De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol bij het bepalen van protease specificiteit in ruwe muis weefsel extracten met behulp van spectrometrie van de MALDI-TOF.

Samenvatting

Proteasen zijn verschillende biologische functies, met inbegrip van eiwit activeren/inactiveren en voedsel spijsvertering. Identificeren van protease specificiteit is belangrijk voor het openbaren van protease-functie. De methode voorgesteld in deze studie bepaalt protease specificiteit door het meten van het molecuulgewicht van unieke substraten met behulp van de Matrix-bijgewoonde Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Time-of-Flight (MALDI-TOF). De substraten bevatten iminobiotin, terwijl de gekloofd site uit aminozuren bestaat en de spacer uit polyethyleen glycol bestaat. Het gekloofd substraat genereert een unieke molecuulgewicht met behulp van een gekloofd aminozuur. Een van de verdiensten van deze methode is dat het kan worden uitgevoerd in een pot met behulp van de ruwe monsters, en het is ook geschikt voor de beoordeling van meerdere monsters. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige experimentele methode geoptimaliseerd met monsters muis longweefsel, met inbegrip van weefsel extractie, plaatsing van spijsvertering substraten in monsters, zuivering van spijsvertering substraten onder verschillende pH-omstandigheden is onttrokken. , en de meting van de substraten molecuulgewicht met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF. Kortom, deze techniek maakt het mogelijk voor de identificatie van protease specificiteit in ruwe monsters afgeleid van extracten van weefsel met behulp van MALDI-TOF massa spectrometrie, die gemakkelijk kan worden opgeschaald voor meerdere monster verwerking.

Inleiding

Proteasen reguleren fysiologische processen door het splijten van eiwitten, en de inleiding van protease-activiteit op bepaalde tijdstippen en locaties is gereglementeerde¹. Het is daarom belangrijk om te identificeren van de expressie en de activiteit van weefsels die lokaal worden geregeld, en een nieuwe methode voor het detecteren van proteasen te ontwikkelen. De methode voorgesteld deze studie wil identificeren protease specificiteit parallel aan het opsporen van proteasen.

Er zijn enkele methoden voor het opsporen van protease specificiteit. De azocasein methode is bekend om het gebruik ervan in de opsporing van proteasen² maar is beperkt in zijn vermogen om verdere informatie te verkrijgen. Zymography is een andere uitgebreide protease-detectiemethode die kan worden gebruikt om te bepalen van het molecuulgewicht van proteasen³, maar het kan niet worden gebruikt voor het onderzoeken van substraat specificiteit. Protease specificiteit kan worden bepaald door spectrometrische assays, gebruik van substraten zoals p-nitroanilide⁴, en fluorimetrische vitrotests, met behulp van cumarine substraten⁵ of fluorescentie Resonance Energy Transfer (FRET) testen⁶. Deze methoden inschakelen single-specificiteit detectie van substraten die zijn opgenomen in een enkele goed. In de huidige studie, wordt de protease-specificiteit van extracten van weefsel onderzocht onder verschillende omstandigheden, zoals deze extracten meerdere proteasen bevatten. Protease-activiteit wordt geregeld door verschillende factoren, inclusief pH, coënzymen en prosthetic groepen ion sterkte. Onlangs, proteomics gebaseerde methoden zijn gebruikt voor het identificeren van protease specificiteit; bijvoorbeeld de methode gerapporteerd door Biniossek et al. ⁷ de Proteoom gebruikt om te bepalen van substraat specificiteit zelfs in grove extracten en nauwkeurige bepaling van de activiteit van de splitsing van proteasen die meerdere aminozuur sequenties^{8 herkent}staat. Deze methode is echter niet geschikt voor de analyse van de talloze voorbeelden. Daarentegen onze methode maakt de gelijktijdige verwerking van meerdere monsters, en het gebruik van de Matrix-Assisted Laser desorptie/ionisatie Time-of-Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie voor analyse van monster vergemakkelijkt een snelle en gemakkelijke opsporing van de gekloofd substraten.

