Methodenartikel

Retrospectieve MicroRNA Sequencing: CDNA Bibliotheek voorbereiding Protocol met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde RNA Specimens

DOI:

10.3791/57471

⸱

5 mei 2018

 ,  ,  , 
1Department of Research, Hackensack University Medical Center, 2Department of Medical Sciences, Seton Hall University, 3Department of Epidemiology and Population Health, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Nephrology and Hypertension, Hadassah - Hebrew University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Paraffine-ingebedde specimens formaline-vaste vormen een waardevolle bron van moleculaire biomarkers voor ziekten bij de mens. Hier presenteren we een laboratorium gebaseerde cDNA Bibliotheek voorbereiding protocol, in eerste instantie ontworpen met vers bevroren RNA, en geoptimaliseerd voor de analyse van gearchiveerde microRNAs uit weefsels tot 35 jaar opgeslagen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

– Gearchiveerd, klinisch ingedeeld formaline-vaste kunnen paraffine-ingebedde (FFPE) weefsels voorzien nucleïnezuren retrospectieve moleculaire studies van de ontwikkeling van kanker. Met behulp van niet-invasieve of vooraf kwaadaardige laesies van patiënten die later het ontwikkelen van invasieve ziekte, kunnen gen expressie analyses helpen identificeren van vroege moleculaire veranderingen die naar cancer risk predisponeren. Het is goed beschreven dat nucleïnezuren verhaald FFPE weefsels ernstige fysieke schade en chemische wijzigingen, die bemoeilijken hun analyse en in het algemeen vereist aangepast tests hebben ondergaan. MicroRNAs (miRNAs), maar die een kleine klasse vertegenwoordigen van RNA-moleculen die slechts tot ~ 18-24 nucleotiden, is aangetoond dat langdurige opslag weerstaan en hebben met succes is geanalyseerd in FFPE monsters. Hier presenteren we een 3' barcoded complementaire DNA (cDNA) bibliotheek voorbereiding protocol specifiek geoptimaliseerd voor de analyse van kleine RNAs geëxtraheerd uit gearchiveerde weefsels, die onlangs werd aangetoond als robuust en zeer reproduceerbaar, wanneer met behulp van gearchiveerd klinische monsters opgeslagen tot 35 jaar. De voorbereiding van deze bibliotheek is goed aangepast aan de multiplex analyse van gevaar/gedegradeerd materiaal waar RNA samples (maximaal 18) zijn afgebonden met individuele 3' barcoded adapters en vervolgens samen gebundeld voor verdere enzymatische en biochemische preparaten vóór de analyse. Alle purifications worden uitgevoerd door polyacrylamide gelelektroforese (pagina), waarmee de grootte-specifieke selecties en verrijking van barcoded kleine RNA soorten. Dit cDNA Bibliotheek voorbereiding is goed aangepast aan minuut RNA ingangen, als een pilot polymerase-kettingreactie (PCR) vaststelling van een specifieke versterking cyclus toelaat te produceren optimale hoeveelheden materiaal voor het rangschikken van de volgende generatie (NGS). Deze aanpak is geoptimaliseerd voor het gebruik van aangetaste FFPE RNA uit monsters van maximaal 35 jaar gearchiveerd en biedt zeer reproduceerbaar NGS-gegevens.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miRNAs zijn opmerkelijk goed bewaard in formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) exemplaren1,2,3. Vorige werk heeft aangetoond dat de uitdrukking van deze korte regelgevende niet-coderende één gestrande molecules van RNA met succes kan worden geëvalueerd met behulp van totaal RNA van FFPE monsters en relevante gen expressie gegevens in vergelijking met de originele fresh weefsels4,5,6,7,8. In vergelijking met grote messenger RNAs, die hebben aangetoond dat kritisch worden beïnvloed door FFPE weefsel verwerking (formaldehyde, hitte, uitdroging, enz.), endogene RNases, en de leeftijd van de specimens, de geringe omvang van miRNAs (~ 18-24 nucleotiden) verschijnt ze resistent tegen afbraak en veerkrachtig voor langere termijn opgeslagen, ook aangetoond door miRNA expressie studies die beter te presteren dan high-throughput mRNA studies in gearchiveerde exemplaren9te maken. miRNA expressie studies met behulp van gearchiveerde klinische monsters, die meestal in kleinschalige analyses zijn uitgevoerd, hebben aangetoond dat één of multiplexed kwantitatieve PCR-testen, verschillende soorten technologieën van microarray, en meest recent NGS kan worden gebruikt ter beoordeling van de expressie van bewaarde miRNAs na optimalisering van deze testen10,11,12,13,14.

Gezien het feit dat disregulatie van miRNA expressie geassocieerd met de ontwikkeling van een verscheidenheid van menselijke maligniteiten is geweest en dat er potentieel een enorm aanbod van klinisch is geannoteerde gearchiveerde exemplaren, is duidelijk geworden dat deze kleine RNA moleculen vormen een veelbelovende bron van potentiële kanker biomarkers15,16,17,18. Het gebruik van een high-throughput gen expressie technologie zoals NGS heeft het voordeel van een globale beoordeling van alle miRNA afschriften in vergelijking met gerichte technologieën zoals PCR en/of microarrays19. Om deze reden is een geoptimaliseerde, betaalbare en gemakkelijk toepasbare protocol voorbereiding cDNA Bibliotheek van kleine RNAs van oudere gearchiveerde exemplaren voor NGS geoptimaliseerd zodat grootschalige retrospectieve studies20.

