Preklinische beoordeling van het topicale van de antikanker cumarine-OT48 door spheroïden, kolonie vorming Assays en Zebrafish Xenografts

Samenvatting

Hier presenteren we de preklinische screening van antikanker coumarinen met behulp van 3D-cultuur en zebravissen.

Samenvatting

In vitro en in vivo pre-klinische screening van nieuwe therapeutische agenten zijn een essentieel onderdeel van de Geneesmiddelenontwikkeling kanker. Hoewel menselijke kanker cellijnen inspelen op de therapeutische bestanddelen in 2D (dimensionale) enkelgelaagde celculturen, werden 3D cultuur systemen ontwikkeld om te begrijpen van de werkzaamheid van geneesmiddelen in meer fysiologisch relevante modellen. In de afgelopen jaren, werd een paradigmaverschuiving waargenomen in de pre-klinisch onderzoek voor het valideren van de potentie van nieuwe moleculen in 3D cultuur systemen, preciezer het nabootsen van de communicatie van de tumor. Deze systemen karakteriseren de ziekte staat in een meer fysiologisch relevante wijze en helpen om beter mechanistische inzicht en begrip van de farmacologische werkzaamheid van een bepaalde molecule te winnen. Bovendien, met de huidige trend bij het verbeteren van in vivo modellen van kanker, zebravis heeft ontpopt als een belangrijk gewervelde model om te beoordelen in vivo de vorming van de tumor en studie van het effect van therapeutische agenten. Hier, we onderzocht de therapeutische werking van hydroxycoumarin OT48 alleen of in combinatie met BH3 mimetics in long kanker cellijn A549 met behulp van drie verschillende 3D cultuur systemen met inbegrip van de kolonie vorming assays (CFA), sferoïde vorming assay (SFA) en in vivo zebrafish xenografts.

Inleiding

Kanker wordt veroorzaakt door cellulaire mutaties en dientengevolge de biochemische signaalroutes triggering van ongecontroleerde celdeling en weerstand tegen celdood worden verstoord. Tumoren interfereren met fysiologische functies van spijsverteringsstelsel, zenuwachtig, bloedsomloop systems en vervolgens naburige weefsels¹. Ondanks uitgebreid onderzoeksinspanningen blijft kanker de meest voorkomende levensbedreigende ziekte in de wereld². Precisie geneeskunde is erkend als basis van toekomstige cancer therapeutics. Nieuwe moleculaire entiteiten worden regelmatig getest in combinatie met bestaande geneesmiddelen ter verbetering van de klinische resultaten.

Een van de belangrijke beperkingen in verband met de ontwikkeling van nieuwe efficiënte gerichte therapieën is echter de mislukking van veelgebruikte tests simuleren de exacte biologische uitkomst van drug blootstelling³. Kanker drugontdekking is nog steeds voornamelijk gebaseerd op testen van de werkzaamheid van de therapeutische agenten in kanker cellijnen gekweekte in 2D enkelgelaagde culturen, die moeilijk te valideren in klinische proeven⁴. Daarom is er een groeiende belangstelling voor de ontwikkeling van betere kanker modellen die beter na te de ingebouwde functies van tumoren in vivo^{5 bootsen}. In de afgelopen jaren resulteerde een groeiende interesse in 3D cultuur modellen in de ontwikkeling van verbeterde methodologieën voor het produceren van 3D tumor modellen⁵.

Hier presenteren we een aanpak met drie verschillende 3D cel cultuur technieken waardoor ter verbetering van het inzicht in de potentie van de hydroxycoumarin OT48⁶ in combinatie met BH3 mimetics voordat meer in de diepte in vivo tests. Onze werkwijze bestaat uit de kolonie en SFAs te combineren met een in vivo tumor vorming test gebaseerd op een model van de zebravis verder de werkzaamheid van de combinatie van OT48 en BH3 mimetics in Long kankercellen valideren en controleren van de progressie van kanker in een levende organisme.

Kolonie vorming testen worden routinematig gebruikt om te beoordelen van de werkzaamheid van anticancer agents voor zowel vaste als hematopoietische kankers. De test bepaalt de mogelijkheid van een cel te vermenigvuldigen voor onbepaalde tijd en kolonies⁷te vormen. Het effect van een antikanker agent op de kolonievormende vermogen van de cellen wordt bepaald door de daling van het aantal en/of grootte van de kolonies.

Spheroïden in vitro tumor modellen vertegenwoordigen en dienen als een goedkope screening platform voor anticancer agents. Spheroïden zijn aggregaten van cellen groeien in suspensie of ingesloten in een 3D-matrix. Deze aanpak wordt veel gebruikt voor drug screening en studies van tumor groei, proliferatie en immuun interactie⁸.

