Geautomatiseerde dia scannen en segmentatie in Fluorescently-geëtiketteerden weefsels met behulp van een analysesysteem Widefield High-inhoud

Samenvatting

Hier beschrijven we een protocol voor de automatische segmentatie van fluorescently geëtiketteerde weefsels op dia's met behulp van een widefield high-inhoudsanalyse systeem (WHCAS). Dit protocol heeft brede toepassingen op elk gebied waarbij de kwantificatie van fluorescente markeringen in biologische weefsels waaronder de biologische wetenschappen, medische techniek en Gezondheidswetenschappen.

Samenvatting

Geautomatiseerd dia scannen en segmentatie van fluorescently-geëtiketteerden weefsels is de meest efficiënte manier voor het analyseren van de hele dia's of grote weefselsecties. Helaas, veel onderzoekers besteden grote hoeveelheden van tijd en middelen ontwikkelen en optimaliseren van werkstromen die alleen relevant voor hun eigen experimenten zijn. In dit artikel beschrijven we een protocol dat kan worden gebruikt door degenen met toegang tot een widefield high-inhoudsanalyse systeem (WHCAS) om het imago van elke dia gemonteerde weefsel, met opties voor aanpassing binnen voorgebouwde modules gevonden in de bijbehorende software. Niet oorspronkelijk voorgenomen voor dia scannen, maken de stappen in dit artikel beschreven het mogelijk te verwerven dia scannen afbeeldingen in de WHCAS die kunnen worden geïmporteerd in de bijbehorende software. In dit voorbeeld wordt de automatische segmentatie van hersenen tumor dia's is aangetoond, maar de automatische segmentatie van elke fluorescently-geëtiketteerden nucleaire of cytoplasmatische marker is mogelijk. Verder zijn er een verscheidenheid van andere kwantitatieve softwaremodules, met inbegrip van tests voor eiwit localisatie/translocatie, cellulaire proliferatie/levensvatbaarheid/apoptosis en angiogenese die kunnen worden uitgevoerd. Deze techniek zal onderzoekers tijd en moeite besparen en een geautomatiseerde protocol voor de analyse van de dia maken.

Inleiding

De nauwkeurige en precieze kwantificatie van fluorescently-geëtiketteerden weefsels op dia's is een zeer gewilde techniek in veel wetenschappelijke gebieden. Echter, onderzoekers vaak handmatig tellen specimens of besteden aanzienlijke bedragen aan tijd aan het ontwikkelen van esoterische geautomatiseerde technieken om dit te bereiken. Hierin bieden we een protocol voor de geautomatiseerde dia scannen en kwantificatie van cellen met behulp van een WHCAS en de bijbehorende software, met aangeboren immuuncellen in bevroren menselijk brein tumor secties als voorbeeld. De bijbehorende software biedt een breed scala aan aanpasbare inbouwmodules van neurite uitgroei tellen tot differentiatie van cel typen^{1,2,3,4,5, 6}. het doel van deze methode is om de onderzoekers te voorzien van een start-tot-einde, gemakkelijk reproduceerbaar protocol bij beelden van verwerven en kwantificeren van fluorescently-geëtiketteerden entiteiten in elke dia gemonteerde weefsels.

In dit protocol, wordt de WHCAS vooral gebruikt voor imaging-platen voor de daaropvolgende analyse van de bijbehorende software ook al een dia-adapter en de grondbeginselen aan dia scannen⁷ beschikbaar waren. Het was onbetaalbaar op afbeelding dia's omdat de zorgvuldige ruimtelijke kalibratie van het gebied van acquisitie, de selectie van geschikte tijdschriften, het creëren van op maat gemaakte loadouts en een liaison met vertegenwoordigers van het product nodig waren. In de bredere lichaam van literatuur, in plaats van aankoop van een specifieke dia-imaging en analyse apparatuur⁸, heeft een vorige technologische verslag met toegang tot deze software de Beeldacquisitie van dia's op de WHCAS in totaal⁹omzeild. Beeldanalyse verwerving of afbeelding uitvoeren op verschillende platformen vereist extra werk om ervoor te zorgen dat elk is compatibel met de andere.