Wij eerder vastgestelde een gelijktijdige RNA/DNA-extractie-protocol voor afzonderlijke terugwinning van RNA en DNA uit oudere gearchiveerde exemplaren, die wij beter te presteren dan hedendaagse commerciële kits21gevonden. Met behulp van dit protocol extractie te verkrijgen van totaal RNA van FFPE weefsels gearchiveerd voor langere periode van tijd, wij de voorbereiding van cDNA bibliotheken voor NGS van miRNAs in klinische monsters bewaard tot 35 jaar geoptimaliseerd. Bovendien, in een onlangs gepubliceerde studie waar we bereid cDNA bibliotheken van klinisch geclassificeerde ductaal carcinoma in situ (DCIS) exemplaren, we geïdentificeerd differentially uitgedrukte miRNAs die werden gevalideerd door kwantitatieve PCR, die aangegeven dat specifieke miRNA expressie verandert kan in DCIS laesies van patiënten die de ontwikkeling van kanker van de borst in vergelijking met DCIS laesies van patiënten die geen borstkanker ontwikkelen opgespoord worden.

Gelet op de kosten van commerciële kits voor voorbereiding van kleine RNA-cDNA bibliotheken, het potentieel voor hun stopzetting, evenals het gebruik van/octrooi beschermd reagentia die niet kan worden geoptimaliseerd, we besloten aan te passen een eerder gepubliceerde laboratorium gebaseerde en kit-gratis 3' barcoded cDNA Bibliotheek voorbereiding protocol voor NGS van kleine RNAs gearchiveerd in FFPE exemplaren, waardoor gelijktijdige analyse van 1822monsters. Dit protocol biedt een ideale en robuuste stapsgewijze procedure met visuele en technische evaluatie controleposten, die kritisch zijn voor de aanpassing aan FFPE RNA exemplaren waren, en heeft een sterk potentieel voor toepassing naar andere bronnen van gecompromitteerde of moeilijk RNA om materiaal te gebruiken. Van het protocol van het oorspronkelijke toepasbaarheid werd verbeterd door vervanging van radioactief gelabelde grootte markeringen met TL (bvSYBR Gold) aantoonbaar RNA grootte markeringen gebruikt tijdens de selectie van ligaturen bibliotheken op grote polyacrylamide gels. Dit geoptimaliseerd protocol is afhankelijk van de afbinding van 3' barcoded adapters met 18 afzonderlijke FFPE RNA-modellen, die dan samengevoegd samen te ondergaan adapter afbinding 5', omgekeerde-transcriptie en een pilot PCR-analyse voor op maat van versterking van de definitieve cDNA bibliotheek voorafgaand aan grootschalige PCR versterking, reiniging, en NGS op een hoge doorvoersnelheid sequencer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. voorbereiding van alle reagentia en Primers

  1. Bestel alle inleidingen en adapters, zoals beschreven in Figuur 1.
  2. Bereiden de kalibrator cocktail voorraad, die in elke afzonderlijke afbinding zal worden verrijkt.
    1. Resuspendeer de vervoerder oligonucleotide (Figuur 1) naar 0,5 µM met RNase-gratis water. Resuspendeer de 10 kalibrator oligonucleotides (Figuur 1) naar 100 µM met 0,5 µM vervoerder oligonucleotide oplossing.
    2. Combineer 10 µL van elk van de 10 kalibratoren in een gesiliconiseerd microcentrifuge te verkrijgen van een 100 µM cocktail kalibrator voorraad, en bereid een 0.026 nM-oplossing om op te slaan bij-20 ° C.
  3. Verdun de 20 unieke, gelyofiliseerd, adenylated 3' adapters met RNase-gratis water met een eindconcentratie van 50 µM (Figuur 1).
    Opmerking: Het wordt aanbevolen om te bereiden 2.5 µL aliquots van elke adapter in individuele gesiliconiseerd buizen en bewaar ze bij-80 ° C voor maximaal 2 jaar.
  4. Resuspendeer de desalted 19 nt-3' adapter en 24 nt-3' adapter grootte markering oligonucleotides tot 250 ng/mL (Figuur 1).
  5. Resuspendeer de HPLC gezuiverde 5' adapter aan 100 µM met RNAse-gratis water. Resuspendeer de 5' en 3' PCR inleidingen tot 100 µM met behulp van RNase-gratis water (Figuur 1).
    Opmerking: Aliquot alle oligonucleotides in hoeveelheden die nodig zijn voor 1-2 experimenten en winkel bij-80 ° C.
  6. Bereiden de polyacrylamide denaturering (PAA) gel laden kleurstof door het combineren van 98,8% formamide, 1% (v/v) 0.5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0 en 0,2% bromophenol blauw, en 1 mL aliquots vastgesteldop-80 ° C.
    1. Bereid de 0.5 M nb-2H2 EDTA-oplossing door het 18,6 g nb2H2 EDTA poeder toevoegen aan 50 mL water nuclease-vrij. NaOH pellets te bereiken pH 8,0 toevoegen. Stel het volume tot 100 mL te verkrijgen van een 0.5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0 stamoplossing.
    2. Weeg 15 mg bromophenol blauw in een aparte 15 mL-buis. Voeg 600 µL nuclease-gratis water. Voeg 14.25 mL-geïoniseerde formamide. Voeg 150 µL van de 0.5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0 oplossing.
    3. Aliquot de PAA eindoplossing 15 ml in 1 mL aliquots bij-80 ° C.
  7. Voorbereiden van de 5 x agarose gel laden kleurstof door het combineren van 0,2% bromophenol blauw, 0,2% xyleen cyanol FF 50 mM nb2H2 EDTA, pH 8,0 en 20% densiteitgradiënt Type-400.
    1. Resuspendeer 1,86 g nb2H2-EDTA in 50 mL nuclease-gratis water in een bekerglas van 400 mL op een magneetroerder bij kamertemperatuur (RT). NaOH pellets te bereiken een pH 8,0 toevoegen. Voeg nuclease-gratis water tot 100 mL om te verkrijgen van een 50 mM nb2H2 EDTA-oplossing.
    2. Weeg bromophenol blauw poeder 20 mg, 20 mg xyleen cyanol FF poeder en 2 g densiteitgradiënt Type-400 poeder, en resuspendeer in 5 mL 50 mM nb2H2 EDTA.
    3. Vortex de buis met de drie kleurstoffen en voeg 5 mL 50 mM nb2H2 EDTA. Meng de 5 x agarose gel laden kleurstof, bereiden 1 mL aliquots en opslaan bij-80 ° C.

