Methodenartikel

Ablatie van een neuronale bevolking met behulp van een twee-foton Laser en haar beoordeling met Calcium Imaging en gedrags opname in Zebrafish larven

DOI:

10.3791/57485

⸱

2 juni 2018

 , 
1Division of Molecular and Developmental Biology, National Institute of Genetics, Department of Genetics, SOKENDAI (The Graduate University for Advanced Studies)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om een genetisch gelabelde subpopulatie van neuronen door een twee-foton laser vanaf Zebrafish larven lasertherapie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ter identificatie van de rol van een subpopulatie van neuronen in gedrag, is het essentieel om te testen van de gevolgen van het blokkeren van de activiteit in levende dieren. Laser ablatie van neuronen is een effectieve methode voor dit doel als neuronen zijn selectief gelabeld met de fluorescerende sondes. In de huidige studie, worden protocollen voor laser geruineerd een subpopulatie van neuronen met behulp van een twee-foton microscoop en het testen van de functionele en gedragsmatige gevolgen daarvan beschreven. In deze studie, wordt prooi vangen gedrag in zebrafish larven gebruikt als een studie-model. Het pretecto-hypothalame circuit is bekend dat ten grondslag liggen aan deze visueel gestuurde prooi vangen van gedrag. Zebravis pretectum waren laser-ablated worden, en neuronale activiteit in de inferieure kwab van de hypothalamus (ILH; het doel van de pretectal projectie) werd onderzocht. Prooi vangen gedrag na pretectal ablatie werd ook getest.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om te begrijpen hoe gedrag vloeit voort uit de neuronale activiteit in de hersenen, is het noodzakelijk om te identificeren van de neurale circuits die bij de generatie van dat gedrag betrokken zijn. Het larvale stadium, de zebravis biedt een ideale dierlijk model voor het bestuderen van de hersenfunctie geassocieerd met het gedrag, omdat hun kleine, transparante hersenen maken het mogelijk om te onderzoeken van neuronale activiteit op een cellulaire resolutie op een breed gebied van de hersenen met inachtneming van de gedrag1. Beeldvorming van neuronale activiteit in specifieke neuronen is mogelijk door de uitvinding van genetisch gecodeerde calcium (Ca) indicatoren (GECIs) zoals GCaMP2geworden. GCaMP transgene zebrafish hebben bewezen nuttig voor het koppelen van het functionele neurale circuit met gedrag door het uitvoeren van Ca imaging in dieren3gedragen.

Terwijl Ca beeldvorming kan aantonen dat de correlaties tussen Neuronale activiteit en gedrag, om aan te tonen van causaliteit, onderdrukking van neuronale activiteit en haar gevolgen op gedrag testen zijn belangrijke stappen. Er zijn verschillende manieren om dit te bereiken: het gebruik van genetische mutatie die wijzigt van specifieke neurale circuits4, uitdrukking van neurotoxines in specifieke neuronen5,6, gebruik van optogenetic hulpmiddelen zoals halorhodopsin7, en laser ablatie van gerichte neuronen8,9. Laser Ablatie is bijzonder geschikt voor het elimineren van de activiteit in een relatief klein aantal specifieke neuronen. Onomkeerbare eliminatie van neuronale activiteit door het doden van neuronen vergemakkelijkt gedragsmatige gevolgen.

Een interessant gedrag dat kan worden waargenomen in het larvale stadium van zebravis is prooi vangen(Figuur 1). Deze visueel geleide, doelgericht gedrag biedt een gunstige experimenteel systeem voor de studie van de gezichtsscherpte10, visuomotor transformatie11,12,13, visuele perceptie en erkenning van objecten14,15,16,17,18en19van de besluitvorming. Hoe prooi wordt herkend door roofdieren en hoe prooi detectie leidt tot prooi vangen van gedrag is een centrale vraag in neuroethology20. In dit artikel focussen we op de rol van het pretecto-hypothalame circuit gevormd door projecties van een kern in de pretectum (nucleus pretectalis superficialis pars magnocellularis, hierna gewoon bekend als de pretectum) aan de ILH. Laser-ablatie van de pretectum bleek te verminderen prooi vangen activiteit en neuronale activiteit in de ILH die is gekoppeld aan de visuele prooi perceptie21af te schaffen. Hier, laser protocollen voor het uitvoeren van ablatie en testen zijn effect met behulp van Ca2 + beeldvorming en gedrags opname in zebrafish larven worden beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ablatie van een subpopulatie van neuronen met behulp van een Laser van het twee-foton microscoop