De mogelijkheid om gebruik van de WHCAS en de bijbehorende software voor Fotolader zouden de geen onnodige complicaties van zoekt of ontwikkelen van een werkstroom vreemd deze hulpprogramma's voorkomen. In dit artikel de stappen vereist om een lage vergroting overzicht scan en de bijbehorende hoge vergroting-afbeeldingen maken door de behandeling van de dia als een plaat, en de daaropvolgende analyses met behulp van de module segmentatie multi golflengte cel scoren toestaan voor de herbestemming van de WHCAS. Dit gemakkelijk bruikbaar protocol biedt een voordeel ten opzichte van alternatieve technieken, want er geen noodzaak is om algoritmen of meerdere stappen tellen protocollen^10,11 , zodra de afbeeldingen zijn verworven op de WHCAS. Dit protocol vermindert de tijd die nodig is voor het optimaliseren van een kwantificatie techniek, is nauwkeuriger¹² en efficiënter dan manuele tellen en maximaliseert het gebruik van de WHCAS. Dit protocol kan worden gemakkelijk en wijd gebruikt aangezien hierdoor de beeldvorming en de analyse van elke fluorescently-geëtiketteerden weefsels op dia's.

Protocol

Tumor specimens werden verkregen volgens het protocol goedgekeurd door de Raad van bestuur en ethiek-Commissie van de lokale institutionele beoordeling en uitgevoerd in overeenstemming met nationale regelgeving. De WHCAS en de bijbehorende software gebruikt in dit artikel worden vermeld in de Tabel van materialen.

1. importeren de dagboeken

1. De bijbehorende software niet openen.
2. Download de dagboek suite aangegeven in de Tabel van materialen.
3. De suite dagboek naar een geschikte map importeren door te klikken op de rubriek Journal, hoofdmenu Invoer Journal Suite...te selecteren en te klikken op importeren.

2. maken instellingen voor Preview Scan overname

1. In plaat overname in het dialoogvenster Instelling , ga naar de doelstelling en Camera tab. Selecteer 4 X als de vergroting, als de camera weggooien, 1en 2 als de winst.
2. Voer de instellingen in figuur 1A onder het tabblad plaat – Slidescanning.
   Opmerking: Deze instellingen zijn gemaakt om de gebruiker te bekijken en navigeren maximaal 3 dia's toe te staan. Elke dia is opgedeeld in 3 aangrenzende putten voor de eenvoudige navigatie en 'live' visualisatie van de segmenten van de weefsels of cellen.
3. Vul de putjes gelijkmatig met de sites op het tabblad Sites te bezoeken .
4. Klik op Plaat onder instellingen bewerken... en voer de waarden die worden weergegeven in figuur 1B.
5. Voer de gewenste golflengte (nucleaire vlek in dit voorbeeld) voor de voorbeeldscan onder het tabblad Overname lus . Voor het beste contrast en de beeld-gebaseerde gericht, het helderste fluorescent signaal (bijvoorbeeld, vaak een nucleaire vlek) te gebruiken.
   Opmerking: Kleuring weefsels met een heldere vlek zoals een nucleaire vlek wordt aanbevolen, aangezien dit voorziet in een hoog contrast in vergelijking met de achtergrond. Niet alleen zal deze steun op de locatie van de steekproef, maar wanneer meer dan één fluorophore in de volgende hoge vergroting overname imaging, de helderste kleuren worden gebruikt voor de verschuiving van de beeldvorming van de andere kleuren baseren.
6. Shading Correction inschakelen in de plaat overname modus aan beelden stik.
7. Deze instellingen opslaan als instelling A.

