IVIg administratie. Ook is er een significante correlatie tussen microarray en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) voor antitoxine IgG niveaus in serummonsters. Deze resultaten suggereren dat microarray een veelbelovend instrument voor profiling van antilichaam reacties op C.difficile antigenen in gevaccineerde of besmette mensen zou kunnen worden. Met de verdere verfijning van antigeen panelen en een afname van de productiekosten verwachten we dat microarray technologie helpen kan optimaliseren en selecteer de klinisch meest nuttige immuuntherapie voor C. difficile -infectie in een patiënt-specifieke wijze.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling en validatie van een nieuwe en aangepaste eiwit microarray assay voor het opsporen en semi-kwantificering van bacteriële stam en isotype-specifieke antilichaam reacties op C. difficile antigenen. Wij gebruiken met succes onze C. difficile-specifieke microarray assay als een veelbelovend nieuw hulpmiddel voor de compositorische bioanalyse van specifieke antilichaam inhoud in patiënt sera1,2, bereidingen van IVIg3, en identificatie van specifieke kenmerken van antilichaam die met de slechte resultaten in de CDI4 correleren. We laten zien hoe biobanked serummonsters en commerciële preparaten van IVIg kunnen worden geanalyseerd op microarray dia's, waardoor hoge kwaliteit reproduceerbaar profilering van C. difficile pathogeen-specifieke antilichaam reacties in deze test.

Veel gezonde kinderen en volwassenen hebben detecteerbare serum IgG- en IgA-antilichamen tegen C. difficile toxines A en B5,6. Deze worden verondersteld te ontstaan naar aanleiding van voorbijgaande blootstelling tijdens kinderschoenen en na blootstelling aan C. difficile in de volwassenheid. Om deze reden polyklonale IVIg is afwijkend gebruikt voor de behandeling van recidiverende zowel fulminant CDI7,8,9. Echter, haar definitieve rol en werkingsmechanisme is onduidelijk. Verschillende studies hebben aangetoond dat de humorale immune reactie op toxines van C. difficile een rol bij ziekte presentatie en resultaat speelt. Specifiek, weergeven asymptomatische patiënten een verhoogde anti-toxine A IgG serumconcentratie vergeleken met patiënten die de ontwikkeling van de symptomatische ziekte10 Een aantoonbare vereniging is gemeld voor de mediane anti-toxine A IgG titers en 30-daagse all-cause mortality11. Verscheidene verslagen is ook gebleken dat een associatie met een bescherming tegen herhaling en antilichaam reacties op het toxine A, B en verschillende niet-toxine antigenen (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD en toplaag eiwitten (SLPs))12,13 , 14 , 15. deze opmerkingen hebben aangespoord de ontwikkeling van de eerste passieve immunotherapie drug-toxine met targeting C. difficile B (bezlotuxumab), dat onlangs is goedgekeurd door de US Food and Drug Administration en het Europees Geneesmiddelenbureau Agentschap voor het voorkomen van terugkerende CDI16. Vaccinatiestrategieën door middel van geïnactiveerd toxines of recombinante toxine fragmenten zijn ook momenteel in ontwikkeling17,18,19. Deze nieuwe therapeutische benaderingen zullen ongetwijfeld het stimuleren van de eis voor de evaluatie van de humorale immuunreacties aan meerdere antigenen in grote steekproeven.

Vandaag, is er een opmerkelijke gebrek verkrijgbare high-throughput assays staat gelijktijdig bacteriële stam en isotype-specifieke antilichaam reacties op C. difficile antigenen. Er is een unmet behoefte aan het ontwikkelen van deze gehaltebepalingen om toekomstige onderzoeksinspanningen en klinische toepassingen te vergemakkelijken. Eiwit microarrays is een methode om grote aantallen van individueel gezuiverd eiwitten als een ruimtelijk georganiseerde matrix van plekken op een microscopische dia gebaseerde oppervlak te immobiliseren met behulp van een robot systeem, dat een contact20 of een contactloze zijn kan gereedschap21afdrukken. De plekken kunnen complexe mengsels zoals cel lysates, antilichamen, weefsel homogenates, endogene of recombinante eiwitten peptiden, lichaamsvloeistoffen of drugs22,23vertegenwoordigen.

