Beoordeling van lysosomale gealkaliseerd in de darm van levende Caenorhabditis elegans

Samenvatting

Een stapsgewijze handleiding sonde verlies van lysosomale zuurtegraad in de darm van C. elegans met behulp van de pH-gevoelige vitale kleurstof 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein-DIACETAAT (cDCFDA)

Samenvatting

De nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een modelsysteem dat veel gebruikt wordt om te studeren, lange levensduur en ontwikkelings trajecten. Dergelijke studies worden gefaciliteerd door de transparantie van het dier, de mogelijkheid om te vooruit en achteruit genetische tests, het relatieve gemak van genereren fluorescently geëtiketteerde eiwitten, en het gebruik van fluorescente kleurstoffen die kan worden microinjected in de vroege embryo of opgenomen in zijn voedsel (E. coli stam OP50) op het etiket van cellulaire organellen (bijvoorbeeld 9-diethylamino-5 H-benzo (a) phenoxazine-5-één en (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1)) methylidene]-2 H-pyrrol-5-yl-kappaN} - N - [2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Hier presenteren we het gebruik van een fluorescente kleurstof van pH-gevoelige die vlekken intestinale lysosomen, voorzien van een visuele uitlezing van dynamische, fysiologische veranderingen in lysosomale zuurgraad in levende wormen. Dit protocol niet lysosomale pH meet, maar wil liever een betrouwbare methode voor de beoordeling van de fysiologische relevante varianten in lysosomale zuurgraad. cDCFDA is een cel-permeant verbinding die wordt geconverteerd naar de fluorescerende fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2',7'-dichlorofluorescein (cDCF) na hydrolyse door intracellulaire esterasen. Protonering binnen lysosomen overlapt cDCF in deze organellen, waar het zich ophoopt. Als gevolg van zijn lage pKa van 4.8, is deze kleurstof gebruikt als een pH sensor in gist. Hier beschrijven we het gebruik van cDCFDA als een voedingssupplement te beoordelen van de zuurgraad van intestinale lysosomen in C. elegans. Deze techniek zorgt voor de detectie van alkalinizing lysosomen in levende dieren in, en heeft een breed scala van experimentele toepassingen met inbegrip van studies over autophagy, veroudering en lysosomale biogenese.

Inleiding

Het uiterlijk van eiwit-aggregaten is algemeen aanvaard als een kenmerk van veroudering in eukaryote cellen^1,2,3, en de vorming van die wordt beschouwd als onder de bestuurders van het principe van cellulaire senescentie^{4 , 5 , 6 , 7}. er zijn steeds meer aanwijzingen dat leeftijd cellen, eiwit katabolisme bijzondere waardevermindering heeft ondergaan is, wat leidt tot een toename van de aggregatie van eiwitten. De ineenstorting van proteolyse in de ....

Protocol

1. vlekken en intestinale lysosomen Image

1. Zaad nematode groei media (NGM) platen met OP50
   1. Bereiden van NGM platen volgens de aanbevolen protocol¹⁹ en laat de gesloten platen voor 2 dagen bij kamertemperatuur drogen.
   2. Inoculeer OP50 bacteriën in steriele Luria Bouillon (LB) Bouillon en groeien in een schudden incubator of water bad bij 37 ° C gedurende 36 uur of totdat de OD tussen 0,2 en 0.4 is. Vermijd het gebruik van een bacteriële cultuur met OD > 1 of OD < 0.2.
   3. Zodra NGM platen droog zijn, breng een druppel (~ 30 µL) van OP50 entmateriaal in het midden van de plaat, en verspreidde zi....

Resultaten

cDCFDA vlekken lysosomen in een pH-afhankelijke manier, en de lage pKa en klaar opname in de lysosomen maakt het een ideale pH sensor²¹. cDCFDA kleuring intensiteit is omgekeerd evenredig met de lysosomale pH (d.w.z. kleuring intensiteit toeneemt als pH daalt)^18,22. cDCFDA signalen zijn consequent zwak in de lysosomen van dieren die zijn behandeld met 20 mM van chloroquine, een inhibitor van de omw.......

Discussie

Een verscheidenheid van cellulaire en moleculaire gebeurtenissen bijdragen aan veroudering, beïnvloed door levensgeschiedenis karaktertrekken en genetische factoren. Onze recente studie²² suggereert dat de reproductieve cyclus een belangrijke rol speelt bij de controle van de geschiktheid van het soma door middel van de verordening van lysosomale pH dynamiek. We toonden dat lysosomal-gemedieerde proteolyse wordt bevorderd terwijl dieren actief reproduceren door opregulatie van v-ATPase transcripti.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
OP50 (E. coli)	Caenorhabditis Genetics Center		Bestel online op https://cgc.umn.edu/strain/OP50
5(6)-carboxy-2’,7’-dichlorofluorescein diacetaat	ThermoFisher	C369	Algemeen bekend als cDCFDA
9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-on en (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylideen]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidaat)(difluoro)boron	ThermoFisher	L7528	Algemeen bekend als Lysotracker Red
Confocal microscoop (bijv. Zeiss LSM 510)
ImageJ			Download gratis van https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LB Broth poeder	ThermoFisher	22700041
Bacto Agar	Sigma	A5306-1KG
NaCl	Sigma	S9888
Bacto Peptone	Fisher Scientific	S71604
Cholesterol poeder	Sigma	C3045
CaCl2	Sigma	449709
MgSO4	Sigma	M7506
K3PO4	Sigma	P5629
Sodium Azide	Sigma	S2002
DMSO	Sigma	D8418
Microscoopglaasjes	VWR	48311-703
Dekglasjes	ThermoFisher	3406
Agarose	Sigma	A6013
Incubator
Spiegel of andere gladde platte oppervlak