3. het creëren van instellingen voor dia acquisitie bij hoge vergroting

1. In plaat overname in het dialoogvenster Instelling , ga naar de doelstelling en Camera tab. Selecteer 40 X als de vergroting, 1 als het weggooien van de camera (voor de hoogste digitale resolutie) en 2 als de winst (voor de verhoging van het signaal en de helderheid van afbeeldingen).
   Opmerking: Een lagere instelling van objectieve vergroting kan worden gebruikt, maar de auteurs gevonden 40 X als de optimale instelling voor de analyse van menselijke microglia en macrofagen in hersenweefsel van de tumor met behulp van de module Meerdere golflengte cel scoren .
2. Controleer alle instellingen voor de tabbladen plaat – Slidescanning en Plaat onder instellingen bewerken... dezelfde als die voor instelling A zijn (zie stap 2).
3. Als de beelden verkregen niet knapperig, goed diepte, hoogte van de plaaten Plaat onder instellingen om aan te passen de focus wijzigen. Als er nog steeds een probleem met de focus, kies Laser met terugwinning van de afbeelding onder de sectie Opties voor de Autofocus .
4. Voer het aantal golflengtes aanwezig in het monster onder het tabblad Overname lus . Controleer de opties inschakelen laser gebaseerde gericht en inschakelen op basis van installatiekopieën gericht (voor de terugwinning van de verwerving of laser) .
5. Selecteer onder het tabblad Autofocus Focus op plaat en goed onder.
6. Selecteer de opties in het tabblad tijdschriften zoals aangegeven in Figuur 2, zorgen voor dat voorkoming asynchrone hardware beweegt ook is geselecteerd.
7. Deze instellingen opslaan als instelling B.

4. het plaatsen van de dia in het analysesysteem Widefield High-inhoud

1. Druk op F4 om het Hoofdmenute krijgen. Selecteer dia scannen. Klik op Open deur-Eject dia en dia('s) en de dia-adapter (die plaats bieden aan maximaal drie dia's) in het WHCAS (figuur 3A en 3B) invoegen. Oriënteren de dia met het dekglaasje aan naar beneden en het label aan de kant van de inkeping in de dia-adapter (figuur 3A).
   Opmerking: De slides die gebruikt worden in dit experiment waren standaard 25 x 75 x 1 mm dia's.
2. Klik op sluiten deur-dia laden.

