Methodenartikel

Isolatie van menselijke endotheliale cellen van normale Colon en colorectaal carcinoom - een verbeterde Protocol

18.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57400

⸱

4 april 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Molecular and Experimental Surgery, Department of Surgery, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Surgery, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 3Division of Nephropathology, Department of Pathology, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 4Department of Pathology, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Endotheliale cellen van de tumor zijn belangrijke determinanten van de communicatie van de tumor en het verloop van de ziekte. Hier, wordt een protocol voor de isolatie van zuiver en levensvatbare endotheliale cellen van menselijke colorectaal carcinoom en normale dikke darm moet worden gebruikt in drugsonderzoek testen en pathogenese beschreven.

Samenvatting

Primaire cellen van menselijke carcinomen geïsoleerd zijn waardevolle hulpmiddelen om te identificeren van pathogene mechanismen bij te dragen tot de ontwikkeling van de ziekte en de progressie. In het bijzonder endotheliale cellen (EG) vormt de binnenzijde van de vaartuigen, rechtstreeks deelnemen aan de zuurstoftoevoer, nutriënten aan,- en afvoer van afvalstoffen naar en van tumoren, en daardoor opvallend betrokken zijn bij de Grondwet van de tumor communicatie (TME). Endotheliale cellen van de tumor (TECs) kunnen worden gebruikt als cellulaire biosensoren voor de communicatie van de intratumoral opgericht door communicatie tussen tumor en stromale cellen. TECs dienen ook als doelstellingen van de therapie. Dienovereenkomstig, in cultuur toestaan deze cellen studies op mechanismen van reactie of resistentie tegen de anti-angiogenic behandeling. Onlangs bleek dat TECs geïsoleerd van menselijke colorectaal carcinoom (CRC) tentoonstelling geheugen-achtige effecten op basis van de specifieke TME ze van zijn afgeleid. Bovendien, deze TECs actief bijdragen aan de oprichting van een specifieke TME door de afscheiding van verschillende factoren. Bijvoorbeeld, afscheiden in een prognostically gunstige Th1-TME TECs de anti-angiogenic tumor-onderdrukkende factor uitgescheiden eiwitten, zure en rijk aan cysteïne-achtige 1 (SPARCL1). SPARCL1 regelt vaartuig homeostase en remt tumor celproliferatie en -migratie. Vandaar, culturen van pure, levensvatbare TECs geïsoleerd van menselijke solide tumoren zijn een waardevol instrument voor functionele studies over de rol van het vaatstelsel in tumorvorming. Hier, wordt een nieuwe up-to-date protocol voor de isolatie van primaire EG uit de normale dikke darm evenals CRC beschreven. De techniek is gebaseerd op mechanische en enzymatische weefsel spijsvertering, immunolabeling en fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS)-sorteren van triple-positieve cellen (CD31, VE-cadherine, CD105). Met dit protocol, levensvatbare TEC of normale endothelial (NEC) celculturen kunnen worden geïsoleerd uit weefsels van de dikke darm met een slagingspercentage van 62.12% Wanneer onderworpen aan FACS-sorteren (41 EG reinculturen van 66 weefselsteekproeven). Dienovereenkomstig, is dit protocol biedt een robuuste aanpak om te isoleren van de menselijke EG culturen van normale colon en CRC.

Inleiding

De communicatie van de tumor (TME) wordt gedefinieerd als een nauwe interactie van tumorcellen met de stroma tumor, die uit cellen zoals endotheliale cellen (EG), pericytes, fibroblasten, zachte spiercellen of immuuncellen bestaat. De communicatie tussen deze cellulaire compartimenten kan worden aangedreven door paracrine factoren (bijvoorbeeld angiogenic groeifactoren, cytokines), door de extracellulaire matrix, of directe cel contactpersoon. Het stromale compartiment kan bevorderen of te neutraliseren tumor initiatie of progressie, afhankelijk van de specifieke TME opgericht.