Om volledig te begrijpen de eigenschappen van een nieuwe drug, is het essentieel om uit te voeren in vivo experimenten met knaagdieren. Deze conventionele methode is echter duur en tijdrovend. In de afgelopen jaren werd zebravissen (Danio rerio) een grote schaal bestudeerde laboratorium organisme dat is goedkoper en sneller te verhogen. Tumoren in de zebravis vertegenwoordigen een 3D cel cultuur benadering maar binnen de in vivo -instelling van een gewervelde⁹ontwikkeld.

Over het geheel genomen gebruiken we hier drie verschillende 3D cultuur benaderingen, met inbegrip van GVO, SFAs en zebrafish in vivo de vorming van de tumor om aan te tonen van de antikanker capaciteit van hydroxycoumarin OT48 in een long kanker A549 cel model in combinatie met BH3 mimetics.

Protocol

1. kolonie vorming Assays

1. Cultuur A549 cellen bij een concentratie van 20.000 cellen/cm² in 15 mL RPMI1640 cel kweekmedium aangevuld met 10% FBS (foetale runderserum) en 1% antibiotica in een maatkolf van 75 cm² in een CO₂ incubator bij 37 ° C en 5% CO₂.
2. Op de dag van het experiment, bepalen van de concentratie van de cel met behulp van een hemocytometer. Verzamelen van 50.000 cellen door centrifugeren bij 400 x g gedurende 7 minuten in een tube van 1,5 mL microcentrifuge en resuspendeer de cellen in 100 µL van 1 x steriel PBS (Phosphate Buffered Saline) in 1,5 mL tubes.
3. Afzien 1.1 mL Halfmassief methylcellulose gebaseerde voedingsbodem (MCBM) in 15 mL buisjes met een multipipette. Één buis voorbereiden op elke voorwaarde.
4. Voeg 110 µL van FBS 1.1 ml van MCBM met behulp van een P200-micropipet.
5. De cellen van de zaden bij 1000 cellen/mL. Verzamelen van 2,4 µL celsuspensie van de stockoplossing (50.000 cellen in 100 µL van 1 x PBS) met behulp van een micropipet P2 en meng 1.1 mL MCBM aangevuld met 10% FBS.
6. Na het toevoegen van de gewenste cellen, vortex de buizen voor 1 min, houden ze verticaal op de hoogste snelheid tot MCBM en cellen goed mengen.
7. Voeg test verbindingen (OT48 zelfstandig of in combinatie met A1210477). Bereiden van een aparte buis als een besturingselement voor het oplosmiddel gebruikt (hier dimethylsulfoxide (DMSO)). Afhankelijk van de concentratie van de stoffen en het volume voor elke voorwaarde toegevoegd, zal het oplosmiddel besturingselement bevatten de hoogste concentratie oplosmiddel gebruikt voor het verdunnen van de teststof, om te beoordelen voor nadelige gevolgen die veroorzaakt door het oplosmiddel.
8. Vortex buizen gedurende 1 minuut.
9. Toevoegen voor elke assay, 1 mL van het mengsel met een P1000 micropipet naar het midden goed van een 12-well cel cultuur plaat.
10. Vul lege putten met 1 mL steriel water of 1 x PBS te stabiliseren vochtigheid.
11. Incubeer cultuur platen voor 10 dagen in een broedmachine bij 37 ° C en 5% CO₂.
12. Na 10 dagen incubatie, voeg 200 µL van een MTT-(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide)-stockoplossing (5 mg/mL) aan elk putje te bereiken een eindconcentratie van 1 mg/mL.
13. Incubeer 10 min in een incubator bij 37 ° C en 5% CO₂. Levensvatbare kolonies zal blijken violet.
14. De opname met behulp van een digitale camera met behulp van de witte achtergrond plaat (LAS witte dia tray). Gebruik de volgende instellingen: methode, digitaliseren; Blootstelling type, precision; Belichtingstijd, handleiding, 1 seconde; Gevoeligheid/resolutie, hoge resolutie. Sla de afbeelding in TIFF-indeling.
15. Levensvatbare kolonies te kwantificeren door ImageJ software te gebruiken. Kies op de menubalk "afbeelding | Type | 8 bit". Kies op de menubalk "aanpassen | Drempel". Drempel instellen om te bepalen en houden constant voor alle omstandigheden; Kies op de menubalk "Analyze | Analyseren van deeltjes". Gegevens opslaan en analyseren met een statistieken software voor grafische weergave.