Dit document schetst een methode om te evalueren van protease specificiteit met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF voor het meten van het molecuulgewicht van unieke substraten. De moleculaire vormen van gekloofd substraten, samen met hun theoretische molecuulgewichten, worden weergegeven in Figuur 1 en tabel 1. Eerdere studies hebben gebruik gemaakt van substraten met polyglycine spacers en biotine⁹; echter zijn deze substraten gebrekkig omdat de volgorde van de polyglycine kan worden cleaved door enzymen die de glycine-volgorde herkent. Daarnaast is de hoge affiniteit tussen avidin en biotine kan leiden tot een lage opbrengst. Om op deze nadelen, in deze studie we gesynthetiseerd een uniek substraat, die bestond van polyethyleenglycol (PEG), iminobiotin en een aminozuur dat de breukzijde (Figuur 1 identificeren kon). Om te discrimineren tussen aminozuren gelijkaardige molecuulgewichten, werd D-serine toegevoegd tussen de pin spacer en het aminozuur op de gekloofd site.

De N-terminal van het substraat werd aangeduid met iminobiotin, waarmee de zuivering van de affiniteit van ruwe monsters. Het gebruik van iminobiotin in plaats van Biotine is van cruciaal belang; Biotine heeft een sterke affiniteit met avidin, wat in terugwinning van de lage tarieven van biotine-geëtiketteerden substraten uit avidin hars, resulteert terwijl iminobiotin de affiniteit voor avidin kan worden gewijzigd door pH. Iminobiotin-geëtiketteerden substraten zal binden aan de avidin in omstandigheden boven pH 9, terwijl avidin releases iminobiotin-geëtiketteerden substraten in voorwaarden hieronder pH 4. Daarom werd iminobiotin gebruikt voor affiniteit zuivering¹⁰. In samenvatting beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het opsporen van protease specificiteit met behulp van unieke substraten.

Protocol

Dierlijke experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Nihon farmaceutische Universiteit de ethische Commissie en uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de Nihon farmaceutische Universiteit. Het protocol is aangepast voor weefsel extracten afgeleid van ICR muizen. ICR muizen werden gekocht van Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japan)

1. bereiding van het substraat Iminobiotin-label

Het substraat ondergaat solid-phase-synthese 9-fluorenylmethyloxycarbonyl groep (Fmoc)-beschermd aminozuren zoals hieronder¹¹beschreven. Tabel 2 gebruiken om te bepalen van de Fmoc-verbinding gebruikt, afhankelijk van de gewenste aminozuur en fase van synthese.