Opmerking: Als gebruikers van plan over het uitvoeren van Ca imaging volgende ablatie, gebruiken de UAShspzGCaMP6s lijn21. Als gebruikers van plan over het uitvoeren van gedrags opname na het baarmoederslijmvlies, gebruik de UAS:EGFP-regel, zoals de ablatie van EGFP-positieve cellen eenvoudiger uit te voeren is dan uiten van GCaMP6s cellen.

  1. Beginnen met het opzetten van de paring van een Gal4 lijn labels van specifieke neuronen worden bestudeerd en UAS:EGFP of UAShspzGCaMP6s. Zorg ervoor dat u de achtergrond van de nacre voor beide ouders zodat parelmoer homozygotes kunnen worden verkregen.
    Opmerking: Homozygotes van nacre bevatten geen melanophores op het lichaamsoppervlak (Figuur 1B). In de huidige studie, een Gal4 lijn gSAIzGFFM119B (waarmee de labels van de pretectum) en andere Gal4 line hspGFFDMC76A (waarmee de ILH van de labels) zijn gebruikte21.
  2. Op de volgende dag van de paring setup, de zebravis eieren te verzamelen en hen te verhogen tot het larvale stadium op welk punt de neuronen van belang fluorescerende verslaggevers zal uitspreken.
  3. Monteer de larve van de zebravis in 2% lage smeltpunt-agarose (Figuur 1B).
    1. Begin door het opstellen van 2% agarose stockoplossing: los 2 g voor lage smeltpunt agarose powder in 100 mL systeem water (dat wil zeggen, het water gebruikt om volwassen zebrafish in een circulerende water systeem)22 of E3 water23, doordat het water de punt in een magnetron koken en krachtig mengen.
    2. Magnetron de 2% lage smeltpunt agarose voorraad tot het kookt. Giet de agarose op het deksel van een 6-cm petrischaal mL 3.5-4.0. Wacht totdat de agarose koelt zodat het is warm om aan te raken voordat u verdergaat.
    3. Vervolgens plaatst u een één larve (niet verdoofd bij deze stap) in de agarose. Houd de positie en oriëntatie van de larve aan te passen zodat het rechtop, met behulp van een ontleden naald (Figuur 1C), totdat de agarose stolt om ervoor te zorgen dat de juiste positionering van de larve.
      Opmerking: De larve zal blijven zwemmen rond, terwijl de agarose stolt.
    4. Zodra de larve is geplaatst, laat 5 min. voor de agarose te stollen volledig.
    5. Giet de agarose 5 mL van oplossing (0,4% op 1 x werken concentratie) van de tricaïne.
      Opmerking: Voorkom bewegingen door de larven tijdens laser ablatie, moeten de larven narcose tijdens de NovaSure-procedure worden gehouden.
  4. Lasertherapie de larve bleken de functie in een twee-foton laser microscopie systeem.
    1. Plaats de larve agarose-embedded onder een twee-foton laser scanning microscoop en de microscopie is opgestart.
    2. Start de afbeelding acquisitie software en klik op de "On"-knop op het tabblad "Laser" inschakelen van de laser (Figuur 1D). Wachten op de 'Status' van de laser te wijzigen van "Bezet" naar "Mode-locked."
    3. Op het tabblad "Kanalen" vastgesteldop golflengte van de laser van 880 nm (maximumvermogen: ongeveer 2300 mW) voor EGFP ablatie, of bij 800 nm (maximumvermogen: ongeveer 2.600 mW) voor GCaMP ablatie.
    4. Selecteer de 20 X objectief door manueel het bewegen van de lens revolver. Klik op het tabblad "Locate", "GFP" te wijzigen de optische trajecten en direct de fluorescentie te bekijken met het blote oog.
    5. Zoek de zebravis larvale hersenen in het midden van weergave; Klik vervolgens op het tabblad van de "Overname" om terug te gaan naar de twee-foton-microscopie.
    6. Als een record van de 'before ablatie'-conditie, nemen een beeld van de z-stack met de 20 X objectief scannen-snelheid (warmte-om schade te voorkomen). Later vergelijken de beelden die zijn genomen vóór en na de ablatie experimenten(Figuur 2). Voor het verkrijgen van een z-stapel, klikt u op "Z-Stack" om de optie van z-stack en vouw de tab. de ondergrens (Klik op de "Set First" knoop") na het richten aan de ventrale zijde van de larvale hersenen ingesteld en de bovengrens (Klik op de"Set Last"knop) na zich te concentreren op de dorsale meeste-oppervlak van de hersenen. Klik vervolgens op de knop "Start Experiment" als u wilt uitvoeren de Beeldacquisitie z-stack.