5. het verwerven van een voorbeeldscan

1. Onder de kop Screening Selecteer plaat acquisitie en controle... en Plaat overname Setup... en laden instelling A.
2. Verplaats onder het tabblad Wells op bezoek naar het putje met het monster, met behulp van de rechtermuisknop knop op de muis. Onder het tabblad Sites te bezoeken naar verschillende sites met de Live -Fotolader te verplaatsen totdat de cellen bevinden. Handmatig richten op het monster of de Autofocuste gebruiken. Gebruik Snap om het beeld te leggen.
   Opmerking: Het monster is gemakkelijker te vinden met meer sites, en door het aanbrengen van de sites aan het putje (zie stap 2.3).
3. Selecteer Voorvertoning dia'sop het hoofdmenu.
4. Selecteer de optie weerspiegelt hoeveel dia's zijn gonna worden gescand in het dialoogvenster dat automatisch verschijnt. Scannen één dia tegelijk. Druk op OK. Selecteer 4 X als de vergroting. Druk op OK. Selecteer dekglaasje aan omlaag (0,17 mm) als de afdrukstand van de dia (gebruik een correctie kraag als de dikte van een verschillende dekglaasje aan wordt gebruikt). Druk op OK. Klik op Doorgaan.
   Nota: Als de gebruiker wenst te verwerven preview scans voor 2 of meer dia's, moet elke voorbeeldscan voorafgaand aan de overname van de bijbehorende hoge vergroting afbeelding afzonderlijk worden geopend.
5. Onder Belasting scannen dia instellingzorgen dat de overname-instellingen en kalibraties selectievakjes zijn ingeschakeld. Druk op Annuleren. Wanneer de Instellingen van de scanner van de dia doos weer verschijnt, selecteert u Doorgaan.
6. Wanneer het dialoogvenster Scannen dia wordt weergegeven, pas de instellingen zoals in figuur 4A-4 C. Selecteer sluiten als u klaar bent.
   Opmerking: Verhoging van de camera weggooien en het verminderen van de camera belichtingstijd zal leiden tot sneller scannen, zij het op een lagere digitale resolutie en dynamisch bereik, respectievelijk, vandaar verkleinen de beeldkwaliteit. Arcering correctie zal zorgen voor een uniforme intensiteit over een enkele gezichtsveld. Draaien op de Hardware en Image Autofocus zorgt de scan is in focus, maar zal vertragen het scannen. In het belang van de tijd te besparen, is het raadzaam om arcering van correctie en de Hardware en de afbeelding Autofocus uit terwijl het verwerven van de lage vergroting scan, maar om deze opties te hebben ingeschakeld voor stap 6 tijdens de hoge vergroting beeldvorming. De resolutie van de scan lage vergroting zal niet van invloed op de resolutie van de scan hoge vergroting.
7. Selecteer een map voor de dia scannen van gegevens. Klik op OK. Voer een naam voor het bestand. Klik op OK.
8. Het dialoogvenster Tekenen gebied verschijnt automatisch. Gebruik het gereedschap rechthoekig gebied (figuur 5A) om de hele preview scan regio zoals aangegeven in figuur 5Bte selecteren. Klik op Doorgaan.
9. In het dialoogvenster Setup voltooid verschijnt. Selecteer Doorgaan.
   Opmerking: De dia voorbeeldscan zal nu beginnen.
10. Wanneer de voorvertoning is voltooid, verschijnt het dialoogvenster Scannen compleet . Selecteer Doorgaan. Sluit het voorbeeldvenster voor de scan niet (in dit voorbeeld de DAPI scannen venster; Zie Figuur 6).
    Opmerking: De installatie en de lage vergroting scan acquisitie proces duurt ongeveer 20 min. De daaropvolgende hoge vergroting afbeelding Acquisitietijd zal afhangen van het aantal sites gekozen evenals de belichtingstijden voor elk kanaal.