Eiwit microarray technologie biedt duidelijke voordelen boven standaard in-house ELISA technieken, die van oudsher gebruikt hebben om te beoordelen van de anti -C. difficile antilichaam reacties. Deze omvatten een grotere capaciteit voor het opsporen van een aantal multi-isotype-specifieke antistoffen tegen een uitgebreidere panel van eiwit doelen, verminderde volume eisen voor antigenen, monsters en reagentia, en een verbeterde mogelijkheid om te integreren in een groter aantal technische replicatieonderzoeken, naast meerdere interne kwaliteitscontrole (QC) meet1. Microarrays zijn daarom meer gevoelige, nauwkeurig en reproduceerbaar en hebben een groter dynamisch bereik. Deze factoren maken microarrays een goedkoper en potentieel gunstige alternatief voor ELISAs voor de grootschalige opsporing van bekende eiwitten. Nadelen van microarray technologie leidt echter tot voornamelijk uit de grote up-front kosten in verband met de oprichting van een panel van hoogst gezuiverde antigenen en het opzetten van het technologische platform.

Eiwit microarrays zijn uitgebreid gebruikt in de afgelopen twee decennia als een onderzoeksinstrument van de diagnostische en fundamenteel in klinische toepassingen. Specifieke toepassingen omvatten eiwit expressie profilering, de studie van enzym-substraat relaties, biomerker screening, analyse van host-microbe interacties, en profiling van antilichaam specificiteit23,24, 25,26,27,28. Veel nieuwe pathogen eiwit/antigeen microarrays zijn vastgesteld, met inbegrip van malaria (Plasmodium)29, HIV-130, influenza31, ernstig acuut respiratoir syndroom (SARS)32, virale hemorragische koorts33 , infectieziekte34en35van de tuberculose.

Dit protocol heeft betrekking op de oprichting van een eenvoudige operationele C. difficile reactieve antigeen microarray assay, waarmee specifieke, nauwkeurige en precieze kwantificering van multi-isotype en stam-specifieke antilichaam reacties op C. difficile antigenen in sera en polyclonal IVIg. Wij zijn hierin, representatieve resultaten met betrekking tot een aanvaardbaar microarray assay prestaties in vergelijking met ELISA evenals assay nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de techniek van profielen. Deze bepaling verder kan worden ontwikkeld om het profiel van andere klinische monsters en zet een nieuwe standaard voor onderzoek naar de moleculaire basis van de CDI.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiden van een plaat van Microarray

  1. C. difficile antigenen met een afdrukken buffer [PBS-Tween-trehalose (50 mM)] op de optimale concentratie (die was vooraf gedefinieerd voordat u de patiënt sera) verdund: toxine een (200 µg/mL) en toxine B (100 µg/mL), pCDTb (200 µg/mL), en gezuiverde native hele SLPs afgeleid van ribotypes 001, 002 en 027 (200 µg/mL).
    Opmerking: Toxine B is verkregen uit een toxine B-uiten stam CCUG 20309 (90 µg/mL).
    1. De positieve controle, lysates van C. albicansen tetanus tetanustoxoïd met de afdrukken buffer bij 100 µg/mL verdund. Ten slotte, Verdun de gezuiverde menselijke immunoglobulin matching van de geteste antilichamenisotype serieel, vanaf 50 µg Mo/mL over 10 verdunningen in de afdrukken buffer te maken van een kalibratiekromme.
  2. Pipetteer 10 µL van de verdunningen in de afdrukken buffer in een 384-well-plate.
  3. De afdekplaat met een plaat zegel en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.