2. sferoïde vorming Assay

1. Cultuur A549 cellen bij een concentratie van 20.000 cellen/cm² in 75 cm² flacons met 15 mL RPMI 1640 voedingsbodem aangevuld met 10% FBS en 1% antibiotica.
2. Op de dag van het experiment, bereiden een 96 goed U-bodemplaat.
3. Plaat 10.000 cellen in een put waarin al het stof van belang (hier 50 µM van OT48) en/of 20 µM van A1210477. Het uiteindelijke volume aan 100 µL cultuurmedium van de cel. Het aantal cellen die uniforme spheroïden met een intact buitenrand vormen wordt beschouwd als voldoende om het formulier spheroïden.
4. Incubeer gedurende 3 dagen in een broedmachine bij 37 ° C en bij 5% CO₂.
5. Na 3 dagen incubatie, foto's vastleggen van de spheroïden met behulp van een lichte Microscoop met 4 x vergroting.

3. de zebravis Xenograft Assay

Opmerking: Deze technische aanpak is gevisualiseerd als een schema (Figuur 1).

1. Voorbereiding van de voorraad reagentia
   1. Bereiden 1 L voor 30 x Danieau de oplossing: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl 12 mM MgSO₄∙7H₂O, 18 mM Ca (₃)₂en 150 mM HEPES. Aangepast aan de pH van de buffer aan 7.6 met behulp van een pH-meter.
   2. Bereiden van 1% (50 x) tricaïne-oplossing: Los 20 mg ethyl 3-aminobenzoaat methanesulfonate (tricaïne) in 2 mL gedestilleerd water.
   3. 1% fenol rood-PBS-oplossing te bereiden: Voeg 2 µL van fenol Red natrium zout oplossing voor 198 µL van gesteriliseerde PBS-oplossing in een buis 1,5 µL.
   4. 3% methylcellulose bereiden: Voeg 3 g methylcellulose tot 100 mL 1 x Danieau de oplossing.
2. Zebravis eiproductie en incubatie
   1. Scheid een vrouwelijke en een mannelijke zebrafish in een partitie tank gevuld met UV-gesteriliseerd en gefilterde leidingwater bij 28,5 ° C in het donker. Meng na 24u van scheiding, vis van beide geslachten tot paring. Bevruchte eieren van de paring tank overbrengen naar een petrischaal met 5 mL van de verse Danieau oplossing.
   2. Het wassen van eieren driemaal met 5 mL van de Danieau oplossing. Voor het wassen, moet u zorgvuldig de eieren met een pipet en transfer naar 5 mL van de verse oplossing gecombineerd. Incubeer gedurende 8 h bij 28,5 ° C.
      1. Na 8 uur incubatie in Danieau de oplossing wijzigen in Danieau de oplossing met 0,03% 1-fenyl-2-thioureum (FTU) voor de remming van de pigmentatie. Uitzoeken ondoorzichtige eieren (onbevruchte of met onontwikkelde embryo's) om te voorkomen dat besmetting.
3. Embryo dechorionation
   1. 24 h post bevruchting (hpf), dechorionate zebrafish embryo's met behulp van scherpe pincet. Incubeer broedeieren embryo's in Danieau de oplossing met 0,03% FTU bij 28,5 ° C tot en met 48 hpf.
4. Stof-behandeld cel voorbereiding
   1. Zaad A549 cellen op 20.000 cellen/cm² in 25 cm² cultuur kolven. Na 24 h van het zaaien, het toevoegen van verbindingen (hier OT48 bij 50 µM en en/of A1210477 bij 20 µM) gedurende 24 uur in een incubator bij 37 ° C en 5% CO₂. De behandeltijd voor elke verbinding instellen om de levensvatbaarheid van de cellen maar daartoe hen naar de dood van de cel. Ditmaal punt moet individueel worden ingesteld gebaseerd op de levensvatbaarheid van de cellen, morfologie en moleculaire merkers.
   2. 2 h vóór het einde van de behandeling, kleurstof vlek cellen met 4 µM voor fluorescerende cel tracker CM-Dil bij 37 ° C en 5% CO₂. Na 2 uur incubatie, trypsinize cellen met 0,05% trypsine-EDTA en Verdun 10⁶ cellen in 50 µL van fenol rood-PBS oplossing vóór injectie.
5. Micro-injectie van kankercellen voor xenograft vorming
   1. Anesthetize zebrafish in een oplossing van 0,02% tricaïne voor 5 min totdat zij zich op een agarplaat vestigen.
   2. Trek een 1,0 mm (buiten diameter (OD) glazen capillaire) door een micropipet trekker (programma-instellingen: P: 300, warmte: 260, trekken: 60, VEL: 50, en de tijd: 200). Knip de microcapillary met een spuit te produceren een scherpe rand. Laden microcapillaries met 20 µL van cel/fenol rood-PBS oplossing. Instellen van de druk van de injectie en tijd af te zien van 2 nL per injectie.
   3. Injecteren van 100 – 200 cellen in de dooierzak door injecterend 6 tot 10 nL via 3 tot 5 injecties. Na injectie, mogelijk vis te herstellen voor 10 tot 30 min in 5 mL van de verse Danieau oplossing met FTU oplossing. Verzending vissen in 24-Wells-platen met 1 mL van de Danieau oplossing met FTU oplossing zijn en incubeer gedurende 72 uur bij 28,5 ° C.
   4. Na 72 uur incubatie, anesthetize vis in een tricaïne oplossing van 0,02% en immobiliseren op een glasplaatje met een daling van 3% methylcellulose. 5 x fotograferen door fluorescentie microscopie bij een golflengte van 620 tot 750 nm.
   5. Kwantificeren van de grootte van fluorescerende tumoren ImageJ softwarematig. Kies op de menubalk "Analyze | Maatregel". Waarden die overeenkomen met het fluorescent signaal opslaan en analyseren met een statistieken software voor grafische weergave.