    7. Selecteer de 63 X-objectief door manueel het bewegen van de lens revolver.
    8. Klik op de "Zoeken" tabblad overschakelen naar de epi-fluorescent microscopie, zoek de cellen moeten ablated worden in het midden van de weergave met het blote oog, dan klik op het tabblad van de "Overname" om terug te gaan naar laser scanning microscopie.
  5. Op het tabblad "Overname Mode" wordt de "framegrootte" vastgesteldop door 256 x 256. Klik op "Live" en observeren van de neuronen van belang.
  6. Vanaf de kant van de dorsale-meeste, vinden een brandvlak waarin de cellen moeten ablated worden zijn in focus.
  7. Het markeren van een kleine, cirkelvormige gebied ongeveer eenderde van de cel grootte diameter op elk neuron als een regio van belang (ROI) met behulp van het "Kennisregio's"-functie.
  8. De snelheid van de scan instelt in 13.93 s/256 x 256 pixels (134.42 µm x 134.42 µm), hetgeen overeenkomt met een laser Nadruktijd van ongeveer 200 µs/pixel of 200 µs/0,5 µm. Stel ook 4 herhalingen (' iteratiecyclus: 4'). U kunt ook het aantal iteraties en scansnelheid te optimaliseren, zodat voldoende ablatie wordt bereikt.
  9. De functie 'Bleaching' voor ablatie, in combinatie met de 'Time series (2 cycli)' uitvoeren naar image van het monster (voor en na de ablatie) en "Regions" (voor de ROIs) of gelijkwaardige functies in de software die wordt gebruikt (Figuur 1D).
  10. Door het vergelijken van de eerste afbeelding (vóór ablatie) en de tweede afbeelding (na ablatie) in de tijdreeks cyclus, zorgen ervoor dat na het ontkleuren aangebracht, de fluorescentie in de dalingen van de gerichte cellen aan die waargenomen bij het achtergrondniveau (Figuur 2B).
  11. Als fluorescentie nog steeds aanwezig is na de ablatie is, verhoogt u het aantal iteraties.
  12. Vervolgens verplaatst het brandvlak iets dieper (dat wil zeggen, naar de ventrale zijde), en kies het volgende brandvlak waar VN ablated cellen worden weergegeven.
  13. Het bleken functie uitvoeren zoals hierboven (stap 1.9) beschreven. Herhaal deze stappen totdat alle cellen in de neurale structuur van belang hebben zijn ablated worden.
  14. Na het doorlopen van alle de focal vliegtuigen die betrekking hebben op de neurale structuren moeten ablated worden, Controleer de cellen op afgeschaft fluorescentie. Als sommige cellen worden gevonden om nog steeds worden fluorescerend als gevolg van onvoldoende ablatie, laser-bestralen ze weer zoals hierboven beschreven.
  15. Als de larve worden hersteld van agarose na laser-bestraling moet, probeer niet te dwingen uit de agarose omdat dit de larve kan beschadigen. In plaats daarvan maken zorgvuldig kleine bezuinigingen in de agarose rond de larve loodrecht op het oppervlak van zijn lichaam. Dan, wacht op de larve uit agarose zwemmen op eigen wanneer de verdoving verdwijnt.
  16. Gaat u verder met de volgende larve voor ablatie of control-experimenten met behulp van een andere bevolking van neuronen die afzijdig in het gedrag onder onderzoek uit te voeren.
    Opmerking: Hier, als een besturingselement, de bulbus olfactorius neuronen in UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B larven waren laser-ablated worden met behulp van hetzelfde protocol beschreven (Figuur 2A, rechts).
  17. Laat paar uur, of 1 dag voor nuttige toepassing voordat u verdergaat naar Ca imaging (sectie 2) of gedrags opname (sectie 3). Tijdens deze hersteltijd, controleren de larvale gezondheid (d.w.z., normale spontane zwemmen, geen duidelijk warmte-schade rond de ablated worden gebied, etc.) en verwijderen van de larven tekenen van een slechte gezondheid.