2. printen van Arrays met een Contact Robot

  1. Warmte de pin van de silicium met behulp van de hand-held gasbrander 3 x 2 s en spoel in schoon water 3 x 3 s.
  2. Plaats de microarray plaat in de cartridge laden van de arrayer.
  3. De aminosilane dia's op de dia-lade plaatsen.
    Opmerking: De lade van de dia kunt houden 27 dia's: drie rijen van negen dia's. De dia's in de afdrukstand staand vanaf de linkerzijde van de onderste rij zijn gerangschikt en de rest van de ruimten zijn bedekt met lege dia's om ervoor te zorgen dat alle gaten in de lade van de dia vallen.
    1. Druk op OK en controleer of een vacuüm is ingeschakeld en alle dia's veilig zijn. Laat de dia's in de vochtige omgeving voor ten minste 1 uur vóór het begin van de afdruk.
      Opmerking: De aminosilane dia's worden geleverd in een verzegelde zak met droogmiddel. Eenmaal geopend, moeten elke ongebruikte dia's onmiddellijk worden teruggestuurd naar de exsiccator voor opslag tot de vervaldatum.
  4. De geschikte afdrukken programma opgezet om af te drukken van Clostridium difficile antigenen. Start de TAS Application Suite en de vereiste parameters voor afdrukken uitvoeren-bestand opent vanuit de map 'My Gridding-Runs'. Selecteer Clostridium difficile -bestand voor het afdrukken van alle de Clostridium difficile -antigenen in viervoud.
  5. Bij de te dubbelklikken op het pictogram van de MicroArray op het belangrijkste venster verschijnt een venster met drie-tabbed genaamd 'MicroArraying parameters'.  De drie tabbladen zijn "Bron", "Target", en "Options." De "Bron" tab geeft details hetaantal monsters in de microarray plaat gebruikt. Het tabblad "Doel" toont de details van hoe de dia's worden geladen moeten, waar de matrix moet worden afgedrukt op de dia en bewerken van de dia-indeling (16 subarray formaten). Het tabblad "Opties" toont de details van het wassen protocol en hulpmiddel om te worden gebruikt, bv. wassen na elke voltooide sample. Reinig de silicium-pin tussen monsters te vermijden kruisbesmetting tussen de verschillende monsters.
  6. De programmeeropties bevinden zich onder Opties > Voorkeuren op de werkbalk van de TAS Application Suite uitvoeren. Er zijn 9 tabbladen te doorlopen in deze sectie en als u volledige één tab naar de volgende door erop te klikken. Op de de knop "OK" te klikken vindt u uit "Run voorkeuren." In het tabblad "Algemeen" van de "Run voorkeuren" zijn er een aantal selectievakjes beschikbaar onder deze sectie met betrekking tot hoe het instrument zich gedragen zal wanneer een programma wordt gestart. Vink het vakje "Prime Bad aanvang van run", alle drie wassen stations een reeks korte priming vóór de uitvoering begin zal ondergaan. Check het "Wassen aan begin van run" vak de pin tool zal worden gewassen voordat de eerste bron bezoeken. "Wash ultimo run" het selectievakje de pin tool zal worden gewassen na de laatste bron bezoek. De gebruiker kan instellen het aantal wassen cycli. Start de bevochtiging in het tabblad "Klimaat" van de "Run voorkeuren". De instelling die we gebruiken zijn als volgt: start tarief 55%, run rate 55%, minimum vochtigheid 55%, doel vochtigheid 60%. Start de run niet tot de doelgroep vochtigheid is bereikt, anders de vlekken de verkeerde maat zullen en de bibliotheek zal snel verdampen.
  7. Klik in de menu balk van TAS, op de groene knop Ga.  De run start en periodiek observeren de arrayer tijdens de oplage als bepaalde alles is OK.
    Opmerking: Dit maakt de analyse van 15 monsters parallel op elke dia, zoals een subarray wordt gebruikt als een negatieve controle. Het ontwerp van subarrays wordt bepaald door het nummer van de afgedrukte eiwitten (antigenen) en het nummer van de afgedrukte biologische repliceert.
    Opmerking: Na het afdrukken van elk monster, het hoofd beweegt in de richting de wassen baden om meerdere dompelen van de pin in twee wassen baden met gedestilleerd water en 0.002% Tween 20 voor 1.5 s in elk bad, gevolgd door de pin met ultra pure water spoelen en drogen van de pin in de belangrijkste wash station voor 4 s.

