ExCYT: Een grafische gebruikersinterface voor het stroomlijnen van de analyse van High-dimensionale Cytometry gegevens

Summary

ExCYT is een MATLAB gebaseerde grafische User Interface (GUI) waarmee gebruikers hun stroom cytometry om gegevens te analyseren via algemeen gebruikte analytische technieken voor high-dimensional data waaronder dimensionaliteit vermindering via t-GND, een aantal handmatige en geautomatiseerde Clustering van de methoden, heatmaps en roman high-dimensionale stroom percelen.

Abstract

Met de komst van flow cytometers kan meten van een toenemend aantal parameters, blijven wetenschappers ontwikkelen grotere panelen om te verkennen fenotypische kenmerken van hun cellulaire monsters. Echter, deze technologische vooruitgang opleveren hoog-dimensionale datasets die steeds moeilijker te analyseren objectief binnen traditionele handleiding gebaseerde gating programma's zijn geworden. Om beter analyseren en presenteren van gegevens, werken wetenschappers samen met bioinformaticians met expertise in het analyseren van hoge-dimensionale gegevens hun stroom cytometry gegevens parseren. Terwijl deze methoden is aangetoond dat het zeer waardevol zijn bij het bestuderen van stroom cytometry, moeten ze nog worden opgenomen in een eenvoudig en makkelijk te gebruiken pakket voor wetenschappers die computationele of programmeertaal deskundigheid ontbreken. Om aan deze behoefte, hebben we ExCYT, een MATLAB-based Graphical User Interface (GUI) die de analyse van hoge-dimensionale stroom cytometry gegevens stroomlijnt door de uitvoering van gewoonlijk werknemer analytische technieken voor het opnemen van high-dimensional data de vermindering van dimensionaliteit door t-GND, een aantal handmatige en geautomatiseerde clustering methoden, heatmaps en roman high-dimensionale stroom percelen. Daarnaast biedt ExCYT traditionele gating opties selecteren populaties van belang voor verdere t-GND en clustering analyse evenals het vermogen om poorten direct aan t-GND percelen. De software verstrekt het extra voordeel van het werken met ofwel gecompenseerd of de niet-gecompenseerde FCS-bestanden. In het geval dat na overname compensatie vereist is, kan de gebruiker kiezen om het programma een directory van enkele vlekken en een onbevlekt monster. Het programma detecteert positieve gebeurtenissen in alle kanalen en gebruikt deze gegevens selecteren om te meer objectief berekenen de compensatie-matrix. Kortom biedt ExCYT een uitgebreide analyse pijpleiding om stroom cytometry gegevens in de vorm van FCS-bestanden en elk individu, ongeacht de computationele opleiding, gebruik van de nieuwste algoritmische benaderingen in het begrip van hun gegevens toestaan.

Introduction

Voorschotten in stroom cytometry evenals de komst van massale cytometry heeft toegestaan clinici en wetenschappers te snel identificeren en fenotypische karakteriseren biologisch en klinisch interessant monsters met nieuwe niveaus van resolutie, maken grote high-dimensional data sets die informatie rijke^1,2,3. Terwijl conventionele methoden voor het analyseren van stroom cytometry gegevens zoals handmatige gating eenvoudiger voor experimenten waarbij er paar markeringen en de markeringen hebben visueel waarneembaar populaties zijn, kan deze aanpak mislukken om te genereren reproduceerbare resultaten bij het analyseren van de hoger-dimensionale datasets of degenen met markeringen, vlekken op een spectrum. Bijvoorbeeld, in een multi-institutionele studie, waren waar intra-cellulaire kleuring (ICS) testen wordt uitgevoerd om na te gaan van de reproduceerbaarheid van antigeen-specifieke T cel reacties, ondanks goede interlaboratorium precisie, analyse, met name quantitating gating, introduceerde een belangrijke bron van variabiliteit⁴. Bovendien, het proces van gating handmatig bevolking van belangen, naast zeer subjectief is zeer tijdrovend en arbeid-intensieve. Echter behoort het probleem van het hoge-dimensionale datasets analyseren in een robuuste, efficiënte en tijdige wijze niet nieuw voor de wetenschappen van het onderzoek. Gen expressie studies genereren vaak extreem hoge-dimensionale datasets (vaak over de volgorde van honderden genen) waar handmatige vormen van analyse zou gewoon onhaalbaar. Om aan te pakken van de analyse van deze data sets, is er veel werk in het ontwikkelen van bioinformatic hulpmiddelen te parsen van gen expressie gegevens⁵. Deze algoritmische benaderingen hebben zojuist onlangs aangenomen in de analyse van cytometry gegevens zoals het aantal parameters is toegenomen en hebben bewezen te zijn van onschatbare waarde zijn in de analyse van deze hoge dimensionale datasets^6,7.