2. instellen van de 3' Barcoded Adapter Ligations met 18 afzonderlijke RNA Samples

  1. Identificeren van 18 afzonderlijke exemplaren van het RNA (pre-aliquoted op 100 ng in 9,5 µL van nuclease-gratis water in 1,5 mL gesiliconiseerd microcentrifuge buizen), en zet de buizen op ijs te ontdooien gedurende 10 minuten.
  2. De 10 x RNA Ligase Buffer (zonder ATP) vers bereiden.
    1. Combineren in een 1,5 mL gesiliconiseerd microcentrifuge buis, 343 µL van RNase-gratis water, 500 µL van Tris 1 M pH 7.5, 100 µL van 1 M MgCl2, 50 µL van 20 mg/mL bovien serumalbumine en 7 µL van 14 M 2-mercaptoethanol. Meng door flicking de buis, centrifuge voor 2 s op 2.000 x g en RT en instellen op ijs.
      Opmerking: Alle stappen in dit protocol die aangeven "centrifuge voor 2 s" worden uitgevoerd in de microcentrifuge van een benchtop op RT en een topsnelheid van 2.000 x g oplossingen op de bodem van de buizen.
  3. Bereiden van 50% waterige DMSO voorraad door toevoeging van 1 mL van RNase-vrij water tot 1 mL van DMSO in een 2 mL gesiliconiseerd microcentrifuge buis, de buis wikkel in aluminiumfolie en opslaan op RT.
  4. Ontdooi de 0.026 nM kalibrator cocktail op het ijs voor 10 min. de afbinding Master Mix voorbereiden door te combineren in de volgende volgorde in een tube van de microcentrifuge 1,5 mL gesiliconiseerd: 40 µL van 10 x RNA Ligase Buffer en 120 µL van 50% waterige DMSO met behulp van een precisiepipet 200 mL , en voeg 10 µL van 0.026 nM kalibrator cocktail met behulp van een precisiepipet 10 µL. Flick de 1,5 mL-buis te mengen, Centrifugeer gedurende 2 s, en stel het op ijs.
  5. 8,5 µL van afbinding Master Mix toevoegen aan elk van de 18 individueel aliquoted FFPE RNA monsters, zachtjes flick de buizen, centrifuge voor 2 s, en winkel op ijs.
  6. Ontdooi 2.5 µL aliquots van elk van de 18, 3' barcoded adapters en leg ze op het ijs te ontdooien voor 20 min.
    1. Gebruik een pipet 3-µL 1 µL van elke adapter overbrengen naar de overeenkomstige FFPE RNA monsters met RNA en Afbinding Master Mix (d.w.z., 9,5 µL + 8,5 µL).
    2. Niet op en neer Pipetteer, gewoon afzien in de vloeistof en het puntje uitlichten. Zorg ervoor dat tips tussen FFPE RNA monsters wijzigen. Sluit elke buis, flick om te mengen, centrifuge voor 2 s, en instellen op ijs.
  7. Het denatureren van de reacties door het plaatsen van de 18 buizen op een warmte blok bij 90 ° C gedurende 1 min en vervolgens onmiddellijk plaats op ijs.
  8. Bereid de afbinding enzym oplossing door verdunning 10 µL van afgeknotte K227Q T4 RNA Ligase 2 met 10 µL van RNase-vrij water in een verse 1,5 mL gesiliconiseerd microcentrifuge buis.
  9. Gebruik een pipet 3 µL 1 µL van het enzym verdunde afbinding overbrengen naar elk van de 18 RNA monsters (niet Pipetteer op en neer, en wijzigen van tips tussen elke buis). Stand van de 18 ligations op ijs en plaatsen in een koude kamer van 4 ° C voor een overnachting incubatie van 18u.