3. opslag van de Arrays

  1. Houd de afgedrukte dia's 's nachts bewaard bij kamertemperatuur in de exsiccator.
    Opmerking: De afgedrukte dia's kunnen worden opgeslagen voor tot een week.

4. array sonderen

  1. Zorgvuldig plaatst afgedrukte dia's in een dia houder van 16 multi goed kamers formaat.
    Opmerking: De kamers, met een diepte van ongeveer 7,5 mm, geven een royale oppervlakte volumeverhouding mengen en wassen stappen te vergemakkelijken.
  2. Toestaan dat alle reagentia opwarmen tot kamertemperatuur vóór gebruik. Tenzij anders is bepaald, voeren de volgende stappen uit bij kamertemperatuur.
  3. Voeg 100 µL van gefilterde 5% bovien serumalbumine tween (BSAT; gebruik een 0,2 µm spuit filter) elk blokkeren, betrekking hebben op de dia's, en broeden ze met schudden 1 h.
  4. Wassen van de dia's 5 x 1 min. elk in 120 µL van fosfaatgebufferde zoutoplossing met tween-20 (PBST; 0,1% Tween) per putje met schudden. Laat niet de dia's uitdrogen.
  5. Ontdooi de serummonsters op ijs gedurende 20 minuten en Verdun elk monster met een commercieel beschikbare antilichaam verdunningsmiddel met achtergrond vermindering van de component (Zie Tabel van materialen).
    1. Optimaliseer de verdunning van het serummonsters volgens de geteste immunoglobulin zoals weergegeven in tabel 2.
  6. 100 µL van de serummonsters verdund overbrengen in alle blokken met uitzondering van één, die zal worden gebruikt als een negatieve controle; Voeg 100 µL van antilichaam verdunningsmiddel alleen aan dit blok. Incubeer de dia's met zachte agitatie voor 1 h.
  7. Wassen van de dia's 5 x 3 minuten, elk in 120 µL van PBST (0,1% Tween) per putje met schudden.
  8. Voeg 100 µL van een biotinyleerd geit anti-menselijke antilichaam verdund met antilichaam verdunningsmiddel.
    1. De verdunning van het secundaire antilichaam volgens de geteste immunoglobulin optimaliseren zoals beschreven in tabel 2. Dekking van de dia's en hen met zacht schudden voor 1 h uit te broeden.
  9. Wassen van de dia's 5 x 3 minuten, elk in PBST 120 µL per putje met schudden.
  10. Voeg 100 µL van daar Cy5 aan elk blok verdund bij 1:2000 in 5% BSA. Betrekking hebben op de dia's met folie om hen te beschermen tegen licht terwijl schudden voor de 15 min met zachte agitatie.
  11. De dia's 5 x 1 min. elk in 120 µL van PBST per putje met schudden, wassen, gevolgd door 2 wasbeurten van 1 min in PBS alleen met schudden.
  12. Draai de dia's gedurende 5 minuten bij 300 x g om ze te drogen.
  13. Houd de dia's in een donkere kast voor transport en opslag bij kamertemperatuur.
  14. Ga verder met het scannen van de arrays onmiddellijk om te zorgen voor samenhang van het signaal na indringende.
    Opmerking: Echter peilden dia's kunnen worden opgeslagen in het donker en gescand binnen één week na het sonderen.