1. Swill 0.2 g Fmoc-NH-SAL hars met 10 mL N, N-dimethylformamide (DMF) in een synthese-kolom.
2. Voeg 5 mL van 30% piperidine in DMF. Rock de oplossing voor 10 min te klieven van de Fmoc-groep.
3. Controleer Fmoc met het trinitrobenzenesulfonic zuur (TNBS) splijten test¹²: Voeg 10 µL van 1% TNBS in DMF en 10 µL van diisopropylethylamine (DIPEA) naar een 10 x 75 mm² glazen buis en een kleine hoeveelheid hars overdracht aan het glas tube. De Fmoc-gekloofd hars moet ontwikkelen een oranje kleur.
   1. Herhaal stap 1.2-1.3 als dit resultaat negatief is.
4. Wassen van de hars driemaal met 5 mL DMF.
5. Voeg toe 5 mL DMF met 0.3 mmol van de Fmoc-samengestelde vermeld in tabel 2 (te beginnen met de stof gebruikt in fase 1), 0.3 mmol van O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorfosfaat (HCTU), 0.3 mmol van 1- Hydroxy-1H-benzotriazole monohydraat (HOBt) en 0,6 mmol van diisopropylethylamine (DIPEA). De oplossing voor 30 min aan het echtpaar met de hars rock.
   1. Controleer deze stap met de TNBS test. Als het resultaat positief is, betekent dit de reactie niet voldoende vooruitgang geboekt en deze stap moet worden herhaald.
6. Wassen van de hars driemaal met 5 mL DMF.
7. Herhaal de rek reactie door stappen te herhalen 1.2-1.6, wijzigen van de Fmoc-compound gebruikt in stap 1.5 volgens tabel 2.
8. Voeg 1 mL 2,5% water, 1% triisopropylsilane (TIS), en 2,5% ethanedithiol (EDT) in trifluorazijnzuur te klieven van peptiden uit de groepen hars en bescherming. Rock de oplossing voor 60 min.
9. Filteren, en Vang filtraat op in een 50 mL-buis.
10. Voeg 40 mL koude diethyl ethanol en winkel 's nachts bij-20 ° C.
11. Centrifuge 4000 x g bij-20 ° C gedurende 30 minuten verzamelen de pellet.
12. Gebruik een exsiccator gedurende 3 uur te verwijderen van de diethylether.
13. Voeg 1 mL acetonitril 50% aan water en los van de ruwe peptiden. Lyophilize de oplossing Schakel trifluorazijnzuur. Herhaal deze stap meerdere keren.
14. Zuiveren de peptiden een C18 cartridge kolom gebruiken.
    1. Activeer de hars in de C18 cartridge kolom met behulp van 3 mL acetonitril (ACN).
    2. Equilibreer met 5 mL 5% ACN, 0,1% TFA in H₂O.
    3. De ruwe synthetische peptiden in de kolom C18 cartridge laden.
    4. Wassen met 10 mL 5% ACN, 0,1% TFA in H₂O.
    5. Elueer de monsters met 3 mL 60% ACN, 0,1% TFA in H₂O.
15. Controleer de peptiden door het meten van hun molecuulgewicht met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF.
    1. Pipetteer 1 µL van eluens op een doel-plaat. Onmiddellijk toevoegen verzadigde α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (CHCA) oplossing in 50% acetonitril in 0,1% trifluorazijnzuur
    2. Kristalliseren het mengsel door droging.
    3. Verwerven van massaspectra van monsters volgens protocol van de fabrikant van het instrument.
       1. Handmatig in te stellen de MALDI-TOF massa spectrometer op een positieve wijze weerspiegelen.
       2. Kalibreren van de massaspectrometer met behulp van CHCA, bradykinine fragment 1-7 (exacte moleculaire gewicht = 756.3997 Da), en angiotensine II (exacte moleculaire gewicht = 1,045.5423 Da).
       3. Verwerven van de massaspectra van synthetische peptides, en dan beoordelen door het te vergelijken met de theoretische molecuulgewicht.

2. bereiding van extracten van weefsel

1. Anesthetize mannelijke ICR muizen in een zaal van Isofluraan inademing en controleer of anesthesie diepte via teen snuifje. De muizen door cervicale dislocatie euthanaseren.
2. Met behulp van schaar, maken een middellijn abdominale incisie via de huid uit te breiden tot de xiphoid process.
3. Het middenrif doorsnijden en het verzamelen van alle longweefsel. Het weefsel wordt in kleine stukjes gesneden.
4. Het wassen van het weefsel driemaal met ijskoude 50 mM Tris-gebufferde zoutoplossing (pH 7.4).
5. Weeg de weefsels en de overdracht ongeveer 100 mg van weefsels aan een 12 x 75 mm² glazen buis.
6. Voeg 0.3 mL van de extractie-buffer (50 mM Tris-buffer, pH 7.4, met 0,1% poly (oxyethylene) octylphenyl ether).
7. Meng het Long weefselmonsters met behulp van een mengen homogenizer.
   1. Koel de monsters op ijs.
   2. Meng de monsters op 20.000 rpm voor 30 s in een blender. Herhaal deze stap totdat de monsters volledig homogeen zijn.
      Opmerking: Het niet meng gedurende meer dan 1 minuut continu, om te voorkomen dat een stijging van de temperatuur.
8. 1.000 µL van het homogenaat overbrengen in een tube 1,5 mL en Centrifugeer gedurende 5 min bij 10.000 x g bij 4 ° C.
9. 500 µL van het supernatans overbrengen in een nieuwe 1,5 mL plastic buis.
10. Gebruik 10 µL van het monster te bepalen eiwitconcentratie, met methoden, zoals de bicinchoninic zuur (BCA) of de methode Coomassie briljant blauw (CBB).
11. Om te voorkomen dat bevriezing, 80% glycerol aan de monsters voor een eindconcentratie van 50% glycerol te toevoegen.
12. Het bewaren van de monsters bij-80 ° C tot verder gebruik.