2. calcium Imaging prooi-opgeroepen Neuronale activiteit opnemen in de Pretectum-ablated worden Zebrafish larven

  1. Ter voorbereiding van een opname-kamer, een veilige-seal hybridisatie kamer pakking op een glasplaatje, met de klevende kant naar op het glas, en verwijderen van de bovenste zegel.
    Opmerking: Hierdoor ontstaat een kleine opname-kamer 9 mm in diameter en 0,8 mm in diepte (Figuur 3A).
  2. Vervolgens plaatst u een nylon gaas (grootte van de opening: 32 µm) op een 50 mL-buis met de onderkant opengesneden. Gebruik de dop te koppelen van de Maas op de buis (Figuur 3B).
  3. De paramecia (dat is de prooi moet worden gebruikt als de visuele stimuli voor larve) voor te bereiden.
    Opmerking: Voorbereiden van de Paramecium cultuur (stappen 2.3.1 en 2.3.2) vooraf.
    1. Verkrijgen van tevoren paramecia zaad cultuur uit commerciële bronnen of academische bio-resource centers24 .
    2. Cultuur de paramecium voor meerdere dagen in water met gesteriliseerde met autoclaaf rijst-stro en een pellet van droge bier-gist22 (Figuur 3C).
    3. Giet de paramecium cultuur door 2 zeven achtereenvolgens (met een opening van 150-µm, gevolgd door een ander met een diafragma van de 75-µm) verwijderen van puin uit de cultuur.
    4. Paramecia in de doorstroming van de vorige stap verzamelen op een nylon gaas (13-µm diafragma).
    5. Resuspendeer de paramecia op de nylon gaas in een bekerglas van glas, met behulp van een squeeze fles systeem water (Figuur 3D).
  4. Spoel de mazen (afbeelding 3B) in het systeem water 2 x (Figuur 3E).
    Opmerking: Het doel van deze stap is om alle mogelijke reukstoffen en tastants die zijn opgenomen in het kweekmedium paramecium , aangezien het doel van de huidige studie is om te observeren visueel gedreven Neuronale activiteit.
  5. De larve van een zebravis plaats in de tricaïne oplossing van anesthetize.
  6. Monteer een één larve in 2% lage smeltpunt agarose.
    1. Eerst, magnetron 2% lage smeltpunt agarose en voeg 1/10 volume van 10 x geconcentreerd tricaïne aan de agarose.
    2. Plaats één druppel van de tricaïne-bevattende agarose op de opname-zaal (Figuur 3A).
    3. Na het bevestigen van het agarose is niet te warm, de larve van de narcose (uit stap 2.5) plaats in de agarose, onmiddellijk verwijderen van eventuele overtollige agarose, zodat het oppervlak van het agarose ziet er enigszins convexe.
    4. Snel oriënteren de larve in een staande positie met een ontleden naald (Figuur 1C).
      Opmerking: Deze procedures moeten worden afgerond binnen enkele seconden voordat de agarose stolt.
    5. Zodra de larve is goed gepositioneerd, laat 5 min. voor de agarose te stollen volledig. Giet vervolgens een daling van 1 x tricaine-oplossing op de agarose.
  7. Verwijder de agarose rond het hoofd van de larve van de zebravis en maken ruimte voor de paramecium om te zwemmen met een chirurgisch mes. Om dit te doen, Controleer eerst een paar kleine bezuinigingen in de agarose (Figuur 3F). Vervolgens Verwijder voorzichtig de overtollige agarose door zachtjes water gieten systeem op de kamer.
    Opmerking: Bij deze stap, zal de tricaïne worden uitgewassen.
  8. Vervolgens zet één paramecium in de opname-zaal om te dienen als een visuele stimuli.