De mogelijkheid van een tumor te verbinden met het informatiesysteem voor de zeescheepvaart is sleutel tot de progressie en de metastase van de ziekte. Het informatiesysteem voor de zeescheepvaart kan de tumor hoofdzakelijk toegang te krijgen tot de levering van zuurstof en voedingsstoffen, alsmede de verwijdering van afvalproducten1,2,3. EG vormen de binnenzijde van de vaartuigen, en zijn daarom belangrijke cellulaire componenten die actief aan dit proces deelnemen. Het is algemeen bekend dat endotheliale cellen van de tumor (VEG) anders dan hun overeenkomstige normale endotheliale cellen (NEC) door vele functies zoals gestoord hiërarchie van de vasculaire boom, vaartuig leakiness zijn, of verlaagd van rijping, zoals wordt geïllustreerd door een beperkt aantal pericytes/muurschildering cellen die zijn slechts losjes gekoppeld aan de EG-4.

Vandaar, TECs zijn waardevolle cellulaire hulpmiddelen om te studeren carcinogenese. TECs werden voornamelijk ter bevordering van groei en progressie van de tumor3beschouwd. TECs kunnen dus worden gebruikt als biosensoren waarmee het toezicht op en de identificatie van pathogene processen die leiden, te bevorderen of te neutraliseren tumorvorming. Bovendien zijn ze therapeutische doelen in de kliniek5. Bijgevolg, geïsoleerde TECs en bijbehorende NEC kunnen ook worden gebruikt als instrumenten te begrijpen van de mechanismen van de reactie of resistentie tegen de anti-angiogenic behandeling.

In het verleden, we ontwikkelde een protocol om te isoleren van deze cellen6,7 en geïdentificeerd dat TECs niet alleen verschillend van NEC zijn, maar ook van elkaar verschillen, afhankelijk van de TME ze waren afgeleid van8. Door deze aanpak, werd aangetoond dat TECs in bepaalde TMEs actief tumorgroei en progressie kunnen tegengaan door afscheiding van anti-angiogenic tumor-onderdrukkende eiwitten zoals SPARCL1. Hieruit bleek dat TECs actief bij te tot de oprichting van een prognostically gunstige TME in menselijke colorectaal carcinoom (CRC)8 dragen zijn.

Eerdere studies probeerde te isoleren van de menselijke TECs van solide tumoren. Een belangrijk doel van deze studies was, bijvoorbeeld, de identificatie van nieuwe tumor endothelial cel markeringen (TEMs)9. Een strategie voor onmiddellijk gebruik van TECs na laser microdissection werd toegepast om te voorkomen dat wijziging of verlies van het fenotype van de VEG in cultuur. Vervolgstudies geïdentificeerd echter een contaminerende bevolking van muurschildering cellen als een serieus nadeel van deze aanpak10. Onze lab was de eerste om een protocol waardoor het isolement van pure, levensvatbare TECs van menselijke CRC patiënten-6,7. Een aanpak met meerdere rondes van de selectie (MACS) van de magnetische cel van het TECs dat gegarandeerd hoge zuiverheid van de geïsoleerde culturen van de EG gekozen. Deze aanpak vereist echter een relatief lange teeltduur (gemiddeld 6 weken), waardoor het risico van cultuur-geïnduceerde artefacten steeg. Vandaar, in de volgende stap, het doel was om de teeltduur tussen chirurgie en de oogst van de eerste reincultuur. Om dit te bereiken, een verbeterde protocol met een gecombineerde mechanische en enzymatische gebaseerde weefsel dissociatie van de oorspronkelijke tumor, gevolgd door fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS)-sorteren van triple-geëtiketteerden EG, werd ontwikkeld. Dit verminderde isolatie tijd gemiddeld tot drie weken, resulterend in TEC en NEC reinculturen met verhoogde levensvatbaarheid voor functionele studies. Isolatie van levensvatbare TEC en NEC reinculturen uit menselijke weefsels met hoge slagingspercentages kan openen nieuwe mogelijkheden voor patiënt-specifieke drug testende tijdens de ontwikkeling van geïndividualiseerde therapie regimes. De isolatie-aanpak wordt beschreven in de volgende paragrafen.