3. vertering van substraten in Model Protease en weefsel extracten

1. Voeg 10 µL van 0,1 µg/µL van N-tosyl-L-fenylalanine chloormethyl keton (TPCK)-trypsine, 0,1 µg/µL van Staphylococcus aureus V8 protease of 10 µg/µL van weefsel extracten in 890 µL van een buffer van de spijsvertering.
   1. Gebruiken om te verduidelijken het verschil in protease specificiteit afhankelijk van de pH, buffers aangepast aan de pH 3, 5, 7 en 9. De samenstelling van de spijsvertering-buffer wordt weergegeven in tabel 3.
   2. Verrichten van een negatieve controle met behulp van inactieve protease in weefsel extracten, bereid door incubatie in kokend water (of verwarming bij 100 ° C) gedurende 10 minuten.
2. Voeg 10 µL van iminobiotin-label substraten (ontbonden in dimethylsulfoxide (DMSO), eindconcentratie = 100 pmol/10 µL).
3. Incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C te verteren iminobiotin-geëtiketteerden substraten.
4. Na incubatie, stoppen met de vertering van substraten met kokend water (of door verwarming bij 100 ° C) gedurende 10 minuten.
5. Centrifugeer het verteerd substraten voor 5 min bij 10.000 x g bij 4 ° C.
6. Breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe 1,5 mL-buis.

4. zuivering van het Iminobiotin-label substraat

1. Voeg 50 µL van 50% streptavidine sepharose kralen in 1 M Tris-buffer (pH 9) met 0,1% poly(oxyethyleen) octylphenyl ether.
   1. PH test papier gebruiken om ervoor te zorgen dat de oplossing ongeveer pH 9 is. Als de pH van de oplossing laag is, deze aanpassen aan ongeveer pH 9 door toevoeging van 1 M Tris-buffer (pH 9) met 0,1% poly(oxyethyleen) octylphenyl ether. Deze stap is belangrijk, als het gaat om de binding van het iminobiotin-label substraat naar daar.
2. Na een nacht bebroeden bij 4 ° C met continue Zacht mengen op een rotator wiel de iminobiotin-geëtiketteerden substraten binden aan de streptavidine. De kralen moeten blijven geschorst tijdens de incubatie.
3. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 10.000 x g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
4. Wassen de kralen vijfmaal als volgt:
   1. Voeg 1.000 µL van een wash-buffer (50 mM Tris-buffer, pH 9) aan de kralen.
   2. Wassen gedurende 10 minuten bij 4 ° C met continue Zacht mengen op een rotator-wiel. De kralen moeten blijven geschorst tijdens de incubatie.
   3. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 10.000 x g bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende substantie.
5. Voeg 100 µL van 0,2% trifluorazijnzuur aan de kralen.
   1. PH test papier gebruiken om ervoor te zorgen dat de oplossing lager dan pH 2 is. Als de pH van de oplossing hoog is, breng de pH op hieronder 2 door toevoeging van 1% trifluorazijnzuur.
6. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met continue Zacht mengen op een rotator-wiel.
7. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 10.000 x g bij 4 ° C, dan het supernatans naar een nieuwe 1,5 mL-buis.

5. voorbereiding en Laser Matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie Time-of-Flight massaspectrometrie (MALDI-TOF massa spectrometrie) proeven

Opmerking: Alle oplossingen in de volgende stappen moeten worden bereid met hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC)-rang of aminozuur sequencing-grade water.