Ondanks de generatie en de toepassing van een verscheidenheid van algoritmen en softwarepakketten waarmee wetenschappers deze hoge-dimensionale bioinformatic benaderingen toepassen op hun stroom cytometry gegevens, blijven deze analytische technieken nog steeds grotendeels ongebruikt. Hoewel er wellicht een verscheidenheid van factoren die de wijdverspreide goedkeuring van deze benaderingen van cytometry gegevens⁸hebben beperkt, de grote belemmering we vermoeden in gebruik van deze benaderingen van wetenschappers, is een gebrek aan computationele kennis. In feite, zijn veel van deze softwarepakketten (dat wil zeggen, flowCore, flowMeans en OpenCyto) geschreven in programmeertalen zoals R, waarvoor nog steeds inhoudelijke kennis van programmeren moeten worden uitgevoerd. Softwarepakketten zoals FlowJo hebben gevonden tussen wetenschappers te wijten aan de eenvoud van gebruik en 'plug-n-play' aard, alsmede de compatibiliteit met het besturingssysteem van de PC gunst. Om de verscheidenheid van geaccepteerde en waardevolle analytische technieken om de wetenschapper onbekend programmering, hebben we ExCYT, een grafische-gebruikersinterface (GUI) die gemakkelijk kan worden geïnstalleerd op een PC/Mac, die veel van de nieuwste technieken trekt inclusief dimensionaliteit reductie voor intuïtieve visualisatie, een verscheidenheid van clustering methoden genoemd in de literatuur, samen met nieuwe functies te verkennen van de uitvoer van deze clustering algoritmen met heatmaps en roman high-dimensionale stroom/vak percelen.

ExCYT is een grafische gebruikersinterface gebouwd in MATLAB en daarom kan ofwel worden uitgevoerd binnen MATLAB direct of een installateur is op voorwaarde dat kan worden gebruikt voor het installeren van de software op elke PC/Mac. De software is beschikbaar op https://github.com/sidhomj/ExCYT. Presenteren we een gedetailleerd protocol voor het importeren van gegevens, vooraf verwerken, voeren t-GND dimensionaliteit vermindering, clusterconfiguratiegegevens, sorteren & filteren op basis van gebruikersvoorkeuren, en weergave-informatie over de clusters van belang via heatmaps en roman clusters hoge-dimensionale stroom/vak percelen ()Figuur 1). Assen op de t-GND percelen zijn willekeurig en in willekeurige eenheden en als zodanig, zoals in de cijfers voor de eenvoud van de gebruiker niet altijd interface. De kleuring van gegevenspunten in de "t-GND Heatmaps" is van blauw naar geel op basis van het signaal van de aangegeven markering. Cluster oplossingen, is de kleur van het gegevenspunt willekeurige gebaseerd op clusteraantal. Alle onderdelen van de werkstroom kunnen worden uitgevoerd in het één deelvenster GUI ()Figuur 2 & tabel 1). Tot slot zullen we laten zien dat het gebruik van ExCYT op eerder gepubliceerde gegevens verkennen de immuun landschap van niercelcarcinoom in de literatuur, ook met soortgelijke methoden geanalyseerd. De monster-dataset die we gebruikt voor het maken van de cijfers in dit manuscript samen met het protocol hieronder vindt u op https://premium.cytobank.org/cytobank/projects/875, bij het registreren van een account.

Protocol

1. verzamelen en Cytometry gegevens voorbereiden

1. Alle enkele vlekken in een map plaatsen door zichzelf en etiket door de naam van het kanaal (door fluorophore, niet de markering).