    Opmerking: Wanneer de paramecium in de buurt van het hoofd van de larve van de zebravis zwemt, zal het een neuronale reactie (Figuur 3G) roepen.
  9. Plaats de opname kamer onder een epi-fluorescentie Microscoop uitgerust met een wetenschappelijke CMOS camera (Figuur 3H) en selecteer een 2.5 X objectief (Figuur 3ik).
  10. Time-lapse-opnamen van de signalen van de fluorescentie GCaMP verzamelen.
    1. Start de toepassing overname beeld voor de uitgeruste camera.
    2. Klik op "Volgorde Pane" en selecteer "Harddisk Record" op de ruit. Stel de "Frame Count" tot 900 of een andere totale framenummer gewenst in de sectie instellingen van scanner.
      Opmerking: Indien beschikbaar, time-lapse opnamesoftware gebruiken met een module (hier, "harde schijf opnemen") die het mogelijk maakt efficiënt opslaan van de gegevens op een harde schijf.
    3. Klik in het deelvenster "Capture" vastgesteldop de belichtingstijd 30-ms (d.w.z., 33.3 fps) en weggooien van 2 x 2.
    4. De Microscoop aanrakingspaneel beheren, kies een filter instellen voor GFP, zoals de GCaMP soortgelijke excitatie/emissie spectra aan GFP heeft.
    5. Klik op "Live" in het deelvenster vastleggen om te vinden van de larve in de cameraweergave en focus (Figuur 4,A), klik op "Stop Live" en klik op de knop "Start". Sla de film in .cxd of enige andere vorm waarin informatie over de toestand van de overname.
  11. Na de opnames, analyseren de GCaMP6s fluorescerende signalen (Ca signalen) door het verkrijgen van gemiddelde pixelwaarden voor de ROI instellen op een hersenstructuur in de time-lapse film met behulp van de gratis software Fiji25.
    Opmerking: Fiji is een versie voor ImageJ met veel nuttige plug-in is geïnstalleerd en .cxd indeling beeldbestanden met de Bio-formaten kan lezen plug-in.
  12. Als de larve iets tijdens het opnemen verplaatsen, uitvoeren beeldregistratie door het uitvoeren van de TurboReg plug-in26 in Fiji. Selecteer in het menu 'Plugins', 'Registratie' en 'TurboReg'.
  13. Nagaan hoe de gegevens volgens het doel van de studie analyseert. Het volgende is een voorbeeld.
    1. De F/F0 (fluorescentie intensiteit op elk tijdstip, gedeeld door de intensiteit van de fluorescentie in rust of voordat elke voorbijgaande Ca opgetreden) wordt als volgt berekend:
    2. ROIs aangezet met de pretectum of de ILH gebruikend de Manager van de ROI: Selecteer in het menu "Analyze," 'Tools' "ROI Manager", en "Add" aan de lijst met de ROIs (Figuur 4A).
    3. Bereken de gemiddelde pixelwaarden voor de ROIs (dwz., fluorescentie intensiteiten van GCaMP6s) door te selecteren in het deelvenster ROI Manager: "Meer," "Multi maatregel" en "OK." De resultaten opslaan als een spreadsheet-bestand.
    4. Als de signalen lawaaierig zijn, gemiddelde de signalen voor 11 tijd-punten (voortschrijdend gemiddelde) met behulp van een toepassing die kan omgaan met gegevens uit een werkblad.
    5. F (intensiteit van de fluorescentie na verloop van tijd) delen door F0 (intensiteit van de fluorescentie op basaal niveau) voor de berekening van de intensiteit van de genormaliseerde fluorescentie. Een voorbeeld van data visualisatie, veranderingen in genormaliseerde intensiteit van de fluorescentie van de GCaMP6s in de pretectum en de ILH zijn vergelijkende en toegewezen op de paramecium trajecten (Figuur 4B - D).

