Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, Neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie

13.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57406

⸱

29 maart 2018

 ,  , 
1Laboratory of Stem Cell and Neuro-Vascular Biology, Genetics and Developmental Biology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Earle A. Chiles Research Institute, Robert W. Franz Cancer Center, Providence Portland Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een hoge resolutie geheel-mount beeldvorming methode in de hele volwassen muis oor huid, waarmee we kunnen visualiseren vertakkende genuitdrukking en patronen van perifere zenuwen en bloedvaten, evenals immuun cel distributie.

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol van de huid van een geheel-mount volwassen oor imaging techniek om te bestuderen van de uitgebreide driedimensionale neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en patronen, evenals immuun cel distributie op een cellulair niveau. De analyse van perifere zenuwen en bloedvat anatomische structuren in volwassen weefsels biedt sommige inzicht in het begrip van functionele neuro-vasculaire bedrading en neuro-vasculaire degeneratie in pathologische omstandigheden zoals de wondgenezing. Als een zeer informatief modelsysteem, hebben we onze studies gericht op volwassen oor huid, dat gemakkelijk toegankelijk zijn voor dissectie is. Onze eenvoudige en reproduceerbare protocol biedt een nauwkeurige voorstelling van de cellulaire componenten in de gehele huid, zoals de perifere zenuwen (sensorische axonen, sympathieke axonen en cellen van Schwann), bloedvaten (endotheliale cellen en vasculaire zachte spiercellen ), en ontstekingscellen. Wij geloven dat dit protocol zal de weg effenen naar onderzoeken morfologische afwijkingen in het perifere zenuwen en bloedvaten en de ontsteking in de huid van de volwassen oor onder verschillende pathologische condities.

Inleiding

Huid bestaat uit drie lagen: de epidermis, de dermis en de hypodermis. Het is gebruikt als een modelsysteem om te studeren stamcel onderhoud, differentiatie en voedselproductie in ontwikkeling evenals de regeneratie, tumorvorming en ontstekingen bij volwassenen. Huid is rijkelijk gevacuoliseerd en geïnnerveerd zodanig zijn dat de ontwikkeling van het perifere zenuwstelsel en vasculaire systeem goed gecoördineerd.

Wij hebben eerder aangetoond een geheel-mount embryonale huid beeldvormende techniek met meerdere labelen om te studeren intact perifere zenuwen en bloedvaten, met inbegrip van hun cellulaire componenten1,2,3, 4: sensorische axonen, sympathieke axonen Schwann cellen in zenuwen, endotheliale cellen, pericytes en vasculaire zachte spiercellen (VSMCs) in de bloedvaten. Tijdens de angiogenese, een primaire capillaire netwerk ondergaat intensieve vasculaire remodeling en ontwikkelt zich tot een hiërarchisch vasculaire vertakkende netwerk. In de ontwikkelingslanden dermis/hypodermis, slagaders vertakken naast perifere sensoriële zenuwen en aders dan vormen grenzend aan de slagaders. Nadat het hiërarchische vasculaire netwerk grondig met VSMCs bedekt is, sympathische zenuwen uitbreiden langs en innervate grote diameter bloedvaten1,5,6. Ondanks het belang in de nauwe samenwerking tussen de ontwikkelingslanden nerveus en vasculaire systemen, een grote vraag geweest om te pakken wat gebeurt er met de neuro-vasculaire netwerken in diverse pathologische situaties bij volwassenen. Een driedimensionale high-resolution imaging is noodzakelijk om te waarderen de pathogenese, samen met anatomisch herkenbaar vertakkende genuitdrukking en patronen.

Neuronale en vasculaire morfogenese in volwassen muis huid is vaak geanalyseerd door weefsel sectie kleuring. Andere studies hebben geheel-mount beeldvorming van de huid gebruikt voor het visualiseren van de perifere zenuwen en bloedvaten, naast de haarzakjes sebaceous klieren en de arrector pili spieren7,8,9. Echter, de dikte van volwassen huid heeft het moeilijk gemaakt voor het analyseren van de huid over de gehele diepte.