Protocol

Het proces van isolement is goedgekeurd door de lokale ethische commissie van de Universiteit medisch centrum Erlangen (#159_15 B, TuMiC-studie). Patiënt inclusie criteria waren als volgt: CRC, UICC fase-IV, geen geschiedenis van inflammatoire darmziekte, en geen neoadjuvante behandeling.

1. operatie en voorbereiding van weefsel voor eencellige isolatie

  1. Specimen door chirurgie te verkrijgen door een CRC-patiënt (carcinoma weefsel > 0,5 g, centraal niet-necrotische tumor; normaal weefsel van de dikke darm > 10 cm verre van tumor site).
  2. Het verkregen weefsel stukken zijn meestal < 1 g voor de carcinoom, maar > 1 g voor de normale dikke darm. Als stukken > 1 g worden verkregen, opgesplitst in meerdere 1 g stukken met behulp van een verse scalpel voor verdere verwerking van het weefsel.
    Opmerking: Als de tumor weefsel stuk lager dan 0,5 g vanaf het begin is, het isolement meestal mislukt.
  3. Verzamel verse niet vastgelegde weefsel stukken met behulp van steriele pincet in 40 mL ijs koud Hanks evenwichtig zoutoplossing (HBSS) aangevuld met penicilline/streptomycine/amphothericin B (1% HBSS-pen/strep/ampho) in 50 mL centrifuge buizen en breng ze snel op de laboratorium.
    Opmerking: Weefsel van de dikke darm is vaak sterk verontreinigd met bacteriën/schimmels vanaf het begin. Tijdens de hele procedure van isolatie, moet pen/strep/ampho worden toegevoegd aan alle oplossingen om het elimineren van contaminerende organismen.
  4. Wassen elk stukje weefsel minstens 4 keer met 40 mL ijs koud HBSS-pen/strep/ampho (zie stap 1.3) in 50 mL centrifuge buizen door de stukjes weefsel opeenvolgend van een centrifugebuis aan de volgende buis met behulp van steriele pincet.
    1. Schone pincet na elke stap met 70% ethanol.
    2. Gebruik aparte pincet voor de carcinoom en normale colon weefsel stukjes.
    3. Weeg alle weefsel stukken.
      Opmerking: Plaats geen weefsel stukken direct op een schaal voor het wegen. Na het wassen, wegen de laatste centrifugebuis met het weefsel vóór en na het invoeren van de stukjes weefsel. Bereken het gewicht van individuele weefsel stukken door aftrekking.

2. productie van eencellige schorsing

Opmerking: Het wordt aanbevolen om te houden van het weefsel gehydrateerd te allen tijde.