6. hoge vergroting scannen

1. Laden instellen van B.
2. Bepalen welke wells image worden gemaakt. Verplaats onder het tabblad Wells op bezoek naar het putje met het monster, met behulp van de rechtermuisknop knop op de muis.
   Opmerking: De techniek is hier gedemonstreerd door imaging goed 1.
3. Verplaats naar verschillende sites met de Live -functie totdat het cellen of weefsel bevindt onder het tabblad Sites te bezoeken . Handmatig richten op het monster of de Autofocuste gebruiken. Gebruik Snap om het beeld te leggen.
   Opmerking: Om te helpen bij het lokaliseren van het monster bij een hoge vergroting, gebruik het dialoogvenster plaat acquisitie en controle om de stap-grootte overal van 5 tot 100 µm te vinden van het monster als Autofocus niet kunt aanpassen.
4. Klik onder het tabblad W1 DAPI op Auto bloot. Zorg ervoor dat de Plaat overname Snap - DAPI beeld is scherp.
5. Onder het belangrijkste menu, klik op Journal te onthullen van de pull-down. Selecteer Run Journal....
6. Dubbelklik op het dagboek van de Schuif regio overname Setup te starten. Wanneer het dialoogvenster Setup schuif regio verwerving wordt weergegeven, selecteert u Doorgaan.
7. Wanneer geïnstrueerd, goed Selecteer de DAPI scannen om de lage-vergroting dia-afbeelding te selecteren. Druk op OK. Evenzo benadrukken de plaat overname Snap - DAPI gevraagd voor de plaat acquisitie module. Klik op OK.
8. Wanneer verschijnt het maken of laden regio's , gebruik van het gereedschap rechthoekig gebied om te selecteren (a) regio('s) van de rente over de DAPI scannen (Figuur 6). Druk op blijven.
   Opmerking: Het maximumgebied die kan worden geselecteerd op 40 X is 45 kolommen door 35 rijen. Als er meerdere regio's van belang zijn geselecteerd, zullen de regio's worden aangepast naar het vak met de grootste oppervlakte. De vakken kunnen worden verplaatst na het vergroten/verkleinen.
9. Selecteer Nee onder het dialoogvenster Belasting gebieden .
   Opmerking: Als u het Ja selecteert ladingen eerder opgeslagen regio's voor batches van dia's met dezelfde regio van belang locaties.
10. Met het gereedschap Locator Markeer de grootste regio van belang en druk blijven onder het dialoogvenster Gebied selecteren . Als het vak inhoudsgebieden bevestigen verschijnt, selecteert u Doorgaan. Beslissen of de regio worden opgeslagen moet wanneer het dialoogvenster Gebieden opslaan verschijnt.
11. Het volgende dialoogvenster Site afstand, kan de gebruiker kiezen naast elkaar, wat in een afbeelding met geen overlapping, of 10% overlappen resulteert. Kies een optie en klik op OK. De auteurs koos naast elkaar.
12. Drie dialoogvensters zal nu verschijnen. Het vak Setup voltooid kan worden ontslagen door het indrukken van Doorgaan. Houd het Overname Site opzetten voor 40 X (figuur 7A) geopend voor nu, omdat het maakt duidelijk hoeveel kolommen en rijen moeten worden ingevoerd in het vak van de Plaat overname Setup (figuur 7B). WellPositions het (Figuur 7 c) dat wordt weergegeven in de linkerbenedenhoek open houden voor de duur van de beeldvorming.
13. In het vak Plaat overname Setup onder Wells op bezoek, hetzelfde nummer van putten als regio's van belang eerder geselecteerd moet worden gemarkeerd (figuur 7D).
    Opmerking: De auteurs ontwikkeld dit protocol voor een maximum van negen regio's van de rente per dia. Als er meer, gewoon verhogen het aantal kolommen of rijen op het tabblad van de plaat - SlideScanning aan het aantal regio's van belang. Deze putjes vertegenwoordigen ruimtelijk niet de locatie van de regio's van belang op enigerlei wijze, maar het juiste nummer moet worden gemarkeerd (Klik met de linkermuisknop).
14. Ga naar het tabblad Sites te bezoeken . Voer in het vak Plaat overname Setup de voorgestelde kolommen en rijen (figuur 7B). Vergeet niet te klikken op de Tile sites.
15. Om te elimineren het giswerk van het vinden van de sites met het monster, drukt u op Verwerven plaat onder het tabblad Samenvatting het podium om bij te plaatsen de vooraf geselecteerde regio van belang. Zodra de camera over een site met cellen pannen, drukt u op Annuleren op de rechter benedenhoek te stoppen met de Beeldacquisitie. Zorgen voor de fase is nu gelegen over het monster.
16. Optimaliseer de instellingen van de golflengte om ervoor te zorgen dat een gerichte en een hoog dynamisch bereik beeld wordt verkregen. Wanneer tevreden, klik op het tabblad Samenvatting en Verwerven plaat.

7. de beeldanalyse

1. Selecteer de gewenste aangepaste module.
   Opmerking: De auteurs koos de module Meerdere golflengte cel scoren om aan te tonen van een automatische segmentatie van de hersenen tumor dia's.
2. De analyse uitvoeren op alle sites. Als de analyse gebruikte parameters hetzelfde voor meerdere dia's zijn, kan de analyse worden opgenomen in het vak van de Plaat overname Setup onder het tabblad Overname van de Post .
3. Zodra de analyse is voltooid, alle sites van slechte beeldkwaliteit om niet de resultaten bias uitsluiten. Aangezien het doel van deze analyse is te kwantificeren microglia en macrofagen in de tumor parenchym, selecteert u de regio van belang binnen de randen van de steekproef van de tumor. Bovendien sluiten de sites die worden onscherp en/of bevatten weefsel plooien of bubbels en tranen in het weefsel. Voor een demonstratie, de Vertegenwoordiger resultatente zien. Ook gebruiken de Laser focus score gegenereerd voor elke site afhankelijk van de amplitude van de reflectie van de laser als een drempel hieronder welke sites moeten worden uitgesloten (de drempel is klantgericht en afhankelijk van de parameters zoals de blootstellingstijd en de soort media gebruikt).
   Opmerking: De hoge vergroting beelden maken het mogelijk specifiek uitsluiten structuren, zoals de grote bloedvaten en gebieden van necrose, indien nodig. Het is ook mogelijk om alleen gebieden van belang, zoals die hypercellular. Op deze manier kunnen de specificiteit en nauwkeurigheid van de analyses worden verhoogd.