2. gegevens invoer & voorbehandeling

1. Als u wilt onderbreken of op te slaan gedurende deze analyse-pijpleiding, gebruiken de Werkruimte opslaan -knop in de linkerbenedenhoek van het programma op te slaan van de werkruimte als een '. MAT' bestand dat later kan worden geladen via de knop Load werkruimte . Voer niet meer dan één exemplaar van het programma op een moment. Dus, bij het laden van een nieuwe werkruimte, zorg ervoor om er is geen andere exemplaar van ExCYT uitgevoerd.
2. Om te beginnen analyse pijpleiding, selecteert u eerst type cytometry (Stroom Cytometry of massa Cytometry – CYTOF), onder de Selectie bestandsparameters select aantal gebeurtenissen om te proeven van het bestand (voor dit voorbeeldgebruik 2.000). Zodra de gegevens heeft ingevoerd, zal een dialoogvenster opduiken informeren van de gebruiker dat de gegevens geïmporteerd is geweest.
3. Druk op de knop Auto-compensatie uit te voeren van een optioneel auto-compensatie stap, zoals gedaan door t-Bag & Adams⁹. Selecteer de map met enkele vlekken. Selecteer het Onbevlekt monster binnen de dialoog van de user interface.
   1. Plaats een voorwaarts/kant-scatter-gate op de monsters in deze directory die worden gebruikt voor het selecteren van gebeurtenissen voor de berekening van de compensatie-matrix. Het is aanbevolen om het gebruik van het Onbevlekt voorbeeld voor dit doel. Op dit punt is een algoritme geïmplementeerd te stellen consequente drempels op^{het 99 percentiel van het Onbevlekt monster te bepalen positieve gebeurtenissen in elk van de enkele vlekken voor de berekening van de compensatie-matrix} . Wanneer dit is voltooid, wordt een dialoogvenster gemeld dat de compensatie is verricht.
4. Vervolgens druk op Gate bevolking en selecteer de populaties van cellen van belang, aangezien het Verdrag in stroom cytometry analyses. Wanneer de bevolking van cellen is ingeschakeld, nummer invoeren van percentage van de stroomafwaartse analyse van de gebeurtenissen (in deze 10.000 gebeurtenissen).
5. Selecteer vervolgens het aantal kanalen moet worden gebruikt voor de analyse van de listbox in de rechterkant van het vak voorbewerkend (gebruik de specifieke kanalen weergegeven in het voorbeeld).

3. t-GND analyse

1. Druk op de knop T-GND het programma start beginnen te hebben voor het berekenen van de verminderde dimensionaliteit gegevensset voor visualisatie in het venster onder de knop t-GND. Druk op TSNE-afbeelding opslaanals afbeelding wilt opslaan van t-GND. Op een machine met 8 CPU @ elke 3,4 GHz en 8 GM RAM dit stap ongeveer 2 minuten voor 10.000 evenementen, 10 minuten voor 50.000 evenementen, en 20 minuten voor 100.000 evenementen duurt.
2. Maken van een heatmap 't-GND ', zoals te zien in verschillende CYTOF publicaties^10,11, selecteert u een optie uit het venstermenu ' Marker-specifieke t-GND (de specifieke markers CD64 of CD3 gebruiken, zoals in het voorbeeld). Een figuur zal pop-up tonen een heatmap-vertegenwoordiging van de t-GND plot dat kan worden opgeslagen voor figuur generatie.
3. Selecteer gebieden van belang in de t-GND percelen door de gebruiker voor verder stroomafwaarts analyses met behulp van de Gate t-GND -knop.