5. het scannen van de Arrays

  1. Zet de laserscanner (Zie Tabel van materialen) 30 min voordat u gaat scannen om op te warmen met de laser. Uploaden van software van de scanner en sluit de computer aan op de scanner.
  2. Een dia met het gezicht van de bedrukte zijde omhoog in de scanner plaatsen totdat het spel lampje stevige groen.
  3. Druk op de knop instellingen en de volgende instellingen aanpassen bij het scannen van dia's als volgt: scanmodus, mediaan; Verwerving, 635 Overname modus, handboek; Winst, 20; Power, Low; Dia Type, labelloze dia; Focus, autofocus. Automatisch scrollen uit te schakelen en Barcode Reading ingesteld op Pixel grootte 10 en 35 scannen.
  4. De resulterende afbeeldingen opslaan als 16-bits grayscale meerdere afbeelding TIFF-indeling. Druk op de knop Importeren raster en selecteer de juiste matrix-lijst.
    Opmerking: De matrix een overzicht van de grootte en de positie van de subarrays en de namen van de afgedrukte stoffen die zijn gekoppeld aan elke functie-indicator.
    1. Het raster aan de vlekken op de dia uitlijnen
  5. Het analyseren van de beelden door op de knop van de kwantificering proces voor het meten van de fluorescentie signaal intensiteiten voor elke vlek en de resultaten opslaan in een indeling van de tekst genaamd GenePix resultaten (GPR).
    Opmerking: De GPR-bestand bevat de variabelen van het localisatie en identificatie van de antigeen-doelstellingen op de array en ook de intensiteit van de fluorescentie van de mediaan en de lokale achtergrond die de antilichaam binding vertegenwoordigt signaal waarden van elke vlek.