  1. Als dit bestaat, bijgevoegde vet, andere niet-tumorous weefsel of verwijderen potentieel necrotisch weefsel delen van het model van de operatie door de overdracht van de stukken van het weefsel in een steriele cel cultuur petrischaal met steriel pincet.
    1. Houd de stukken van de weefsel gehydrateerd op alle tijden door toevoeging van 3-5 mL HBSS-pen/strep/ampho.
    2. Trim de stukken van de weefsel met behulp van een verse steriel scalpel (Figuur 1). Raadpleeg een patholoog in het geval dat weefsel identificatie is onduidelijk.
  2. Resterende weefsel in kleine stukjes gehakt (ongeveer 2 × 2 × 2 mm3) met behulp van een verse scalpel met een gekromd lemmet. Overdracht van stukken van de weefsel met steriel pincet in weefsel dissociatie buizen (bijvoorbeeld, gentleMACS C buizen) vooraf gevuld met voorverwarmde (37 ° C) cel kweekmedium (Dulbecco´s modified eagle middellange [DMEM] Basaal medium) volgens de fabrikant instructies.
    Opmerking: Probeer te gebruiken de scalpel als een rockende hulpmiddel. Knijp de cellen niet om weefselschade te voorkomen.
  3. Digest/distantiëren weefsel stukken met behulp van de dissociator van een weefsel (zoals gentleMACS Octo Dissociator) in combinatie met de tumor dissociatie kit voor menselijk weefsel met behulp van de instructies van het programma "37C_h_TDK_1" na de manufacturer´s.
  4. Centrifugeer dissociatie buizen voor 1 min bij 300 x g bij kamertemperatuur (RT).
  5. Voeg 10 mL van de voorverwarmde (37 ° C) DMEM aangevuld met 0,5% foetale runderserum (FBS) (DMEM-Low) aan elke buis met behulp van een precisiepipet serologische en filteren van de celsuspensie met behulp van een cel zeef (100 µm poriegrootte) op de top van een 50 mL centrifugebuis waarbij de cel vering op de top van het filter.
  6. Voeg 10 mL voor DMEM-Low opnieuw aan elke MACS-buis door een serologische pipet en overdracht van resterende cellen naar de zeef van de cel op de top van de centrifugebuis van 50 mL.
  7. De zeef van de cel een keer met een extra 10 mL DMEM-laag-medium met behulp van een precisiepipet serologische wassen.
  8. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 7 minuten bij 300 x g bij RT en weggeworpen.
  9. Resuspendeer de cellen in 5 mL van voorverwarmde endothelial Basaal medium (EBM) -2-microvasculaire (MV)-medium (Lonza) aangevuld met pen/strep/ampho in de dezelfde 50 mL centrifugebuis.
  10. Celsuspensie van de plaat in een T-25 cel cultuur maatkolf van vooraf gecoat 's nachts met 1,5% gelatine-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C met 5% CO2.
  11. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2, de cellen twee keer wassen zorgvuldig met ongeveer 5 mL PBS en voeg 5 mL van verse medium.
  12. De cellen bij 37 ° C en 5% CO2 tot 80-90% confluentie (gewoonlijk 5-7 dagen) met 48 h intervallen van mediumverversing cultiveren.

3. FACS-sorteren van endotheliale cellen

Opmerking: Probeer te vermijden dat verliezen van cellen op elk gewenst moment, bijvoorbeeld door de kleuring procedure incubatie van de cellen in een buis van één reagens te beperken.

  1. Loskoppelen van cellen met 1 mL accutase (ongeveer 10 min), en voeg 4 mL van voorverwarmde (37 ° C) EBM-2-MV medium.
  2. Het bepalen van het aantal cellen met behulp van een geautomatiseerde cel tellen apparaat (bereik 10 tot 25 µm).
  3. Centrifugeer celsuspensie voor 4 min met 250 x g bij RT en weggeworpen.
  4. Resuspendeer de cellen in voorverwarmde FACS-buffer (1 x PBS, 2,5% bovien serumalbumine [BSA], 5 mM EDTA pH 8.0, 10 µM Y-27632) volgens cel tellen (5 x 106/mL).
  5. Toevoegen van FACS-kleuring antilichamen volgens cel graaf/FACS-buffervolume: CD31-FITC (100 µL/mL = 1/10), CD144/vasculaire endothelial (VE) - cadherine - PE (100 µL/mL = 1/10), CD105-APC (25 µL/mL = 1/40), meng en incubeer gedurende 7 minuten op RT beschermd tegen licht; zachtjes flick en incubeer gedurende een ander 8 min (voor een totale incubatietijd van 15 min).
  6. Voeg 2 mL FACS-buffer tot de schorsing van de gelabelde cel met behulp van een precisiepipet serologische.
  7. Centrifugeer gedurende 4 min met 250 x g bij RT en weggeworpen.
  8. Twee keer wassen door toevoeging van 2 mL van FACS-buffer, en voeren een latere centrifugeren voor 4 min bij 250 x g bij RT en weggeworpen.
  9. Resuspendeer de cellen in 500 µL voorverwarmde EBM-2-MV-pen/strep/ampho en overdracht cellen naar het instrument FACS-sorteren.
    1. Endotheliale cellen zal snel sterven tijdens het sorteren proces als het FACS-instrument wordt gekoeld. Daarom voeren sorteren van endotheliale cellen bij RT en onmiddellijk overbrengen in de verzamelde cellen de 37 ° C incubator daarna.
      Opmerking: Het FACS-instrument is meestal niet-steriel!
  10. Sorteren/verzamelen triple-positieve cellen rechtstreeks in een cel cultuur schotel (bijvoorbeeld 24-well plaat vooraf gecoat 's nachts met 1,5% gelatine-PBS) gevuld met 0,5 mL voorverwarmde verse voedingsbodem (EBM-2-MV-pen/strep/ampho).
    Opmerking: Controleer celsuspensie na het sorteren met behulp van een microscoop. Als de cellen cluster samen, proberen te verkrijgen van een zelfs cel distributie in de cel cultuur schaal door hen langzaam mengen of het toevoegen van medium.
  11. Cellen tot 90-100% confluentie met 48 h intervallen van mediumverversing cultiveren en de cellen uit te breiden tot de grootte van de schotel gewenste cultuur (24-well plaat → 12 well-plate → 3,5 cm schotel → T-25 → T-75).