In de huidige studie ontwikkelden we een nieuwe hoge resolutie geheel-mount beeldvorming van volwassen oor huid om deze uitdagingen te overwinnen. Oor huid is gemakkelijk toegankelijk zijn voor dissectie en latere geheel-mount beeldvorming van de huid over de gehele diepte. Dus, het is een eenvoudig en zeer reproduceerbare methode die kan worden toegepast om te vergelijken van driedimensionale architectuur van perifere zenuw- en vasculaire systemen in de huid, met uitgebreide kwantificering metingen. We toonden aan dat de uitlijning van perifere zintuiglijke en sympathische zenuwen met grote diameter bloedvaten bewaard in de volwassen huid gebleven is. Het doel van dit protocol is te visualiseren vertakkende genuitdrukking en de patronen van perifere zenuwen en bloedvaten, evenals de immuun cel distributie op een cellulair niveau in volwassen Muismodellen in verschillende omstandigheden zoals ontsteking en regeneratie weer gecontroleerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten in deze sectie werden uitgevoerd onder goedkeuring van de National Heart, Lung, Blood Institute (NHLBI) Animal Care en gebruik Comité.

1. de volwassen muis oor huid collectie

  1. Volwassen muizen door kooldioxide (CO2) blootstelling in een gesloten kamer euthanaseren en bevestig de euthanasie door cervicale dislocatie.
    Opmerking: Het experiment volgt de National Institutes of Health (NIH) richtsnoer voor de methode van de euthanasie.
  2. Ontleden van het oor van de base en plaats deze in een 35 x 10 mm2 petrischaal met 2 mL van Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS). Kort knippen haren met een schaar.
  3. Schil de posterieure huid en anterior huid weg zorgvuldig van de tussenliggende kraakbeen.
    Opmerking: Kraakbeen hecht aan de voorste huid.
  4. Breng de posterior en anterior huid afzonderlijk tot en met een goed 24 plaat met 1 mL van de ijskoude verse 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) per putje. Afvlakken van de posterieure en anterieure huid in de 4% PFA.
  5. Fix het posterieure en anterieure huid met kraakbeen bij 4 ° C gedurende 1 uur.
  6. Wassen van de huid van het posterieure en anterieure 3 keer gedurende 5 minuten in 1 mL PBS met zacht mengen op een mixer bij kamertemperatuur.
  7. De posterieure en anterieure huid met kraakbeen aan de onderkant van een 35 x 10 mm2 petrischaal overdragen. Afgesneden de basis regio, die is gevouwen en heeft adipeus en bindweefsel. Het kraakbeen van anterior huid met behulp van fijn gebogen pincet afschilferen.
  8. Verwijder voorzichtig de haren, vetweefsel en bindweefsel vanaf de binnenkant van de posterieure huid met behulp van fijn gebogen pincet. Houd de huid nat met PBS.

2. geheel-mount immunohistochemische kleuring van muis oor huid

Opmerking: Alle experimenten in de volgende gedeelten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de veiligheid van het laboratorium van NIH.