6. de gegevensanalyse

  1. Bereken de mediaan voor de duplo's van elk antigeen na achtergrond aftrekken met behulp van een gratis microarray analysesoftware genaamd omgekeerde fase eiwit matrix (RPPA) analyzer, een module binnen de R statistische taal op CRAN36.
  2. De standaard curve uitzetten en interpoleren van de signalen van elk antigeen ten opzichte van de immunoglobuline standaard curve met behulp van commerciële wetenschappelijke grafieken en statistieken software (Zie Tabel of Materials) voor het berekenen van de antilichaam-niveaus.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 illustreert een stroomdiagram met een beschrijving van de belangrijkste stappen in het protocol beschreven. Figuur 2 toont Spearman correlatie proeven waarmee belangrijke overeenkomst tussen microarray en ELISA voor IgG- en IgA anti-toxine A en B niveaus in de patiënt testsera is aangetoond. Figuur 3 toont differentiële IgG- en IgA antilichaam-klasse specifiek antilichaam reacties op het tox...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol hebben we aangetoond dat microarray is een geschikt platform voor het definiëren van humorale immuunreacties aan C. difficile eiwit antigenen patiënt sera (cijfers 3 en 6) en commerciële preparaten van IVIg (Figuur 5). We hebben ook aangetoond dat de techniek van microarray presteert goed vergeleken met conventionele ELISA (Figuur 2) en uitstekende reproduceerbaarheid, toont met intra - en intersite - as...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gesteund door een Hermes Fellowship aan Ola Negm en Tanya Monaghan en via afzonderlijke financiering van het centrum van Nottingham spijsvertering ziekten en de NIHR Nottingham spijsvertering ziekten Biomedical Research Centre.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BioRobotics MicroGrid II arrayerDigilab, Malborough, MA, USAN/AContact arrayer gebruikt voor het geautomatiseerd spotten van de antigenen op de slides.
Scanner InnoScan 710.InnopsysN/AEen fluorescente microarray slide scanner met een rode (Cy5) laser om de reactie te lezen.
MAPIX software versie 7.2.0InnopsysN/AMeet de signaalintensiteiten van de spots.
Silicon contact pinParallel Synthesis TechnologiesSMT-P75Print de monsters op de slides.
Thermo Scientific Nalgene DesiccatorThermo Scientific41102426Om de nieuwe en bedrukte slides op te slaan.
384-well plateGenetixX7022UNOm de antigenen voor te bereiden.
Plate coverSigma Aldrich, UKCLS6570-100EAOm verdamping van de monsters te verminderen.
Aminosilane slidesSchott, Duitsland1064875De gekozen slide voor het bedrukken van de antigenen.
Slide holdersGraceBio Labs, USA204862Deel de slides in identieke 16 subarrays. Deze houders zijn herbruikbaar, verwijderbaar, lekbestendige wells.
Candida albicans lysateNIBSCPR-BA117-SPositieve controle
Tetanus ToxoidAthens Research and Technology04/150Positieve controle
Immunoglobulin G (IgG), Normaal Menselijk PlasmaAthens research and technology16-16-090707Gezuiverd Natuurlijk Menselijke Immunoglobulin G IgG, Menselijk Plasma.
Immunoglobulin G1 (IgG1), Normaal Menselijk PlasmaAthens research and technology16-16-090707-1Gezuiverd Natuurlijk Menselijke Immunoglobulin G1 IgG1, Menselijk Plasma.
Immunoglobulin G2 (IgG2), Normaal Menselijk PlasmaAthens research and technology16-16-090707-2Gezuiverd Natuurlijk Menselijke Immunoglobulin G2 IgG2, Menselijk Plasma.
Immunoglobulin G3 (IgG3), Normaal Menselijk PlasmaAthens research and technology16-16-090707-3Gezuiverd Natuurlijk Menselijke Immunoglobulin G3 IgG3, Menselijk Plasma.
Immunoglobulin G4 (IgG4), Normaal Menselijk PlasmaAthens research and technology16-16-090707-4Gezuiverd Natuurlijk Menselijke Immunoglobulin G4 IgG4, Menselijk Plasma.
Immunoglobulin A (IgA), Menselijk PlasmaAthens research and technology16-16-090701Gezuiverd Natuurlijk Menselijke Immunoglobulin A (IgA), Menselijk Plasma.
Immunoglobulin A1 (IgA1), Menselijk Myeloom PlasmaAthens research and technology16-16-090701-1MGezuiverd Natuurlijk Menselijke Immunoglobulin A1 (IgA1), Menselijk Plasma.
Immunoglobulin A2 (IgA2), Menselijk Myeloom PlasmaAthens research and technology16-16-090701-2MGezuiverd Natuurlijk Menselijke Immunoglobulin A2 (IgA2), Menselijk Plasma.
Immunoglobulin M (IgM), Menselijk PlasmaAthens research and technology16-16-090713Gezuiverd Natuurlijk Menselijke Immunoglobulin M (IgM), Menselijk Plasma.
Biotinylated Goat Anti-Human IgG Antibody, gamma keten specifiekVector LabsBA-3080Geit anti- menselijk IgG (γ-keten specifiek)-biotine antilichaam reageert specifiek met menselijk IgG maar niet met andere immunoglobulinen.
Muis Anti-Menselijk IgG1 Hinge-BIOTSouthern Biotec9052-08Geit anti- menselijk IgG1 biotin antilichaam reageert specifiek met menselijk IgG1 maar niet met andere immunoglobulinen.
Muis Anti-Menselijk IgG2 Fc-BIOTSouthern Biotec9060-08Geit anti- menselijk IgG2 -biotine antilichaam reageert specifiek met menselijk IgG 2maar niet met andere immunoglobulinen.
Muis Anti-Menselijk IgG3 Hinge-BIOTSouthern Biotec9210-08Geit anti- menselijk IgG3-biotine antilichaam reageert specifiek met menselijk IgG3 maar niet met andere immunoglobulinen.
Muis Anti-Menselijk IgG4 pFc'-BIOTSouthern Biotec9190-08Geit anti- menselijk IgG-biotine antilichaam reageert specifiek met menselijk IgG maar niet met andere immunoglobulinen.
Anti-Menselijk IgA, alpha keten specifiek, gemaakt in geit - GebiotiniseerdVector LabsBA-3030Geit anti- menselijk IgG -biotine antilichaam reageert specifiek met menselijk IgG maar niet met andere immunoglobulinen.
Muis Anti-Menselijk IgA1-BIOTSouthern Biotec9130-08Geit anti- menselijk IgG -biotine antilichaam reageert specifiek met menselijk IgG maar niet met andere immunoglobulinen.
Muis Anti-Menselijk IgA2-BIOTSouthern Biotec9140-08Geit anti- menselijk IgG -biotine antilichaam reageert specifiek met menselijk IgG maar niet met andere immunoglobulinen.
Muis Anti-Menselijk IgM-BIOTSouthern Biotec9020-08Geit anti- menselijk IgG-biotine antilichaam reageert specifiek met menselijk IgG maar niet met andere immunoglobulinen.
0.2 mm spuitfilterThermo scientific723-2520Filter de 5% BSA.
Bovine Serum Albumine (BSA)Sigma Aldrich, UKA7284Gebruik 5% BSA om de slides te blokkeren.
AntilichaamverdunningDako, UKS3022Om het serum en het secundaire antilichaam te verdunnen.
Streptavidine Cy5eBioscienceSA1011Detectie van de immuunreactie.
Gezuiverd geheel C. difficile toxine A en B (toxinotype 0, stam VPI 10463, ribotype 087)Toxins Group, Public Health EnglandNA
Gezuiverd geheel C. difficile toxine B (CCUG 20309 toxine B alleen expresserende stam)Toxins Group, Public Health EnglandNA
Precursorvorm van B-fragment van binair toxine, pCDTbUniversity of BathNAGeproduceerd in E. Coli uit geheel synthetisch recombinant genconstruct. Aminozuursequentie gebaseer