4. de oogst en karakterisering van Pure endotheliale cellen

  1. Oogsten van cellen op 90-100% confluentie en karakteriseren ze door een geschikte methode (bijvoorbeeld, FACS, cytochemie, kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) of endothelial cel functie testen7,8).
  2. Analyseren van geïsoleerde cellen met ongeacht welke methode van karakterisering is gekozen.

Resultaten

Het isolement van NEC en TEC van menselijke CRC door een gecombineerde weefsel van de mechanische/enzymatical dissociatie, gevolgd door de latere CD31/CD105/VE-cadherine-driven FACS-sorteren wordt beschreven hier(Figuur 1). Dit protocol vertegenwoordigt een verbeterde protocol met een beperkte tijdsduur tot de eerste oogst van pure, levensvatbare endotheliale cellen ten opzichte van de vorige MACS gebaseerd protocol7.

NEC en TEC waren geïsoleerd uit menselijke CRC met behulp van de volgende stappen: (1) generatie van de schorsing van een eencellige door gecombineerde mechanische en enzymatische weefsel dissociatie en groei van deze cellen te 80-90% confluentie (Figuur 1), (2) triple labeling van de EG door CD31/CD105/VE-cadherine fluorescerende-coupled antilichamen, en (3) FACS-sorteren van de respectieve triple-positieve cellen(Figuur 2). Van de nota, een belangrijke stap voor het succes van de procedure van de isolatie en de levensvatbaarheid van de cellen is te snel onverminderd het specimen chirurgie de isolatie-procedure (generatie van één celsuspensie < 1 uur na resectie). Met behulp van FACS-sorteren, een gemiddelde van 12.500 TEC (n = 12) en 17.800 NEC (n = 12, Figuur 2B, links) vertegenwoordigen gemiddeld 3,6 en 5,6% van de bevolking van de cel Totaal (Figuur 2B, rechts) zou kunnen worden geïsoleerd. Vervolgens werden de cellen uitgebreid tot T-75 (zogenaamde passage 1) en geoogst of verder verwerkt voor analyse. Van de nota, met behulp van de vorige MACS gebaseerd protocol, een gemiddelde isolatie succes van 49.6% werd bereikt (n = 58 pure TECs van n = 117 patiënten8) met pure EG culturen beschikbaar gemiddeld 6 weken na de operatie. Gebruik het nieuwe FACS gebaseerde protocol beschreven hier, de eerste EG-reinculturen werden verkregen gemiddeld 3 weken na de operatie met een slagingspercentage van de isolatie van 62.1% (n = 41 EG reinculturen verkregen n = 66 enkele cellen schorsingen onderworpen aan FACS-sorteren). Dus werd een verhoging van het tarief van de isolatie met 12,5% bereikt in parallel met een daling van de teeltduur van 6 tot 3 weken. Deze verlaging van de teeltduur geleid tot verbeterde levensvatbaarheid en verlengd de levensduur vergezeld door minder blootstelling aan de inductie van potentiële cultuur-afhankelijke artefacten van de gevestigde culturen.