4. de clusteranalyse

1. Om te beginnen met clustering analyse, selecteert u een optie in Clustering methode listbox (in dit voorbeeld ons DBSCAN met een factor van de afstand van 5 in de dialoog box rechts van de listbox). Druk op de knop van het Cluster .
2. Gebruik een van de volgende opties voor geautomatiseerde clustering algoritmen te vinden in het paneel 'Geautomatiseerde Clustering Parameters':
   1. Harde KMEANS (op t-GND): k-means clustering tot de verminderde 2-dimensionale t-GND gegevens van toepassing en vereist het aantal clusters aan de algoritme¹²te verstrekken.
   2. Harde KMEANS (op HD Data): k-means clustering met de oorspronkelijke hoge-dimensionale gegevens die werd gegeven aan de t-GND algoritme van toepassing. Nogmaals, moet het aantal clusters worden verstrekt aan het algoritme.
   3. DBSCAN: Methode toepassen de clustering van clustering, genaamd dichtheid gebaseerde ruimtelijke Clustering van toepassingen met lawaai-¹³ dat clusters van de verminderde 2-dimensionale t-GND gegevens en vereist een niet-dimensionale afstand factor die de globale grootte van bepaalt de clusters. Dit type clustering algoritme is goed geschikt voor cluster de vermindering van de t-GND zoals is het kundig cluster niet-sferoïdale cluster die vaak in de verminderde t-GND vertegenwoordiging aanwezig zijn. Bovendien, wijten aan het feit dat zij op de 2-dimensionale gegevens opereert, is het een van de sneller clustering algoritmen.
   4. Hiërarchische Clustering: De conventionele hiërarchische cluster methode toepassen op de hoge-dimensionale gegevens waar de hele Euclidische afstand matrix is berekend tussen alle gebeurtenissen voor het verstrekken van het algoritme een afstand factor die de grootte van de cluster stelt.
   5. Netwerk grafiek- Gebaseerd: Een clustering methode die onlangs is ingevoerd in het analyseren van stroom cytometry gegevens wanneer er zeldzame subpopulaties die de gebruiker wil detecteren^11,14toepassen. Deze methode is gebaseerd op het eerste het maken van een grafiek die de verbindingen tussen alle gebeurtenissen in de gegevens bepaalt. Deze stap bestaat uit het verstrekken van een eerste parameter om de grafiek, die het aantal k-dichtstbijzijnde buren is maken. Deze parameter regelt in het algemeen de grootte van de clusters. Op dit moment ijslollie een ander dialoogvenster opwaarts asking van de gebruiker te wenden tot 5 clusters van algoritmen die is toegepast op de grafiek. Het gaat hierbij om 3 opties om te maximaliseren de modulariteit van de grafiek, de methode Danon, en een spectrale clustering algoritme^{14,15,16,17,18}. Als men wil een over het algemeen sneller clustering oplossing, raden we spectrale Clustering of het snel hebzuchtig maximalisatie van de modulariteit. Terwijl de modulariteit maximalisatie methoden samen met de methode Danon het optimale aantal clusters bepalen, vereist spectrale Clustering het aantal clusters worden gegeven aan het programma.
   6. Zelf georganiseerd kaart: Dienst een kunstmatig neuraal netwerk clusteren van de high-dimensional data.
   7. GMM-verwachting maximalisatie: maken van een Gaussiaanse mengsel Model met behulp van verwachting maximalisatie (EM) techniek clusteren van de high-dimensional data. ¹⁹ dit type clustering methode is ook vereist de gebruiker om het aantal clusters.
   8. Variationele Bayesian gevolgtrekking voor GMM: maken van een Gaussiaanse mengsel Model maar in tegenstelling tot EM, het kan automatisch bepalen het aantal de mengsel onderdelen k.²⁰ terwijl het programma vereist een aantal clusters worden gegeven (groter dan de verwacht aantal clusters), het algoritme bepaalt het optimale nummer op zijn eigen.
3. Om te bestuderen van een bepaald gebied van de t-GND plot, druk Cluster handmatig selecteren om op te tekenen van een set van gebruiker gedefinieerde clusters. Van de nota delen clusters niet leden (dat wil zeggen, elke gebeurtenis alleen deel van cluster 1 uitmaken kan).