Resultaten

De beelden kunnen worden bekeken in de software van de WHCAS. Figuur 8 toont de hoge vergroting miniaturen van alle sites binnen de gedefinieerde regio van belang. Bekijk elke site ter identificatie van de degenen die worden van de analyse uitgesloten moeten (voorbeelden worden weergegeven bij lage en hoge vergroting in Figuur 8 en Figuur 9, respectievelijk). Bijvoorbeeld, Site 149 is onscherp (figuur 9A), Site-219 heeft bubbels (figuur 9B), en 54 van de Site bevat een vouw (figuur 9C) en dienen te worden uitgesloten. Het is typisch voor het uitsluiten van 10-15% van alle sites beeld. In het voorbeeld, 15,3% van de sites werden uitgesloten (25/300 had bubbels, 17/300 werden onscherp, 3/300 werden gevouwen, en 1/300 was op de rand). Figuur 10 bis is een representatief beeld gekozen voor analyse (de bijbehorende lage vergroting miniatuur wordt weergegeven in Figuur 8). Hier, de bijbehorende overlays gegenereerd door de module meerdere golflengte cel scoren tonen de resultaten van de automatische segmentatie uitgevoerd op Site 59, aangepast aan de auteurs specificaties (kernen minimale breedte = 2,5 µm, maximale breedte = 7,5 µm, en intensiteit boven lokale achtergrond = 35 graylevels; CD11b-positieve cellen minimale breedte = 4 µm, maximale breedte = 18 µm, minimale gekleurd gebied = 15 µm², en intensiteit boven lokale achtergrond = 310 graylevels; en CD45-positieve cellen minimale breedte = 4 µm, maximale breedte = 18 µm, minimale gekleurd gebied = 15 µm², en intensiteit boven lokale achtergrond = 50 graylevels). Na de segmentering van de kwantitatieve gegevens het aandeel van cellen kleuring positief voor iedere markeerdraad (6.2 ± 5,1% en 3,8 ± 2,1% van CD11b⁺ en CD45⁺ cellen, respectievelijk), beide markeerders (3,5 ± 2,1% CD11b⁺CD45⁺ cellen), geen markeringen (86,6 ± 9,0% CD11b^-CD45^- cellen; Figuur 10B), gemiddelde gekleurd gebied (40.0 ± 9.2 µm en 36.7 ± 7.6 µm van CD11b⁺ en CD45⁺ cellen, respectievelijk; Figuur 10 c), en intensiteit van de fluorescentie bedoel (408.9 ± 40,3 relatieve fluorescentie eenheden en 373.9 ± 38,1 relatieve fluorescentie eenheden van CD11b⁺ en CD45⁺ cellen, respectievelijk; Figuur 10 d) kan worden verkregen.