Karakterisering van de zuiverheid van de EG werd eerst uitgevoerd door CD31-cytochemie (Figuur 3A). Mochten de culturen verstoken van CD31-negatieve cellen (Figuur 3A, VEG en NEC), werden ze onderworpen aan een meer gedetailleerde cel typen door omgekeerde transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) (Figuur 3B). Celtype specifieke primers voor EG (CD31, CD105, VE-cadherine en von Willebrand factor [vWF]), leukocyten (CD45), epitheliaale cellen (cytokeratin [CK] -20) en vlotte spier cellen/fibroblasten (desmin) werden gebruikt (Figuur 3B). Met behulp van deze qPCR gebaseerde cel te typen, een mogelijke besmetting van de culturen van de EG door andere cellen in het bereik van 0.1 - 2%, afhankelijk van het celtype, kunnen gedetecteerde8.

Met name rapporteerde wij eerder een preferentiële verlies van vWF eiwituitdrukking in TEC culturen ten opzichte van hun bijbehorende NEC culturen7. Deze bevindingen konden worden bevestigd met het protocol van de nieuw opgerichte isolatie (Figuur 3C, Ct verlies NEC-TEC betekenen = 0.687, p = 0.173, gepaarde t-test). Culturen met succes het passeren van deze kwaliteitscontroles werden getest op mycoplasma infectie en vervolgens gebruikt voor verdere experimenten.

figure-results-1
Figuur 1 : Pure endotheliale cellen kunnen worden geïsoleerd uit menselijke normale colon en CRC gesorteerd FACS. (A) Flow chart van de essentiële stappen van het proces van de isolatie EG. (B) vetweefsel (geel), andere niet-tumorous onderdelen, of potentieel necrotisch weefsel onderdelen (bruin) werden verwijderd uit de chirurgie monster (linker- en middelste deelvenster) en de tumor was uiteengevallen in blokjes van 2-3 mm kant lengte voorafgaand aan (dissociatie) weefsel rechter paneel). (C) de eencellige schorsing opgehaald nadat weefsel dissociatie (linkerdeel) was gedurende 24u in cel cultuur gerechten geïncubeerd. Vervolgens, niet-aanhanger cellen werden verwijderd door het zachte wassen met PBS (het middelste deelvenster) en de cellen werden verbouwd tot 80-90% confluentie voorafgaand aan FACS-sorteren (rechtervenster). Beelden van het lagere paneel (C) werden verworven door fase contrast microscopie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2 : Gemiddeld 3,6-5,6% van de eencellige schorsing geïsoleerd van menselijke CRC patiënten en triple-positieve EC. gesorteerd op FACS werden (A) NEC en TEC waren FACS-gesorteerd met behulp van een drievoudige labeling van de cellen met anti-CD31 - CD105 en -VE-cadherine antilichamen. (B) een gemiddelde van 12.500 TECs (n = 12) en 17.800 NEC (n = 12) kunnen worden geïsoleerd uit menselijke normale colon of CRC via FACS-sorteren (CD31, CD105 en VE-cadherine-positieve cellen, deelvenster links), die gemiddeld 3,6 en 5,6% (rechtervenster) van de totale cel vertegenwoordigt bevolking werkzaam. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3 : NEC en TEC van menselijke CRC express typische endothelial cel markeringen. Normale endotheliale cellen van de dikke darm (NEC, n = 10) en endotheliale cellen van de tumor (TEC, n = 10) zijn van menselijke CRC CD31 (EG marker)-, CD105 (EG marker)-, VE-cadherine (EG marker)-, vWF (EG marker) - positieve en CK20 (CRC cel marker)-, desmin (fibroblast/SMC marker)-, CD45 () leukocyten marker)-zoals bepaald door (A) CD31-immunocytochemie negatieve (positieve cellen = rood) en (B) RT-qPCR (gegevenspunten onder de stippellijn zijn gedetecteerd als negatieve monsters). (C) vWF expressie zoals bepaald door RT-qPCR voor overeenkomstige TEC/NEC monsters uit de dezelfde patiënten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