3. de zuivering van de ligaturen kleine RNAs

  1. Deactiveren van de afbinding reacties door de 18 buizen voor 1 min op een warmte blok bij 90 ° C te plaatsen en ga vervolgens terug om ijs gedurende ten minste 2 minuten om af te koelen.
  2. Bereiden de neerslag Master Mix door toevoeging van 1 µL van blauwe kleurstof covalent gekoppeld aan glycogeen om 26 µL van 5 M RNase-gratis NaCl in een verse gesiliconiseerd microcentrifuge buis.
    1. Pipetteer 1.2 µL van de neerslag Master Mix in elk van de 18 buizen. 63 µL van 100% ethanol toevoegen aan elk van de 18 buizen. Sluit elke buis, flick te mengen, Centrifugeer gedurende 2 s, en plaats de buizen op ijs. De inhoud van alle 18 buizen combineren in een enkele 1,5 mL gesiliconiseerd buis.
    2. Sluit de buis, driemaal aan mix, centrifuge voor 2 s en op ijs voor 60 min te precipiteren omkeren.
  3. Een groot (16 x 20 cm2) 15% polyacrylamidegel voorbereiden door pagina.
    1. Gegoten twee gesiliconiseerd glasplaten (behandeld met een veilig alternatief voor silane coatings) 0,1 cm spacers.
    2. Combineer 9 mL systeem verdunningsmiddel, 18 mL systeem concentraat, 3 mL buffer systeem, 240 µL van APS (9%) en 12 µL van TEMED in een tube van 50 mL.
    3. Breng de pagina gel oplossing tussen de glasplaten met behulp van een precisiepipet 30 mL, invoegen van een 14-well kam (0,1 cm dik) en laat de gel gedurende 30 minuten op RT stollen.
  4. Centrifugeer de 1.5-mL-buis met de gebundelde ligations bij 16.000 x g- en 4 ° C gedurende 60 minuten.
  5. Verwijder de kam. Reinig de putten rijkelijk met RNase-gratis water met behulp van een spuit fles met een 200 µL tip op het einde te bereiken binnen de putten en un-gepolymeriseerde acrylamide (één goed tegelijk) boven een gootsteen te dwingen. Instellen van de 15% pagina op een gel-apparaat, de reservoirs Vul met 0,5 x Tris-boraat EDTA (FSME) oplossing, en vooraf de gel gedurende 30 minuten op 450 V worden uitgevoerd.
  6. Herstellen van de buis met gebundelde ligations van de centrifuge en zorgvuldig drogen de RNA-pellet.
    1. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een 1 mL pipet tip maar wat vloeistof op de bodem verlaten. Kantelen van de buis en gebruik een 20 mL pipet te verwijderen van de resterende bovendrijvende vloeistof zonder het aanraken van de pellet. Vacuüm zuignap de buis met behulp van een pipet van Pasteur met een 10-µL tip op het einde, zonder te raken de pellet.
    2. Resuspendeer de pellet RNA in 20 µL van RNase-gratis water door de buis flicking. Voeg 20 µL van PAA gel laden oplossing resuspendeer de RNA, flick om te mengen, centrifuge voor 2 zat RT, en de buis vastgesteldop 90 ºC voor 1 min en vervolgens onmiddellijk op ijs.
  7. Vervang de 0.5 x TBE van het apparaat van de gel met vers 0.5 markeringen voor x TBE en laden de ladder, grootte, en ligaturen miRNAs in het midden van de gel, 2-lege wells verlaten aan beide zijden (Figuur 2).
  8. Stel de gel bij 450 V (35 mA) voor 60 min, onderbreken de termijn gedurende 10 minuten te koelen, en opnieuw uit te voeren op 520 V (25 mA) voor een andere 60 min. de 15 uncast % pagina door het verwijderen van een van de glazen platen.
  9. Licht spuiten de gel zittend op de glasplaat met fluorescente kleurstof oplossing (10 µL) in 25 mL 0,5 x TBE, en laat het zitten voor 5 min in het donker.
  10. Leg het glas met de gel op een blauwe licht transilluminator, en uitlijnen van zowel 19 nt en 24 nt grootte markeringen met een liniaal om de besnijdenis van de ligaturen kleine RNAs (Figuur 2). Accijnzen van de gel.
  11. Plaats de verwijderde gel in een 0,5 mL-buis, ontworpen om het fragment gel segmenten, veilig gepositioneerd in een 1.5-mL gesiliconiseerd microcentrifuge buis. Centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 3 minuten op RT. resuspendeer de gefragmenteerde gel met 300 µL van 400 mM NaCl-oplossing, sluit u de buis en zegel met de paraffine-film.
  12. De buis aangezet door agitatie op een thermomixer op 1100 rpm in een koude kamer van 4 ° C voor een overnachting incubatie (16-17 h).