Afbeelding 1: instellingen voor dia acquisitie bij lage vergroting. A. deze afbeelding ziet u de instellingen van de plaat. B. hier worden de instellingen van de onderste plaat weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: instellingen voor dia acquisitie bij hoge vergroting. Deze figuur toont de selectie van de juiste tijdschriften. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: demonstratie over het laden van de dia's met behulp van de dia adapter. A. de dia is geplaatst dekglaasje aan naar beneden met het label aan de kant van de inkeping dia adapter. B. de adapter van de dia in het systeem van de hoge-inhoudsanalyse widefield is geladen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: dia voorbeeldinstellingen. A. dit cijfer worden de parameters voor de verwerving weergegeven. B. hier, worden de waarden voor de Hoescht/DAPI golflengte instellingen weergegeven. C. dit beeld toont de journal-instellingen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: tekening van een dia regio. A. het gereedschap rechthoekig gebied (de andere tekengereedschappen kunnen niet worden gebruikt.) wordt gebruikt voor het voorbeeldgebied scan selecteren en regio's van belang op de DAPI scan maken. B. de teal omtrek in deze afbeelding ziet u hoe het hele gebied van de dia (met inbegrip van het label) moet worden geselecteerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6: het creëren van regio's van belang op de voorbeeldscan. De voorvertoning of de DAPI scan vertegenwoordigt het volledige diagebied. In dit voorbeeld zijn er drie seriële hersenen weefselsecties (het effen witte rechthoekige omtrek). Het gebied boven deze secties vertegenwoordigt de circulaire etiketten op de dia. Andere sectie regelingen zal niet beperken de daaropvolgende selectie van gebieden van belang. De regio van belang in dit specifieke voorbeeld wordt met een onderbroken witte rechthoekige omtrek weergegeven. De scalebar = 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 7: essentiële windows voor hoge vergroting afbeelding acquisitie. A. de overname Site Setup venster zal blijken hoeveel kolommen en rijen binnen de regio('s) van belang zijn. B. zorgen voor het juiste aantal kolommen en rijen die zijn aangegeven in figuur 7A worden ingevoerd in het vak plaat overname Setup en de sites zijn betegeld. C. het is noodzakelijk het WellPositions-venster om open te houden voor de duur van de Beeldacquisitie hoewel het veld leeg is. D. het juiste aantal regio's van belang moet worden benadrukt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 8: representatief beeld van de regio van belang. Elke site kan worden weergegeven in een samengestelde foto voor de regio van belang. De representatieve sites die zijn uitgesloten (gemarkeerd met een rode dozen) en een voorbeeld van een opgenomen site (gemarkeerd met een groene doos) wordt weergegeven bij een hogere vergroting. Het is raadzaam om te controleren elke site om ervoor te zorgen dat er van voldoende kwaliteit voor de analyse. De scalebar = 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 9: voorbeelden van sites die worden van analyse uitgesloten moeten. A. het menselijk brein tumor secties hebben gekleurd met CD11b (groene) en CD45 (rood), markers van microglia en macrofagen. Dit beeld is onscherp en is uitgesloten van de analyse. B. bubbels zijn aanwezig in deze afbeelding die is uitgesloten van de definitieve analyse. C. Deze site was uitgesloten van de analyse vanwege de vouw in het weefsel. De schaal bars zijn 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 10: representatieve beelden en analyse. A. elke afbeelding wordt weergegeven naast de overlays voor het resultaat van de geautomatiseerde segmentatie. De overlay, kernen worden weergegeven in wit en positief gekleurde cellen worden weergegeven in het groen voor CD11b en rood voor CD45. Na uitsluiten van de sites van ontoereikende kwaliteit van de analyse en het combineren van de resultaten van alle resterende sites, B. de gemiddelde percentages van het totale aantal cellen in elke site die gekleurd positief voor iedere markeerdraad en co gelabeld voor beide markeerders, C. de gemiddelde gekleurd gebied, en D. de gemiddelde cel-intensiteit worden grafisch weergegeven. RFU = relatieve fluorescentie eenheden. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking. De schaal bars zijn 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