Resultaten

In Figuur 2cel longkanker lijn A549 was uitgezaaid in MCBM aan vorm kolonies na behandeling met OT48 alleen of in combinatie met BH3 mimetische A1210477 bij de aangegeven concentraties. De resultaten toonden aan dat de combinatie aanzienlijk verminderd aantal, de grootte en de totale oppervlakte van de koloniën na 10 dagen incubatie.

In Figuur 3, A549 cellen werden beha...

Discussie

De tarieven van de kolonie vorming verkregen met MCBM, is afhankelijk van het celtype. Voor niet-aanhanger cellen, wordt het aantal kolonies meestal veel hoger vergeleken met aanhangend cellen. We hebben vastgesteld dat de A549 cellen gevormd 30 tot 40 kolonies na 10 dagen. Eerder hebben we gemeld voor verschillende leukemie cellen dat aantal kolonies tussen de 200 tot 250^{9 is}. Onze resultaten toonden aan dat OT48 alleen een significante afname van het aantal kolonies alleen niet produceren. Echte...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Benodigdheden voor kolonievormingstesten
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Penicilline-Streptomycine	Lonza	17-602E	-20 C°
Celcultuurflacon T75	SPL	70075	RT
PBS-oplossing	Hyclone	SH30256.02	RT
1,5 ml buis	Extragene	Tube-170-C	RT
15 ml buis	Hyundai Micro	H20015	RT
12 wel plaat	SPL	30012	RT
MethoCult	StemCell technologies	4230	-20 C°
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT-poeder)	Sigma	M5622	4 C°
LAS4000	GE Healthcare Technologies		RT
Benodigdheden voor sferoïdvormingstesten
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Penicilline-streptomycine	Lonza	17-602E	-20 C°
Celcultuurflacon T75	SPL	70075	RT
PBS-oplossing	Hyclone	SH30256.02	RT
Trypsin-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
Corning costar ultra low attachemnt 96 wel plaat	Corning	3474	RT
Microscopie	Nikon	Eclipse TS100	RT
Benodigdheden voor zebravis xenografts
A549	ATCC	CCL-185	37 C°
RPMI 1640	Lonza	30096	4 C°
FBS	Biowest	S1520-500	-20 C°
Penicilline-streptomycine	Lonza	17-602E	-20 C°
Celcultuurflacon T25	SPL	70025	RT
Celcultuurflacon T75	SPL	70075	RT
Celcultuurflacon T175	SPL	71175	RT
1,5 ml buis	Extragene	Tube-170-C	RT
24 wel plaat	SPL	30024	RT
Petrischaal	SPL	10100	RT
PBS-oplossing	Hyclone	SH30256.02	RT
Trypsin-EDTA	Gibco	25-300-054	4 C°
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	71382	RT
Kaliumchloride (KCL)	Sigma-Aldrich	P9541	RT
Magnesiumsulfaat heptahydraat (MgSO4.7H2O)	Sigma-Aldrich	M2773	RT
Calciumnitraat tetrahydraat (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	C1396	RT
HEPES-oplossing	Sigma-Aldrich	H0887	RT
Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521	RT
Fenolrode oplossing	Sigma-Aldrich	P0290	RT
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512	RT
1-fenyl-2-thioureum (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	RT
CM-Dil kleurstof	Invitrogen	C7001	-20 C°
Glazen capillair	World Precision Instruments	TW 100F-4	RT
Micropipettrekker	Shutter instrument, USA	P-97	RT
Microinjector	World Precision Instruments	PV820	RT
Spuit	KOVAX	1ml	RT
Micro lader	Eppendorf	5242956003	RT
Glazen plaat	Marienfeld	HSU-1000612	RT
Fluorescentiemicroscopie	Leica	DE/DM 5000B	RT