Hoofdzakelijk, zijn drie verschillende methoden tewerkgesteld tot nu toe om te isoleren van zuiver en levensvatbare NEC en TECs van solide weefsels, namelijk (1) immunomagnetic verrijking, (2) laser microdissection, en (3) FACS-sorteren van de EG-breuk. In de meeste publicaties, verrijking van de immunomagnetic van de cellen na generatie van een eencellige schorsing door mechanische desintegratie gebruikte11,12,13was. Bijvoorbeeld, immunomagnetic zuivering van menselijke dermale microvasculaire EG (HDMEC) door E-selectine antilichamen na tumor necrose factor (TNF)-α behandeling van neonatale foreskins13 is gemeld voor de isolatie van menselijke EG van glioma door weefsel verteren, percoll verloop en selectie met behulp van anti-CD31/CD105 en VE-cadherine-antistoffen12, of door anti-CD105 van menselijke antilichamen breast carcinoma11. Protocollen die laser microdissection of FACS-sorteren in dienst minder vaak gemeld. Laser microdissection werd gebruikt, bijvoorbeeld om te identificeren van potentiële pan-tumor endothelial cel markeringen (TEMs) in EG afgeleid van menselijke colorectal carcinoom met analyse van de cellen onmiddellijk na dissectie9. FACS-sorteren met behulp van anti-CD31-antistoffen werd succesvol gebleken voor de isolatie van de EG-breuk van ongedifferentieerde menselijke embryonale14van de cellen van de stam.

Deze benaderingen hebben verschillende voordelen en nadelen die moet worden beschouwd. De voordelen voor de immunomagnetic gebaseerde benadering zijn dat geen ingewikkelde apparatuur vereist is de selectie elk gewenst moment plaatsvinden kan en de verrijking van de cel is snel (ongeveer 15 min) in vergelijking met FACS-sorteren (ongeveer 1 h). Het gebrek aan matrix voor een langere periode van tijd kan leiden tot celdood van EG door anoikis. Toevoeging van de rho kinase inhibitor Y-27632 aan de buffer FACS werkte dus, om te voorkomen dat de cel anoikis15.

De nadelen van immunomagnetic verrijking zijn dat meerdere rondes van selectie vereist met het oog op zuiverheid boven 99%. Cel teelt tussen verrijking is bovendien vereist voor herstel van de cel, dat verhoogt de leeftijd van de culturen ondersteunen van cultuur-geïnduceerde artefacten. Laser microdissection heeft het voordeel dat cellen kunnen onmiddellijk gebruikt die cultuur-geïnduceerde artefacten vermindert, maar het risico van besmetting door cellen uit de aangrenzende weefsel gebieden10omvat. Microdissection is bovendien niet in elk laboratorium gevestigd. De nadelen van de FACS sorteren-gebaseerde benadering opnemen, vergelijkbaar met het microdissection, dat de apparatuur uitgebreid en kostenintensieve is laser. Dienovereenkomstig, deze apparatuur niet toegankelijk kan zijn op elk gewenst moment. In een klinische setting, waar niet de beschikbaarheid van het weefsel van belang precies gepland worden, kan dit een verdere nadeel toevoegen.

De belangrijkste voordelen van de FACS-sorteren zijn echter dat de Fractie van de EG kan worden gelabeld door meerdere antilichamen in parallel. Zo kan een strenge gating strategie worden ingezet die voor een hoge zuiverheid zorgt. Gebaseerd op ervaring, was geen opnieuw sorteren van de EG-breuk nodig, in tegenstelling tot de vorige MACS gebaseerde protocol waar meerdere rondes van selectie moesten worden ingezet. Dit leidde tot een aanzienlijk verlaagde teeltduur tot zuiverheid van zes weken (MACS benadering) tot drie weken in de aanpak van FACS, wat resulteert in een verbeterde levensvatbaarheid zodat het venster van een langdurige tijd van analyse. Ten slotte gebruikt de FACS sorteren-gebaseerde strategie, een verbetering van het algehele slagingspercentage van isolatie kan worden bereikt (een toename van 12,5%). Kortom, de FACS-sortering op basis strategie gebruikmaking 3 antilichamen parallel nadat weefsel verteren door gecombineerde mechanische en enzymatische weefsel spijsvertering had talrijke voordelen die dit protocol als de methode van keuze voor de isolatie van TECs opgericht en NEC uit menselijke colorectaal carcinoom en dikke darm.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.