Een gemeenschappelijk probleem-nog steeds belemmeren de doeltreffendheid van de biologische wetenschap onderzoek is de ontwikkeling van protocollen voor de onpartijdige, nauwkeurige en precieze kwantificering van fluorescently-geëtiketteerden weefsels en hun structuren binnen. Significante hoeveelheid tijd en inspanning is gericht op het vinden van manieren om het analyseren van weefsel dia's, zodra zij hebben al beeld. Veel bestaande methoden bieden algoritmen voor gebruikers opnieuw binnen programma's^12,13,14. Deze methoden zijn aanvaardbaar, maar de betekenis van dit verslag is dat het in staat de gebruiker stelt om gemakkelijk en snel een holistische Beeldacquisitie en analyse-protocol als de gebruiker toegang tot een WHCAS heeft. Testen die celtypes te differentiëren en kwantificeren van meerdere structuren en processen, celcyclus analyse en nucleaire translocatie, bijvoorbeeld, zijn reeds beschikbaar in de bijbehorende software.

De installatie bestaat uit een paar kritische stappen. Ten eerste, de ruimtelijke parameters van de dia worden gedefinieerd als ware het een plaat. Ten tweede wordt een lage vergroting overzicht scan gemaakt waaruit de regio's van belang voor hoge vergroting imaging worden geselecteerd. Tot slot, sites die van invloed zijn op de nauwkeurigheid en precisie van latere analyses zijn uitgesloten. De grootste beperking van deze techniek is dat de toepasbaarheid ervan afhangt of de gebruiker toegang tot een WHCAS heeft. Echter, met de toenemende behoefte aan hoge-inhoudsanalyse systemen, veel instellingen verschaffen om hun onderzoekers te blijven concurrerend¹⁵. Probleemoplossing nodig is meestal wanneer weefselsecties niet dezelfde dikte hoeft. Als er meerdere regio's van belang zijn geselecteerd, zullen sommigen in focus terwijl anderen niet zullen. Idealiter tijdens afdelen, zou de gebruiker verzorgen om te maken van homogene monsters. Echter, als de monsters zijn inconsistent, de focus op de nucleaire vlek golflengte (of de helderste fluorophore van de gebruiker), die wordt gebruikt om zich te concentreren, kunnen worden aangepast voor elke regio van de out-of-focus van belang en zelfs voor elke gezichtsveld. Zoals de andere golflengten gewoon verschoven ten van de golflengte van de nucleaire vlek opzichte zijn, moet alleen deze golflengte aanpassing.

In dit verslag, we in detail te beschrijven hoe om te scannen en analyseren van dia's met behulp van een WHCAS en bijbehorende software. De multi golflengte cel scoren module kan de gebruiker automatisch tellen alle nucleaire of cytoplasmatische markeringen die fluorescently worden aangeduid. Na het instellen van de focus en bepaling van de cellulaire kenmerken zoals breedte en gebied voor het aanpassen van de module aan het weefsel beeld, is er geen verdere noodzaak voor de tussenkomst van de gebruiker om de verbeelde dia's en kwantitatieve gegevens te verkrijgen. Maximaal drie dia's tegelijk kan worden beeld en meerdere regio's van belang kunnen worden gedefinieerd. Dit protocol laat WHCAS gebruikers die nodig hebben voor het analyseren van de dia's profiteren van aanpasbare, multifunctionele, geautomatiseerde werkstromen die vereisen weinig tot geen optimalisatie en kunnen worden toegepast in alle projecten in de toekomst waarbij de histologische analyse van weefsel.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ImageXpress MicroXLS	Molecular Devices	NA	Apparaat voor beeldacquisitie
MetaXpress 5.1	Molecular Devices	NA	Geassocieerde software voor ImageXpress MicroXL (draait op een pc met het Windows-besturingssysteem).
Slide adapter	Molecular Devices	NA	Metalen diahouder die past in ImageXpress MicroXL
Slide_Region_Acquisition_revA.jzp	Molecular Devices	NA	Het tijdschrift kan worden verkregen van metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide of door contact op te nemen met een vertegenwoordiger van Molecular Devices
Slide_Region_Acquisition _Setup.JNL	Molecular Devices	NA	Selecteer dit tijdschrift in stap 6.6.