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
  2. Monaghan, T. M., et al. High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection. Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).
  3. Negm, O. H., et al. Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration. Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).
  4. Monaghan, T., et al. OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection. Gut. 66, Suppl. 2 31(2017).
  5. Bacon, A. E. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).
  6. Viscidi, R., et al. Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).
  7. Salcedo, J., et al. Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis. Gut. 41 (3), 366-370 (1997).
  8. Abougergi, M. S., Kwon, J. H. Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review. Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).
  9. Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis. Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).
  10. Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).
  11. Solomon, K., et al. Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).
  12. Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).
  13. Leav, B. A., et al. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI). Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).
  14. Drudy, D., et al. Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).
  15. Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection. Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).
  16. Wilcox, M. H., et al. Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection. The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).
  17. Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. Vaccines against Clostridium difficile. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).
  18. Ghose, C., Kelly, C. P. The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection. Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).
  19. Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections. Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).
  20. Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
  21. Delehanty, J. B., Ligler, F. S. Method for printing functional protein microarrays. BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).
  22. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21(2013).
  23. Huang, Y., Zhu, H. Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).
  24. Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
  25. Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).
  26. Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).
  27. Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection. Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).
  28. Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).
  29. Crompton, P. D., et al. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).
  30. Khodakov, D. A., et al. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).
  31. Ryabinin, V. A., et al. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One. 6 (4), 17529(2011).
  32. Zhu, H., et al. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).
  33. Cleton, N. B., et al. Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers. PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580(2015).
  34. Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies. PLoS One. 8 (9), 73842(2013).
  35. Zhou, F., et al. Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scientific Reports. 5, 15349(2015).
  36. Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data. Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).
  37. Monaghan, T. M., et al. Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis. PLoS One. 8 (9), 74452(2013).
  38. Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. Current microarray surface chemistries. Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).
  39. Wellhausen, R., Seitz, H. Facing current quantification challenges in protein microarrays. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).
  40. Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton. (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Clostridium difficile Antibody DetectionAntigen specific Antibody ResponseSerum Sample AnalysisArray Printing ProcedureFluorescence Intensity MeasurementELISA Correlation AnalysisIsotype Subclass DeterminationToxin A Toxin B DetectionPatient specific Immunotherapy Optimization

Gerelateerde artikelen