1. Pipetteer 500 µL van acetonitril op een C18-hars om het te activeren. Verwijder de gebruikte acetonitril. Herhaal deze stap drie keer.
2. Equilibreer de C18-hars met 100 µL van 0,1% trifluorazijnzuur. Verwijder de elutievloeistof. Herhaal deze stap drie keer.
3. Voor het laden van de monsters, de monsters aan de hars met behulp van een precisiepipet te binden.
4. Wassen van de hars met 20 µL van 0,1% trifluorazijnzuur. Herhaal deze stap vijf keer.
5. Elueer de monsters met 3 µL van 60% acetonitril in 0,1% trifluorazijnzuur. Pipetteer het eluent op een doel-plaat voor MALDI-TOF massa spectrometrie. Onmiddellijk vergroten met verzadigde α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (CHCA) oplossing in 50% acetonitril in 0,1% trifluorazijnzuur.
6. Kristalliseren het mengsel door droging.
7. Verwerven van massaspectra van monsters volgens protocol van de fabrikant van het instrument.
   1. Handmatig in te stellen de MALDI-TOF massa spectrometer op een positieve wijze weerspiegelen.
   2. Kalibreren van de massaspectrometer met behulp van CHCA, bradykinine fragment 1-7 (exacte moleculaire gewicht = 756.3997 Da), en angiotensine II (exacte moleculaire gewicht = 1,045.5423 Da).
   3. Het verwerven van de massaspectra van monsters, veel aandacht aan de massaspectra van 700 tot 900 Da voor het gekloofd formulier van de substraten Biotine-label.
8. Het identificeren van de gedetecteerde pieken met behulp van tabel 1. Opsporing van de desbetreffende moleculair gewicht geeft aan decollete in de C-terminus van de relevante aminozuur.

Resultaten

Evaluatie van de methode voor de identificatie van protease specificiteit door model protease

De efficiëntie van dit systeem werd geëvalueerd aan de hand van TPCK-trypsine en V8 protease, waarvan substraat specifieke kenmerken werden verkregen. TPCK-trypsine en V8 protease werden geschat op het klieven van het aminozuur-reeks in de C-terminal van de lysine en arginine residuen, en aan de zijkant van de carboxy het asparaginezuur en...

Discussie

Dit protocol gebruikt van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF om te identificeren protease specificiteit in ruwe monsters afgeleid van extracten van weefsel en gemakkelijk voor meerdere monster verwerking kan worden opgeschaald. In het bijzonder, we gemanipuleerd pH om te veroorzaken een verandering in de specificiteit van het substraat.

De avidin-Biotine complexe (ABC) methode, die wijd verbeid in de biochemie vanwege haar bindende specificiteit gebruikt is, werd gebruikt in ons pr...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyfenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]fenoxyhars)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00102
N,N-dimethylformamide (DMF)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00185
piperidine	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00176
trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS)	WAKO Chemical	209-1483
O-(6-Chloor-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorofosfaat (HCTU)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00067
1-Hydroxy-1H-benzotriazool,monohydraat (HOBt)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00014
diisopropylethylamine (DIPEA)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00030
triisopropylsilaan (TIS)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00170
ethaandithiol (EDT)	Watanabe Chemical Co., Ltd.	A00057
trifluorazijnzuur (TFA)	Millipore	S6612278 403
acetonitril	Kokusan Chemical	2153025
C18 cartridgekolom	Waters	WAT051910
poly(oxyethyleen) octylfenyleether	WAKO Chemical	168-11805	Triton X-100
menghomogenisator	Kinematica	PT3100	polytron homogenisator
Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250	Nakarai Chemical	094-09
glycerol	Nakarai Chemical	170-18
N-tosyl-L-fenylalanine chloormetketon (TPCK)-trypsine	Sigma-Aldrich	T1426
dimethylsulfoxide (DMSO)	WAKO Chemical	043-07216
streptavidine sefarose	GE Healthcare	17-511-01
ZipTipC18	Millipore	ZTC18S096
α-cyano-4-hydroxycinnaminezuur (CHCA)	Sigma-Aldrich	C2020
MALDI-TOF massaspectrometrie	Bruker Daltonics, Duitsland	autoflex
2-iminobiotine	Sigma-Aldrich	I4632
Fmoc-aminozuren	Watanabe Chemical Co., Ltd.