3. beoordeling van de gedragsmatige gevolgen na Laser Ablatie

  1. Instellen van een gedrags-opname-systeem dat uit een stereoscoop uitgerust met een video camera bestaat. Het gebruik van een camera met een passende afbeelding acquisitie software, commerciële of op maat gemaakte (Figuur 5A).
  2. Optimaliseer de lichtomstandigheden zodat de paramecium kan worden gedetecteerd door de beeldverwerking. Gebruik bijvoorbeeld een ring wit LED licht met een spacer (Figuur 5B).
    Opmerking: De afstand en de hoek van de LED bepaalt de vormgeving van het monster (dat wil zeggen, licht in donkere achtergrond of donkere in lichte achtergrond) en zijn daarom cruciaal voor succesvolle beeldverwerking. Bepaal de beste hoogte voor het tussenstuk (Figuur 5C).
  3. Plaats een larve van de zebravis (hersteld van het experiment van de laser-ablatie beschreven in sectie 1) in een gedrags opname kamer (die was aangesloten op een glasplaatje) met het oorspronkelijke bovenste zegel verwijderd (Figuur 5D).
  4. 50 paramecia van de cultuur (stap 2.3.5) verzamelen met behulp van een micropipet en plaats ze in de zaal van de opname.
  5. Plaats een cover slip op de top van de kamer van de opname. Zet een kleine druppel water op de cover slip alvorens op het wateroppervlak van de opname kamer om te voorkomen dat de invoering van de lucht in de kamer te plaatsen.
    Opmerking: In deze stap zal wat water met paramecia uit de zaal opnemen overlopen. Het resterende aantal paramecia in de zaal van de opname zal ongeveer 30-40.
  6. Plaats het cupje van de opname (met een larve en paramecia) in de lighting system (Figuur 5D).
  7. De time-lapse opname op 10 fps voor 11 min (6.600 frames) te starten.
  8. (Optioneel) Voor elke larve die werd getest voor gedrag, observeren de fluorescentie van de laser-ablated worden gebieden door fluorescent microscopie te bevestigen de effectiviteit van de laser-ablatie (d.w.z., afwezigheid of aanzienlijk verminderd aantal, fluorescerende cellen in de laser-bestraalde gebied).
    Opmerking: Zelfs na bestraling, kunnen nog steeds sommige fluorescerende cellen worden waargenomen als gevolg van latere begin van Gal4 genexpressie in cellen die gedifferentieerd na ablatie27.
  9. Voer na het opnemen van de larve gedrag, te compenseren voor het gebrek aan uniformiteit in de achtergrond, een divisie van de pixel-bij-pixel van elk frame een gemiddelde beeld in Fiji: Klik op 'Verwerken', 'Afbeelding Calculator', ' operatie: verdelen ', ' 32-bits (float) resultaat ', en ' OK'. Een gemiddelde beeld, klik op 'Afbeelding', 'Gestapeld', 'Z-Project', 'Gemiddelde intensiteit' en 'OK' (Figuur 5E, F).
  10. Het aantal paramecia links in de kamer door te klikken op 'Analyseren', 'Analyseren deeltjes', de instelling voor aantal een gebied bereik dat betrekking heeft op alle de paramecia, de 'Toon: maskers' aan te vinken en op 'OK' te klikken. De optie 'Toon: maskers' zal zorgen voor een beeld van de uitgepakte paramecia (Figuur 5G), met een lijst van het aantal deeltjes (paramecia) in elk frame.
  11. Het aantal paramecia nog in de zaal van de opname worden uitgezet na verloop van tijd. Aangezien de ramingen van het aantal paramecia lawaaierig zijn, is het aan te raden het uitvoeren van een voortschrijdend gemiddelde op elk punt in een bereik van 600 frames (1 min) op het werkblad.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specifieke neuronen waren genetisch gelabeld met EGFP of GCaMP6s, waarvan de expressie werden verdreven in Gal4 lijnen. Een Gal4 lijn gSAIzGFFM119B werd gebruikt om de label van een nucleus in het pretectal gebied (magnocellular oppervlakkige pretectal kern), en een subpopulatie van bulbus olfactorius neuronen. Een andere lijn van de Gal4, hspGFFDMC76A, werd gebruikt om de label van de ILH. We laser-ablated worden de pretectal neuronen bilateraal (Figuur 2