4. Afbinding van de 5'-Adapter

  1. Breng de oplossing kwantitatief en gefragmenteerde gel met een 5 µm filter tube zit in een tube van 1,5 mL gesiliconiseerd zegel met paraffine film en Centrifugeer gedurende 5 min op 2300 x g en RT.
  2. 950 µL van 100% ethanol toevoegen aan de gefilterde oplossing, sluit u de buis, omdraaien om te mixen, Centrifugeer gedurende 2 s, verzegelen van de buis met paraffine film en ingesteld op het ijs gedurende 1 uur.
  3. Voorbereiden van een 12%-pagina gel zoals beschreven in stap 3.3, maar combineren 12.6 mL verdunningsmiddel, 14,4 mL concentraat, 3 mL buffer, 240 µL APS en 12 µL van TEMED in een tube van 50 mL. Pre draaien de 12% pagina gel gedurende 30 minuten op 450 V (~ 35 mA) in 0,5 x TBE.
  4. Centrifugeer de gezuiverde oplossing voor kleine RNA bij 16.000 x g gedurende 60 min bij 4 ° C.
  5. Pipetteer zorgvuldig uit de bovendrijvende vloeistof met behulp van een pipet 1 mL te verwijderen van het grootste deel van de oplossing en een 200 mL-pipet te verwijderen van de resterende oplossing, zonder te raken de pellet te gebruiken.
  6. Met behulp van een pipet van Pasteur met een tip 10 mL aan haar einde verbonden met de kolf van een vacuüm, zorgvuldig drogen van de pellet zonder aan te raken.
  7. Resuspendeer de pellet in 9 µL van RNase-gratis water zonder pipetteren op en neer, maar door het licht flicking de buis, Centrifugeer gedurende 2 s, en stel de buis op ijs.
  8. Voorbereiden van de 10 x RNA Ligase Buffer (met ATP) vers door het combineren van 500 µL van 1 M Tris pH 7.5, 1 M MgCl2, 50 µL van 20 mg/mL 100 µL geacetyleerd BSA, 200 µL van 10 mM ATP, 7 µL van 2-mercaptoethanol 14 M , en 143 µL van RNase-gratis water.
  9. Mix van de 10 x RNA Ligase Buffer (met ATP) door flicking de buis en Centrifugeer gedurende 2 s tot het verzamelen van de oplossing aan de onderkant van de buis.
  10. De 5' adapter afbinding instellen door toe te voegen 2 µL van 10 x RNA Ligase Buffer (met ATP), 1 µL van 100 µM 5' adapter, en 6 µL 50% waterige DMSO aan de 9 µL, 3' barcoded kleine RNA oplossing.
  11. Flick de buis licht te mengen, Centrifugeer gedurende 2 s tot het verzamelen van de oplossing plaats de buis op een warmte blok bij 90 ° C gedurende 1 minuut en terug op het ijs gedurende ten minste 2 minuten.
  12. Voeg 2 µL van T4 RNA Ligase 1 in de oplossing (niet Pipetteer omhoog en omlaag), flick van de buis, centrifuge voor 2 s, en zitten de buis in drijvende rack in een waterbad 37 ° C gedurende 60 minuten.
  13. Gelijktijdig, ingesteld op twee ligations tussen de 19 nt-3' adapter en de 5'-adapter, en twee ligations tussen de 24 nt-3'-adapter en de 5'-adapter.
    1. Combineer 2 µL van de 19nt-3' adapter (250 ng/µL) of 24 nt-3' adapter (250 ng/µL) met: 2 µL van de 5' adapter (100 µM), 2 µL van 10 x RNA Ligase Buffer (met ATP), 6 µL van 50% waterige DMSO, 6 µL van RNase-gratis water , en 2 µL van T4 RNA Ligase 1 in een 1,5 mL gesiliconiseerd microcentrifuge buis.
    2. Flick de buizen te mengen, Centrifugeer gedurende 2 s, en stel de buizen bij 37 ° C gedurende 60 minuten.
  14. 20 µL van PAA denaturering Buffer toevoegen aan alle ligations (gezuiverd van kleine RNAs, 2 ligations met 19nt-3' adapter en 2 ligations met 24nt-3' adapter).
    1. Meng door flicking de buizen, centrifuge voor 2 s, en Incubeer de buizen op een warmte blok bij 90 ° C gedurende 1 min. overdracht alle buizen aan ijs, en bereiden een ladder (3 mL ladder met 20 µL van PAA).
  15. Leegmaken van het bovenste reservoir van het gel-apparaat met de pre run 12% gel pagina en voeg verse 0.5 x TBE oplossing onder het niveau van de putten (putten worden geleegd met een lange, dunne uiteinde pipet).
    1. Geladen de monsters met een dunne Pipetteer tip, zoals beschreven in Figuur 3.
    2. Gebruik verse 0,5 x TBE te vullen individuele putten naar de top van de gel.
    3. Toevoegen van verse 0,5 x TBE naar het reservoir boven de putten en start de Elektroforese van de 12% pagina gedurende 60 minuten op 450 V (~ 35 mA).
    4. Het onderbreken van de run door het uitschakelen van de generator voor 10 min de gel om af te koelen. Opnieuw starten van de generator en uitvoeren van de gel gedurende 60 minuten op 520 V (~ 25 mA).
  16. Stoppen met de generator, leegmaken van de reservoirs door het omkeren van het apparaat boven een gootsteen en uncast 12% pagina door het verwijderen van een van de glazen platen.
  17. Zitten van het glas met de platte gel, spray de gel met 10 µL van de fluorescente kleurstof in 25 mL 0,5 x TBE, incubeer in het donker voor 5 min. lag het glas met de gel op een blauwe lichte transilluminator en uitlijnen van zowel de 19 nt en beide de 24 nt grootte markeerders met een liniaal om de besnijdenis van de ligaturen kleine RNAs (Figuur 3).
    1. De gel accijnzen en breng het verwijderde gel stuk in een tube van 0,5 mL gel breaker. Sluit de dop van de tube gel breker, set in een 1,5 mL gesiliconiseerd microcentrifuge buis, en veilig met paraffine film. Verwijderen van de gel breaker buis, 300 µL van 300 mM NaCl en 1 µL van 100 µM 3' PCR Inleiding aan de geplette gel stukken in een tube van 1,5 mL toevoegen.
    2. Het zegel van de buis met paraffine film op agitatie op een thermomixer bij 1100 tpm bij 4 ° C en 's nachts (17-18 h) in een koude kamer.