  1. De buffer met blokkerend voor te bereiden. Filter 10% warmte geïnactiveerd geit serum (HIGS) verdund in PBS met 0,2% triton blokkeerbuffer X-100 (TX-100) of 10% ezel serum (DS) verdund in PBS met 0,2% TX-100 blokkeerbuffer, met behulp van een 0,45 µm filter eenheid.
  2. Breng de posterior en anterior huid tot een 24 goed plaat met 1 mL 10% HIGS blokkeerbuffer of 10% DS blokkeerbuffer per putje. Incubeer de huid voor 30 min met zacht mengen op een mixer bij kamertemperatuur.
  3. Bereid de primair antilichaam-oplossing door het verdunnen van de primaire antilichamen (Tabel van materialen) in blokkeerbuffer (ofwel 10% HIGS of 10% DS).
    Opmerking: Geheel-mout immunohistochemische analyse van volwassen oor huid met antilichamen tegen pan-neuronale marker neuron-specifieke klasse III β-tubuline (Tuj1, konijn polyklonale IgG of muis monocloncal IgG2a, 1:500 verdunning op de uiteindelijke concentratie van 2 µg/mL), pan-endothelial cel marker bloedplaatjes endothelial cel adhesie molecuul 1 (PECAM-1, hamster monoclonal IgG, 1:300 verdunning op de uiteindelijke concentratie van 3.3 µg/mL), myelineschede marker myeline fundamentele eiwit (MBP, konijn polyklonale IgG, 1:200 verdunning in de eindconcentratie van 5 µg/mL) en inflammatoire myeloïde cel marker CD11b (Rat monoclonal IgG2b, 1:50 verdunning op de uiteindelijke concentratie van 20 µg/mL) was te zien in Figuur 1 en Figuur 2. De huid was geïncubeerd met Cy3-geconjugeerde antilichaam voor vasculaire glad spierweefsel cel marker α glad spierweefsel actine (αSMA) samen met secundaire antilichamen (2.6). De primaire antilichamen getest door onszelf werden vermeld in de Tabel van materialen. Meerdere primaire antilichamen afgeleid van verschillende species kunnen gelijktijdig worden gemengd.
  4. De posterieure en anterieure huid overdragen aan nieuwe putje met 150 µL van de primaire antilichamen oplossing. Incubeer de huid met zacht mengen op een mixer bij 4 ° C's nachts.
  5. De volgende dag, het posterieure en anterieure huid overbrengen naar nieuwe putten in de 24 goed plaat of gecombineerd de buffer met blokkerend met primaire antilichamen. Voeg 1 mL ofwel 2% HIGS verdund in PBS met 0,2% TX-100 wassen buffer of 2% DS verdund in PBS met 0,2% TX-100 wassen buffer. Wassen van de huid met 3 veranderingen van de buffer wassen elke 15 min met zacht mengen op een mixer bij kamertemperatuur.
  6. Bereid de oplossing van secundair antilichaam (Tabel van materialen). Verdun secundaire antilichamen in de blokkeerbuffer (ofwel 10% HIGS of 10% DS) en filter de buffer met blokkerend met secundaire antilichamen door een 0,22 µm Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride spuit membraanfilter met een spuit van 1 mL verbonden.
    Opmerking: Alexa 488 of anti-konijn geit 633-geconjugeerde IgG (H + L) of IgG2a voor Tuj1, Alexa 647-geconjugeerde geit anti-hamster IgG (H + L) voor PECAM-1, Alexa 488-geconjugeerde geit anti-konijn IgG (H + L) voor MBP, muis en rat Alexa 594-geconjugeerde IgG (H + L) voor CD11b werden gebruikt met de verdunning van het 1:250 op de uiteindelijke concentratie van 8 µg/mL. De huid was geïncubeerd met αSMA Cy3-geconjugeerde antilichaam (1:500 verdunning op de uiteindelijke concentratie van 2-3 µg/mL) in combinatie met deze secundaire antilichamen.
  7. De oplossing bij 13.000 x g gedurende 10 minuten geaggregeerde om deeltjes te verwijderen van de secundaire antilichamen van de buffer met blokkerend centrifugeren.
    Opmerking: Verschillende TL geconjugeerd secundaire antilichamen afgeleid van verschillende species kunnen gelijktijdig worden gemengd.
  8. Overbrengen in de huid van posterieure en anterieure putje met 150 µL van de secundaire antilichamen oplossing. De 24 goed plaat wikkel in aluminiumfolie te voorkomen licht en de huid voor 1 h met zacht mengen op een mixer bij kamertemperatuur incuberen.
  9. Overdracht van de posterieure en anterieure huid aan nieuwe putjes in de 24 goed plaat of gecombineerd de secundair antilichaam oplossing door Pipetteer volledig. Voeg 1 mL 2% HIGS wassen buffer of 2% DS wassen buffer.
  10. De 24 goed plaat wikkel in aluminiumfolie en wassen met 3 wijzigingen van de buffer wassen elke 15 min met zacht mengen op een mixer bij kamertemperatuur.