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel de twee-foton laser een uitstekende ruimtelijke resolutie heeft te specifiek lasertherapie individuele neuronen, moet grote voorzichtigheid worden genomen om te voorkomen dat ongewenste schade op het hersenweefsel als gevolg van warmte. De belangrijkste stap in het baarmoederslijmvlies experiment is om te bepalen van de optimale hoeveelheid laser-bestraling. Onvoldoende bestraling mislukt om te doden van de neuronen. Te veel bestraling zal warmte-schade het omringende weefsel, die zal resulteren in ongewenste effe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen conflicten van belang verslag.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studies werden gefinancierd door subsidies ontvangen de MEXT JSPS KAKENHI Grant nummers JP25290009, JP25650120, JP17K07494 en JP17H05984.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
NuSieve GTG AgaroseLonzaCat.#50080low-melting temperature agarose
6 cm petrischaalFALCONProduct#:351007
dissectie naaldAS ONE CorporationCat. No. 2-013-01https://keystone-lab.com/nl/item/detail/404142
LSM7MPCarl Zeisstwee-foton laser scanning microscoop
W Plan-Apochromat 63x/1.0Carl Zeiss63X objectieflens
Imager.Z1Carl Zeisseen epi-fluorescentiemicroscoop
ZENCarl ZeissBeeldverwervingssoftware voor confocale microscopen
Secure-Seal Hybridisatiekamerpakking, 8 kamers, 9 mm diameter x 0.8 mm diepteMolecular ProbesCatalogusnr. S-24732Wordt gebruikt als opnamekamer in Ca-beeldvorming
BeeldvormingskamersGrace Bio-LabsCoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5Wordt gebruikt als gedragsopnamekamer
chirurgisch mesMANIOphthalmisch mes MST15
ORCA-Flash4.0Hamamatsu Photonicsmodel:C11440-22CUeen wetenschappelijke CMOS-camera
HCImageHamamatsu Photonicsbeeldverwervingssoftware
Hard Disk Recording moduleHamamatsu PhotonicsEen softwaremodule die het mogelijk maakt om de filmbestanden in korte tijd op een harde schijf op te slaan
SZX7Olympusstereoscoop
DF PL 0.5XOlympusobjectieflens voor SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 VisioFLIR Systems, Inc.Productnr. GS3-U3-41C6NIR-CCMOS-camera
XIMEA xiQ-cameraXIMEAProductnr. MQ042RG-CMCMOS-camera
een ring LED-lichtCCSModel: LDR2-100SW2-LAWitte LED
Nylon gaas 32µmTokyo ScreenN-No.380Thttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Nylon gaas 13µmTokyo ScreenN-No. 508T-Khttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
Metaalzeef 150 micron openingTokyo Screenhttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
Metaalzeef 75 micron openingTokyo Screenhttp://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOSAsahi Food & Healthcare, Co. Ltd.droge biergist
LabVIEWNational Instrumentseen geïntegreerde ontwikkelomgeving voor programmeren
Mai-Tai HPSpectra Physics twee-foton laser 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neuroscience. 296, 26-38 (2015).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  3. Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
  4. Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
  5. Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
  6. Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
  7. Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
  8. Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
  9. Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
  10. Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
  11. Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
  12. Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86(2013).
  13. Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015(2016).
  14. Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
  15. Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
  16. Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878(2014).
  17. Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
  18. Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
  19. Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
  20. Ewert, J. -P. Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , Springer Verlag. (1980).
  21. Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029(2017).
  22. Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
  23. Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , University of Oregon Press. (2007).
  24. National BioResource Project Paramecium. , Available from: http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en (2017).
  25. Fiji. , Available from: https://fiji.sc (2017).
  26. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  27. Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
  28. Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66(2005).
  29. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Twee foton laserablatieneuronale populatieablatiecalcium imaginganalysegedragsregistratie zebravissenpretectohypothalamische circuitbrein van zebravislarvenprooivangstgedraginferior lobe hypothalamusepiflorescentiemicroscopieZ stack acquisitie

Gerelateerde artikelen