5. omgekeerde transcriptie van de 5' afgebonden en 3' Barcoded gezuiverd kleine RNAs

  1. De buis van de thermomixer en het filter ophalen zuiveren de oplossing met een buis 5 µM filter.
    1. Gebruik een pipet 1 mL overbrengen van de oplossing op een 5 µM filter buis ingevoegd in een 1,5 mL gesiliconiseerd RNase-gratis collectie buis. Centrifugeer de buis gedurende 3 minuten op 2300 x g en RT.
    2. Negeren van de filter-buis en 950 µL van 100% ethanol toevoegen aan de collectie tube van de 1,5 mL microcentrifuge met de gefilterde oplossing. Omkeren van de buis aan de mix, centrifuge voor 2 s en op ijs voor 60 min. neerslag het RNA pellet door centrifugeren van de buis op 16.000 x g- en 4 ° C gedurende 1 uur.
  2. Droog de RNA-pellet.
    1. Open het GLB en verwijder voorzichtig het supernatant met een 1 mL Pipet, wat vloeistof op de bodem verlaten.
    2. Gebruik een pipet 20 µL te verwijderen van alle resterende bovendrijvende vloeistof zonder het aanraken van de pellet. Kantel de buis zodat elke oplossing om te zitten aan de andere kant van de pellet.
    3. Gebruik een pipet van Pasteur met een tip van de ongefilterde Pipetteer 10 mL gecombineerd het supernatant en drogen van de pellet met behulp van een vacuüm.
  3. Resuspendeer de pellet RNA in 5.6 µL van RNase-gratis water.
    1. Ontdooiing van de omgekeerde transcriptie reagentia op het ijs voor 15 min. Set up een omgekeerde transcriptie reactie door 3 µL van 5 x Buffer, 4.2 µL van 10 x deoxynucleotide trifosfaat (dNTPs) (elk 2 mM) en 1,5 µL van dithiothreitol (DTT) toe te voegen aan de 5.6 µL van RNase-vrij geresuspendeerde pellet.
    2. Zachtjes flick de buis om te mengen van de reactie en Centrifugeer gedurende 2 s tot het verzamelen van de oplossing. Instellen van de reactie op een warmte blok bij 90 ° C gedurende precies 30 s en vervolgens overdracht direct op een thermomixer bij 50 ° C.
    3. Laat de buis op de thermomixer gedurende 2 minuten, zodat de temperatuur gelijk. Voeg 0,75 µL van het enzym reverse transcriptie direct in de oplossing, flick voorzichtig te mengen en reeks de buis onmiddellijk terug op de thermomixer bij 50 ° C gedurende 30 minuten.
  4. Na 30 min, door de buis te overbrengen in een blok van warmte bij 95 ° C gedurende 1 min om te stoppen met omgekeerde transcriptie. 95 µL van RNase-gratis water rechtstreeks toevoegen aan de omgekeerde transcriptie, flick van de buis te mengen en zet deze dan direct op ijs gedurende 2 minuten.
  5. Label van de buis met de cDNA voorraad bibliotheek en bibliotheek-ID.