3. montage van de oor-huid op dia

  1. Plaats de huid aan de onderkant van een 35 x 10 mm2 petrischaal. Verwijder voorzichtig de haren, vetweefsel, bindweefsels, stof en vezels uit de binnenkant van de huid met behulp van fijn gebogen pincet onder de stereomicroscoop met lage verlichting om te minimaliseren uitgebreide foto bleken. Houd de huid nat met PBS.
  2. De huid overbrengen in een zelfklevende microscoopglaasje met pincet. Plaats van de achterste en voorste huid met de binnenkant naar boven op de dia. Het afvlakken van de huid met behulp van de verlostang.
  3. Monteer de huid in een vloeibare anti-fade montage medium te voorkomen photobleaching en fluorescerende signalen behouden. Zorg ervoor dat geen luchtbellen op of rond de huid.
  4. Bedek met dekglaasje aan op de huid monsters zorgvuldig en opslaan van de gemonteerde huid voorbeelddia's in het donker 's nachts bij kamertemperatuur zodat de montage media krijgen vast. Zegel van het dekglaasje aan naar de dia met nagellak en het bewaren bij 4 ° C voor langdurige opslag.

4. confocale microscopie

  1. Passende lasers voor fluorophores instellen. Een confocal microscoop met drie laser bronnen (Argon 488 nm, DPSS 561 nm en HeNe 633 nm) wordt gebruikt in dit experiment.
  2. Gebruik de sequentiële scan-hulpprogramma, waarmee gelijktijdig triple gebeitste monsters prikkelt, overlappingen te vermijden.
    Opmerking: Afbeeldingen zullen worden genomen in een sequentiële wijze met behulp van de sequentiële scan-modus.
  3. Afbeelding onder een 10 X doelstelling. De tegel scan tool gebruiken om vast te leggen van de hele oor huid. Z-stack instellen en ervoor te zorgen dat de z-positie heeft betrekking op de gehele dikte van de huid van het oor.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Volwassen muis posterieure oor huid (figuur 1A) en anterior oor huid (figuur 1B) waren immunostained met antilichamen tegen αSMA (rood), Tuj1 (groen), en PECAM-1 (blauw). De huid van de posterieure was immunostained om te studeren van neuro-immuun distributie met behulp van antilichamen tegen CD11b (rood) en MBP (groen), samen met Tuj1 (blauw) (figuur 2A). Distributie van CD11b+ ontsteking...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft de geheel-mount immunonohistochemical beeldvorming van volwassen oor huid voor de analyse van de neuro-vasculaire structuren en immuun cel distributie. Wij geloven dat deze methode heeft tal van voordelen voor onderzoekers te bestuderen vertakkende genuitdrukking en de patronen van de perifere zenuwen en bloedvaten, alsmede driedimensionale distributie huid componenten zoals immuuncellen en haar experimentele follikels. De resultaten van de beeldvorming kunnen worden gekwantificeerd aan de hand va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken K. Gill voor het Laboratoriumbeheer en technische ondersteuning, J. Hawkins en het personeel van National Institutes of Health (NIH) gebouw 50 dier faciliteit voor de hulp bij de zorg van de muis, en R. Reed en F. Baldrey voor administratieve bijstand. Ook dank aan S. Motegi en M. Udey voor het delen van hun oor huid dissectie protocol, N. Burns voor redactionele hulp, en de leden van het laboratorium van de cel van de stam en Neuro-vasculaire biologie voor technische hulp en nadenkende bespreking. T. Yamazaki werd gesteund door de Japan-maatschappij voor de promotie van wetenschap (JSPS) NIH-KAITOKU. Dit werk werd gesteund door de intramurale programma van het onderzoek van de National Heart, Lung en bloed Instituut (HL005702-11 tot en met Y.M.)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 x Phosphate Buffered SalineKD MedicalRGE-3210PBS, zonder Ca2+/Mg2+
Hank’s Balanced Salt SolutionGibco14025-092HBSS, met Ca2+/Mg2+
16% ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710PFA, fixatief, verdund in PBS
Triton X-100SigmaX100Detergens
Normal goat serumGibco16210064Component van blokkerings-/wasbuffer