Dankbetuigingen

Wij danken Katja Petter, Christina Schnürer (alle divisie van moleculaire en experimentele heelkunde), Christian Flierl, Uwe Appelt, Michael Mroz (Core Unit FACS-sorteren) en Simon Völkl (Core Unit FACS-Immunomonitoring) voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd gesteund door subsidies voor nl/MS van het Interdisciplinair Centrum voor klinisch onderzoek (IZKF) van de Universiteit medisch centrum Erlangen, de Duitse Research Foundation (DFG: voor 2438, SP2) en de Lutz-Stiftung, door een subsidie van de Robert-Pfleger-Stiftung VSS en door subsidies toegekend aan MS van de Duitse Research Foundation [DFG: KFO257 (deelproject 4), SFB 796 (deelproject B9)].

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
HBSS 1xGibco by Life Technologies14175-053
Penicillin-streptomycinGibco by Life Technologies15140-122
amphotericin BGibco by Life Technologies15290-026
Scalpels, disposableFeatherNo. 23
gentleMACS octo dissociatorMiltenyi Biotec130-095-937
gentleMACS C-tubesMiltenyi Biotec130-093-237
human tumor dissociation kitMiltenyi Biotec130-095-929
DMEMGibco by Life Technologies21969-035
EGM-2-MV BulletKitLonzaCC-3202
Cell strainer, 100 µmFalcon352360
StemPro Accutase Gibco by Life TechnologiesA11105-01
Cell counter, automatedCoulter CounterZ1
Y-27632Sigma-AldrichY0503
CD31-FITCBD Pharmingen555445
CD144/VE-cadherin-PEBD Pharmingen560410
CD105-APCBD Pharmingen562408
gelatin from bovine skinSigma-AldrichG9391
FACS-Sorting deviceBeckman CoulterMoFlo XDP

Referenties

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
  2. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
  3. Carmeliet, P., Jain, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).
  4. McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat Med. 9 (6), 713-725 (2003).
  5. Hurwitz, H., et al. Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med. 350 (23), 2335-2342 (2004).
  6. Naschberger, E., Schellerer, V. S., Rau, T. T., Croner, R. S., Stürzl, M. Isolation of endothelial cells from human tumors. Methods Mol Biol. 731, 209-218 (2011).
  7. Schellerer, V. S., et al. Endothelial cells of human colorectal cancer and healthy colon reveal phenotypic differences in culture. Lab Invest. 87 (11), 1159-1170 (2007).
  8. Naschberger, E., et al. Matricellular protein SPARCL1 regulates tumor microenvironment-dependent endothelial cell heterogeneity in colorectal carcinoma. J Clin Invest. 126 (11), 4187-4204 (2016).
  9. St Croix, B., et al. Genes expressed in human tumor endothelium. Science. 289 (5482), 1197-1202 (2000).
  10. Christian, S., et al. Endosialin (Tem1) is a marker of tumor-associated myofibroblasts and tumor vessel-associated mural cells. Am J Pathol. 172 (2), 486-494 (2008).
  11. Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncol Rep. 15 (2), 381-386 (2006).
  12. Miebach, S., et al. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades. J Neurooncol. 76 (1), 39-48 (2006).
  13. Richard, L., Velasco, P., Detmar, M. A simple immunomagnetic protocol for the selective isolation and long-term culture of human dermal microvascular endothelial cells. Exp Cell Res. 240 (1), 1-6 (1998).
  14. Nourse, M. B., et al. VEGF induces differentiation of functional endothelium from human embryonic stem cells: implications for tissue engineering. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30 (1), 80-89 (2010).
  15. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van endotheelcellenfluorescentie geactiveerde celsorteringweefseldigestiecelkweekimmunolabelingFACS sorteringCD31 VE cadherine CD105primaire celkweektumor endotheelcellen

Gerelateerde artikelen