5. cluster filtratie

1. Combinatie van clusters dergelijke geïdentificeerd ofwel handmatig of via een van de hierboven beschreven automatische methoden kunnen filteren als volgt.
   1. Clusters (in het filterdeelvenster Cluster ) om op te sorteren een van de markers in de experiment gemeten, door een optie te selecteren in het pop-upmenu sorteren . Als u wilt instellen of de volgorde oplopend of aflopend, drukt u op de knop Oplopend/Aflopend naar rechts van het pop-upmenu sorteren . Dit zal de lijst bijwerken van Clusters in de listbox 'Clusters (filtratie)' en hen opnieuw te sorteren in aflopende volgorde van mediaan cluster expressie van die markering. Het percentage aangeduid in de listbox 'Clusters (filtratie)' duidt het percentage van de bevolking dat deze cluster vertegenwoordigt.
   2. Als u wilt instellen een minimale drempelwaarde voor een bepaald cluster in een bepaalde zender, selecteert u een optie uit het venstermenu ' drempel (in dit voorbeeld ons de markering CD65 en stelt een drempel op 0,75). Typ een waarde in het numerieke vak onder de grafiek of de dia-balk gebruiken om een drempel instellen. Zodra de drempel is ingesteld, druk Boven drempel toevoegen of Onder drempel toevoegen om op te geven van de richting van de drempel. Zodra deze drempel is vastgesteld, zal het worden vermeld in het vak van de drempels naast het ' Cluster filterdeelvenster ' waar de markeringen, de drempelwaarde en de richting wordt weergegeven zodat de gebruiker zich bewust is van welke drempels zijn momenteel wordt toegepast. Ten slotte, de t-GND plot wordt bijgewerkt door vervaging uit clusters die niet voldoen aan de eisen van de filtratie en listbox 'Clusters (filtratie)' wordt bijgewerkt om aan te tonen van clusters die voldoen aan de eisen van de filtratie.
   3. Wilt instellen een minimumdrempel voor de frequentie van een cluster, geeft een numerieke licht-donkerscheiding op de Cluster frequentie drempel (%) vak in het filterdeelvenster van Cluster (in dit voorbeeld gebruik 1%).

6. cluster-analyse & visualisatie

1. Als clusters voor verdere analyse en visualisatie, selecteert u clusters In Clusters (filtratie) listbox en druk op de Select à knop om ze te verplaatsen aan de keuzelijst Cluster analyseren .
2. U maakt heatmaps van clusters, selecteer de clusters van belang in de keuzelijst Cluster analyseren en druk op de knop HeatMap van Clusters . Wanneer deze knop wordt gedrukt, zal een figuur opduiken die een warmte-kaart samen met dendrograms op de cluster en parameter assen bevatten. De dendrogram op de verticale as worden gegroepeerd clusters door degenen die nauw terwijl de dendrogram op de horizontale verbonden zijn as worden gegroepeerd markeringen die samen horen. Als u wilt opslaan van heatmap, druk op bestand | Exporteren van Setup | Exporteren.
3. U maakt een 'Hoge dimensionale vak Plot' of 'Hoge dimensionale Flow Plot', selecteer de clusters van belang in de keuzelijst Cluster analyseren en druk op de knop Hoge dimensionale vak uitzetten of de Hoge dimensionale Flow Plot -knop. Deze percelen kunnen worden gebruikt om het visueel beoordelen van de verdeling van de kanalen van verschillende clusters gegeven over alle dimensies.
4. Als u clusters in traditionele 2D stroom percelen weergeven, selecteer de transformatie (lineaire, log10, arcsinh) en kanaal in het deelvenster Conventionele stroom uitzetten en de druk op conventionele stroom Plot.

Results

Om te testen de bruikbaarheid van ExCYT, geanalyseerd wij een curator gegevensset gepubliceerd door Chevrier et al. getiteld 'An immuun Atlas van duidelijke cel renale carcinoom' waar de groep uitgevoerd CyTOF analyse met een uitgebreide immuun panel met tumor monsters van 73 patiënten¹¹. Twee afzonderlijke panelen, een myeloïde en lymfoïde panel, werden gebruikt om de fenotypische karakteriseren de communicatie van de tumor. Het doel van onze studie was o...

Discussion

Hier presenteren we ExCYT, een nieuwe grafische gebruikersinterface uitgevoerd op basis van MATLAB algoritmen om te stroomlijnen analyse van hoge-dimensionale cytometry gegevens, waardoor individuen met geen achtergrond in programmeren uit te voeren uiterlijk in high-dimensional data analyse algoritmen. De beschikbaarheid van deze software aan de bredere wetenschappelijke gemeenschap kunnen wetenschappers om te verkennen hun stroom cytometry gegevens in een intuïtieve en eenvoudige workflow. Via het uitvoeren van t-GND d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Desktop	SuperMicro	Custom Build	Computer gebruikt voor het uitvoeren van analyses
MATLAB	Mathworks	N/A	Software gebruikt voor het ontwikkelen van ExCYT