Normal donkey serumJackson Immuno research017-000-121Component van blokkerings-/wasbuffer
Gebogen fijne pincettenDumontRS-5047
Gebogen pincettenIntegra Miltex VantageV918-782, V918-784
Filter Unit 0.45 mmThermo Scientific157-0045Voor filtratie
1 mL spuitCoviden8881501400Voor filtratie
Spuitenfilter Unit 0.22 mmMillex-GVSLGVR04NLVoor filtratie
ProLong GoldThermo ScientificP36934Anti-fade montagemedium
Nail PolishElectron Microscopy Sciences72180Voor afdichting
DissectiemicroscoopLeicaMZ95
Confocale microscoopLeicaTCS SP5
Photoshop CC 2017AdobeGrafische editorsoftware
Illustrator CC 2017AdobeGrafische editorsoftware
Image JNIHBeeldverwerkingssoftware
Anti-PECAM-1 (CD31) antilichaamMilliporeMAB1398ZHamster IgG, vasculair endotheelcelmarker, 1:300
Anti-PECAM-1 (CD31) antilichaamBD Pharmingen553369Rat IgG2a kappa, vasculair endotheelcelmarker, 1:300
Anti-αSMA antilichaam geconjugeerd met cy-3SigmaC6198Mouse IgG2a, vasculair soepel spiercelmarker, 1:500
Anti-EphB1 antilichaamSanta Cruzsc-9319Geast polyclonaal, veneus endotheelcelmarker, 1:100
Anti-neuron-specifiek Class III β-tubuline (Tuj1)AbcamAB18207Tuj1, konijn polyclonaal IgG, pan-axonaal marker, 1:500
Anti-Tuj1 antilichaamCovanceMMS-435PMouse IgG2a, pan-axonaal marker, 1:500
Anti-MBP antilichaamAbcamAB40390Konijn polyclonaal IgG, myelinisatiemarker, 1:200
Anti-Tyrosine Hydroxylase antilichaamChemiconAB152Konijn polyclonaal, sympathisch neuron marker, 1:500
Anti-Peripherin antilichaamChemiconAB1530Konijn polyclonaal, perifeer neuron marker, 1:1000
Anti-CD11b antilichaamBio-RadMCA74GRat IgG2b, inflammatoire celmarker (macrofagen), 1:50
Anti-CD45 antilichaamThermo Fisher Scientific14-0451-85Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietische celmarker, 1:500
Anti-CD3 antilichaamBio-RadMCA1477TRat IgG1, immuuncelmarker, 1:100
Anti-CD45R (B220) antilichaamThermo Fisher Scientific14-0452Rat IgG2a kappa, inflammatoire celmarker, 1:200
Anti-GFP antilichaamThermo Fisher ScientificA11122Konijn polyclonaal, 1:300
Anti-GFP antilichaamAbcamAb13970Kip polyclonaal, 1:500
Anti-β-gal antilichaamCappel55976Konijn polyclonaal, 1:5000
Anti-RFP antilichaamAbcamAb62341Konijn polyclonaal, 1:300
Goat anti-konijn IgG (H+L) Alexa 488Thermo Fisher ScientificA11034Konijn polyclonaal secundair antilichaam, 1:250
Goat anti-geast IgG (H+L) Alexa 647Jackson Immuno research127-605-160Geast polyclonaal secundair antilichaam, 1:250
Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594Jackson Immuno research112-585-167Rat polyclonaal secundair antilichaam, 1:250
Goat anti-muis IgG2a Alexa 633Thermo Fisher ScientificA21136Muis IgG2a secundair antilichaam, 1:250

Referenties

  1. Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
  2. Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
  3. Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. , (2011).
  4. Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
  5. Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
  6. Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
  7. Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. , e51749(2014).
  8. Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. , (2017).
  9. Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540(2014).
  10. Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
  11. Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
  12. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
  13. Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
  14. Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
  15. O'Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
  16. Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Perifere zenuwenbloedvatenimmunohistochemische kleuringfluorescentiesignalendriedimensionale architectuurmuismodel
Geheel-mount confocale microscopie voor volwassen oor huid: een modelsysteem om te studeren, Neuro-vasculaire vertakkende genuitdrukking en immuun cel distributie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.