6. proefprojecten PCR en grootschalige PCR versterking

  1. Bereiden van vers 10 x PCR buffer door toe te voegen 304 µL van RNase-gratis water, 125 µL van 2 M KCl, 50 µL van 1 M Tris pH 8.0, 10 µL van MgCl, 1 M2, 5 µL van 1% Triton X-100 en 6 µL van 1 M 2-mercaptoethanol in een buis gesiliconiseerd microcentrifuge , en houden op RT.
  2. Monteren van de Pilot PCR reactie door het combineren van 67 µL van RNase-gratis water, 10 µL van 10 x PCR Buffer, 10 µL van 10 x dNTPs, 0,5 µL van 100 µM 5' PCR primer, 0,5 µL van 100 µM 3' PCR Inleiding, 10 µL van cDNA voorraad bibliotheek en 2 µL van 50 x Taq Polymerase.
    1. Opzetten van twee PCR cycli op een thermocycler als volgt: bestand 1: 94 ° C gedurende 45 s, 50 ° C voor 85 s, en 72 ° C gedurende 60 s voor 10 cycli, houden bij 4 ° C; Bestand 2: 94 ° C gedurende 45 s, 50 ° C voor 85 s, en 72 ° C gedurende 60 s voor 2 cycli, houden bij 4 ° C. Instellen van de Pilot PCR-reactie in de thermocycler en bestand 1 beginnen.
    2. Op het einde van het bestand 1, open de PCR-buis en met behulp van een pipet 20 µL, 12 µL van de overdracht van de Pilot PCR-reactie in een tube van 1,5 mL microcentrifuge met 3 µL van 5 x gel laden kleurstof, Meng door omhoog en omlaag pipetteren, sluit de buis , en geef deze het label "10 cycli".
    3. Sluit de Pilot PCR buis en File 2 start op een thermocycler. Op het einde van het bestand 2, open PCR buis gebruiken een 20 mL pipet voor het overbrengen van 12 µL van oplossing in 1.5-mL microcentrifuge buis met 3 µL van 5 x gel laden kleurstof en geef deze het label "12 cycli".
    4. Herhaal de stappen die zijn beschreven in stap 6.2.2 en 6.2.3 12 µL PCR producten om van te verzamelen de Pilot PCR reactie op PCR cycles 14, 16, 18 en 20. 3 µL van 5 x gel laden kleurstof toevoegen aan elk van de 12 µL PCR aliquots, en naar de 20 nt ladder met 3 µL van ladder en 9 µL van RNase-gratis water.
  3. Bereiden van een 2,5% agarose gel met 0,5 x TBE.
    1. Weeg 2,5 g van agarose in een bekerglas van schoon en voeg 100 mL 0,5 x TBE. Verwarm de oplossing in een magnetron tot het kookt. Verwijder de oplossing uit de magnetron, swirl van de fles om te mengen de agarose toevoegen 4 μL van ethidiumbromide (10 mg/mL) en breng de oplossing over in een 7 x 10 cm2 elektroforese lade, gesloten aan beide uiteinden met tape.
    2. Instellen van een 8-well kam en laat de agarose gel stollen op RT. Transfer de gestolde agarose gel op een apparaat van de elektroforese gevuld met 0,5 x TBE.
  4. Laden van de ladder en PCR monsters op de agarose gel, en voer het gedurende 30 minuten op 120 V.
  5. Evalueren van de gel op een UV-doos identificeren van de optimale PCR cyclus (figuur 4A).
    Opmerking: De grootte van de verwachte PCR-bands wordt weergegeven in figuur 4B.
    1. Observeren van de twee bands van PCR in elk van de verschillende putten (bovenste band: DNA library, lagere band: inleidingsdimeer).
    2. Identificeren van de voldoende cyclus van PCR voor de versterking van cDNA door het selecteren van de cyclus waar de cDNA bibliotheek zichtbaar is, maar de inleidingsdimeer zijn nauwelijks waarneembaar.
      Opmerking: In het algemeen de passende PCR cyclus is ingeschakeld tussen de 12 – 16 cycli. Op figuur 4Ais het voldoende PCR cyclus voor deze bibliotheek 14.
  6. De grootschalige PCR reacties (6 x 100 µL) instellen voor agarose gel bibliotheek zuivering.
    1. Voorbereiding van een verse buis 10 x PCR Buffer volgende stap 6.1.
    2. Bereiden de grootschalige PCR Master Mix in een 1,5 mL-buis door het combineren van 435.5 µL van RNase-gratis water, 65 µL van 10 x PCR buffer, 65 µL van 10 x dNTPs, 3.25 µL van 5' PCR Inleiding, 3.25 µL van het PCR primers 3', en pipetteren omhoog en omlaag als u wilt mengen.
    3. Pipetteer 88 µL van het PCR Master Mix in zes 0,5 mL PCR buizen. Breng 10 µL van cDNA voorraad bibliotheek (opgeslagen op ijs), voeg 2 µL van 50 x Taq polymerase in elk van de 6 PCR buizen en Pipetteer te mengen.
    4. Een negatieve PCR reactiebuis voor te bereiden door het combineren van 77 µL van RNase-gratis water, 10 µL van 10 x PCR buffer 10 µL van 10 x dNTPs, 0,5 µL van het PCR Inleiding 5', 0,5 µL van het PCR Inleiding 3' en 2 µL van 50 x Taq polymerase en Pipetteer te mengen.
    5. Plaats de PCR-buizen in de thermocycler met behulp van de PCR cyclus beschreven in stap 6.2.1 en stel het optimale aantal amplificatie cycli. Bereiden van een 2,5% agarose gel met behulp van 0,5 x TBE, zoals beschreven in stap 6.3.
  7. Na PCR versterking, Pipetteer 9 µL van elke buis PCR in zes 1,5 mL microcentrifuge buizen met 3 µL van 5 x gel laden kleurstof.
    1. Bereid 20 nt ladder door 3 mL ladder samenvoegen 9 µL van RNase-gratis water en toevoegen 3 µL gel laden kleurstof in een 1,5 mL-buis.
    2. Laden van de ladder, negatieve PCR controle en 6 PCR producten op de agarose gel, en draaien van de gel gedurende 30 minuten op 120 V.
    3. Controleer of de uniformiteit van de PCR-amplifications tussen de rijstroken op een UV-doos (neem een afbeelding).
    4. Combineer 3 PCR reacties in twee 1,5 mL gesiliconiseerd microcentrifuge buis (3 x 91 µL), 27 µL van 5 M NaCl en 950 µL van 100% ethanol toevoegen. Omkeren van de buizen te mengen en hen bij-20 ° C's nachts te precipiteren van de PCR producten te stellen.

7. cDNA Bibliotheek zuivering en evaluatie

  1. Centrifugeer beide buisjes met de PCR reacties bij 16.000 x g gedurende 60 min bij 4 ° C.
  2. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet 1 mL, dan kantelen van de buis met de pellet op de bovenzijde en vloeistof aan de lagere kant en gebruik van een pipet van Pasteur verbonden met de kolf van een vacuüm met een badkuip en vloeistof met een 10 mL tip aan het einde van de Pipet van Pasteur gecombineerd.
  3. Instellen van de PmeI digest.
    1. Resuspendeer één van de PCR-pellets met 17,5 µL nuclease-gratis water, en overdracht van de geresuspendeerde pellet aan de tweede PCR-pellet. 2 µL van 10 x Buffer en 0,5 µL van PmeI enzym toevoegen en instellen van de Digesten in een waterbad gedurende 2 uur bij 37 ° C.
    2. Bereiden van een 2,5% agarose gel met behulp van 0,5 x TBE (stap 6.3). Voeg 6 µL van 5 x gel laden kleurstof de verteerbaar. Pipetteer 13 µL van elke digest in twee aangrenzende putten van het agarose gel, de 20 nt grootte ladder op de einde-putten te laden en uitvoeren van de gel voor 90 min op 150 V (Figuur 4 d).
    3. De bovenste PCR bands uit de gel op de UV-doos accijnzen, breng de gel stukken in een tube van vers woog 1,5 mL microcentrifuge en wegen van de gel stukken op een schaal.
  4. Zuiveren van de verwijderde PCR versterkte cDNA bibliotheek met behulp van een gel extractie kit na instructies van de fabrikant. Kwantificeren van de cDNA bibliotheek met behulp van een instrument, na instructies van de fabrikant en DNA kwantificering assay.
  5. Evalueren van de grootte en de zuiverheid van de cDNA bibliotheek met een hoog-gevoeligheids DNA-chip op een Bioanalyzer (Figuur 5). Volgorde de cDNA bibliotheek met behulp van een systeem met hoge gegevensdoorvoer. Het gegevensbestand van de FASTQ overbrengen in de pijpleiding van de RNAworld voor de adapter trimmen en aanpassing aan het menselijk genoom te identificeren van de miRNA sequenties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals beschreven in de methode hier, een totaal van 18 afzonderlijke FFPE RNA monsters (100 ng elke) in afzonderlijke buizen zijn ingesteld voor het ondergaan van 3' adenylated barcoded oligonucleotide T4 afbinding 's nachts. De volgende dag, zijn de enzymatische reacties warmte-gedeactiveerd, gecombineerd en neergeslagen in een enkele buis. De RNA-pellet is geresuspendeerde en de ligaturen RNA-moleculen worden gescheiden op een 15% denaturering polyacrylamidegel (pagina), waar RNA oligon...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een zeer reproduceerbaar en robuuste cDNA Bibliotheek voorbereiding protocol voor NGS van kleine RNAs gearchiveerd in FFPE RNA specimens is gepresenteerd in dit protocol, dat een aangepaste en geoptimaliseerde versie van de procedure beschreven door Hafner et al. is 22

Alle stappen van dit protocol zijn geoptimaliseerd voor gebruik met oudere gearchiveerde en gecompromitteerde totaal RNA verhaald van FFPE exemplaren. De belangrijkste stap van dit protocol, voor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs wilt doorgeven dat een publicatie met enkele van de gegevens in dit manuscript werd gepubliceerd in de International Journal of Molecular Sciences door Loudig et al. 21.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Dr. Thomas Tuschl, hoofd van het laboratorium voor moleculaire biologie van RNA, en ook familieleden van zijn laboratorium voor hun steun en voor het delen van de technologie, ontwikkeld in zijn laboratorium en toegang bieden tot de pijpleiding van de RNAworld. Wij danken ook Dr. Markus Hafner voor zijn protocol voor het delen en het verstrekken van gedetailleerde beschrijvingen over alle biochemische en enzymatische stappen in zijn eerste procedure gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1% Triton x-100InvitrogenHFH10
10mM ATPAmbionAM8110G
10X dNTPsAmbionAM8110G
10x TBEThermofisher Scientific15581044
14M MercaptoethanolSigmaO3445I-100
20 nt ladderJena BioscienceM-232S
20mg/ml Bovine Serum AlbumineSigmaB8894-5ML
50X Titanium TaqClontech Laboratories639208
Ammonium PersulfateFisher Scientific7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combsGIBCOV16
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424RUSA scientific4054-4537Q
Eppndorf ThermomixerUSA scientific4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5mlFisher Scientific02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 mlIST Engineering Inc,3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combsBiorad1704446
GlycoblueAmbionAM9516
Jersey-CoteLabScientific, Inc1188
KcL 2MAmbionAM9640G
MgCl2 1MAmbionAM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifugeUSA scientific2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacersCiore Life Science21070010
OligonucleotidesIDTDefined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combsThermofisher ScientificB2
Qiaquick Gel Extraction kitQiagen28704
Restriction enzyme PmeINEBR0560S
RNase-free waterAmbionAM9932
Safe Imager 2.0Life TechnologiesG6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminatorThermofisherG6600
SeaKem LE agaroseLonza50002
Superscript III reverse transcription kitInvitrogen18080-044
SybrGoldLife TechnologiesS11494
T4 RNA Ligase 1NEBM0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227QNEB0351L
TEMEDFisher ScientificO3446I-100
Themocycler with heated lidApplied Biosystem4359659
Tris 1M pH 7.5Invitrogen15567027
Tris 1M pH8.0AmbionAM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and bufferNational DiagnosticsEC-833

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
  2. Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
  3. Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10 (6), e0129338(2015).
  4. Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
  5. Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
  6. Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
  7. Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517(2013).
  8. Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8 (5), e64393(2013).
  9. Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
  10. Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
  11. Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
  12. Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144(2011).
  13. Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).
  14. Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
  15. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  16. Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  17. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  18. Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500(2011).
  19. Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
  20. Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627(2017).
  21. Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7 (4), e34683(2012).
  22. Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58 (2), 164-170 (2012).
  23. Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RNA extractie uit FFPEcDNA bibliotheekpreparatiepolyacrylamidegelelektroforesepilot PCR amplificatieagarosegelzuiveringnext generation sequencinganalyse van klein RNAgearchiveerde weefselmonsters3 gebarcodeerde adapters

Gerelateerde artikelen