Eenvoudig en effectief beheer en visualisatie van deeltjes in de bloedsomloop van kleine vissen met behulp van nier injectie

Samenvatting

Dit artikel demonstreert de beginselen van een snelle, minimaal invasieve injectie van fluorescerende microdeeltjes in de circulatory system van kleine vissen en de visualisatie in vivo van het microdeeltjes in vis bloed.

Samenvatting

De systemische toediening van micro-formaat deeltjes in een levend organisme kan worden toegepast voor therapieën visualisatie, drugs en levering van vaccin, implantatie van transgene cellen en kleine optische sensoren. Echter intraveneuze microinjections in kleine dieren, die meestal in biologische en veterinaire laboratoria worden gebruikt, zijn zeer moeilijk en vereist opgeleid personeel. Hierin tonen wij een robuuste en efficiënte methode voor het binnenbrengen van deeltjes in de bloedsomloop van volwassen zebravissen (Danio rerio) door injectie in de nier vis. Om te visualiseren de geïntroduceerde microdeeltjes in de therapieën, stellen wij voor een eenvoudige intravital beeldvormende techniek in de kieuwen van de vis. In vivo monitoring van de zebravis bloed pH werd uitgevoerd met behulp van een ingespoten microencapsulated TL probe, SNARF-1, om aan te tonen een van de mogelijke toepassingen van de beschreven techniek. Dit artikel bevat een gedetailleerde beschrijving van de inkapseling van pH-gevoelige kleurstof en toont aan de beginselen van de snelle injectie en visualisatie van de verkregen microcapsules voor in vivo opname van het fluorescerende signaal. De voorgestelde methode van injectie wordt gekenmerkt door een laag sterftecijfer (0-20%) en hoog rendement (70-90% succes), en het is eenvoudig in te stellen met behulp van algemeen beschikbare apparatuur. Alle beschreven procedures kunnen worden uitgevoerd op andere kleine vissoorten, zoals guppies en medaka.

Inleiding

Het beheer van micro-formaat deeltjes in een dierlijke organisme is een belangrijke taak op gebieden zoals drugs en vaccin levering¹, therapieën visualization²transgene cel implantatie³en kleine optische sensor implantatie ^{4 , 5}. de implantatie procedure voor microscale deeltjes in het vaatstelsel van kleine laboratoriumdieren is echter moeilijk, vooral voor delicate waterorganismen. Voor specimens van de populaire onderzoek zoals zebrafish, is het raadzaam dat deze procedures worden verduidelijkt met behulp van video protocollen.

Intracardiac en capillaire microinjections nodig opgeleid personeel en unieke microchirurgie voorzieningen voor de levering van microobjects in zebrafish bloed. Eerder, een retro-orbitaal Handleiding injectie³ werd voorgesteld als een gemakkelijke en effectieve methode voor het beheer van hele cellen. Echter in onze ervaring duurt vanwege de kleine oppervlakte van het oog capillaire netwerk, het veel praktijk om het gewenste resultaat van deze techniek.

Hierin beschrijven we een methode voor robuuste en efficiënte microparticle implantatie in de bloedsomloop door Handleiding injectie rechtstreeks in het nierweefsel van volwassen zebrafish, die rijk is aan haarvaten en renale vaartuigen. Deze techniek is gebaseerd op het video protocol voor cel transplantatie in de zebravis nier⁶, maar de traumatische en tijdrovende microchirurgische stappen werden uitgeschakeld. De voorgestelde methode wordt gekenmerkt door lage sterfte (0-20%) en hoog rendement (70-90% succes), en het is eenvoudig in te stellen met behulp van algemeen beschikbare apparatuur.

Een belangrijk onderdeel van het voorgestelde protocol is de visualisatie van de geïmplanteerde microdeeltjes (als ze TL of colorized zijn) in de haarvaten van gill, dat voorziet in de verificatie van de kwaliteit van de injectie, een ruwe relatieve beoordeling van het aantal ingespoten deeltjes, en de opsporing van de spectrale signaal voor fysiologische metingen vanuit het circulerende bloed. Als een voorbeeld van de mogelijke toepassingen van de beschreven techniek, wij laten zien dat het protocol voor in vivo metingen van zebravis bloed pH met behulp van een microencapsulated fluorescerende sonde, SNARF-1, oorspronkelijk voorgesteld in Borvinskaya et al. 2017⁵.

Protocol

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de EU-richtlijn 2010/63/EG voor dierproeven en zijn goedgekeurd door het dier onderwerpen onderzoek Comité van Instituut Biologie aan de Universiteit van de staat van Irkoetsk.

1. fabricage van Microcapsules

Opmerking: De Microcapsules uitvoering een fluorescente kleurstof worden bereid met een laag-voor-laag-vergadering van tegengesteld geladen polyelectrolytes^7,8. Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur.

1. Om te synthetiseren poreuze CaCO₃ microcores bijvoeging van de fluorescente kleurstof, Meng 2 mL van de oplossing van de SNARF-1-dextran (de meeste polymeer-gebonden fluorescente kleurstof zoals FITC-BSA kan worden gebruikt) met een concentratie van ~ 2 mg/mL met 0,6 mL elk van 1 mol/L-oplossingen van CaCl₂ en Na₂CO₃ snel roeren.
   Opmerking: Aandacht besteden aan de verschillende gevoeligheden van fluorescente kleurstoffen aan photobleaching; Als een lichtgevoelige fluorescente sonde (zoals SNARF-1) wordt gebruikt, moeten de manipulatie en de opslag van de deeltjes worden uitgevoerd met zo weinig licht mogelijk.
2. Na 5-10 s van agitatie, spoel de suspensie 2 mL microcentrifuge buizen en centrifuge voor 15 s bij 10.000-12.000 g tot pellet CaCO₃ microcores.
3. Verwijder het supernatant, wassen van de kernen met ~ 2 mL gedeïoniseerd water en resuspendeer de pellet door schudden.
4. Herhaal de procedure centrifugeren-wassen drie keer in totaal. Na de laatste centrifugeren, verwijder het supernatant.
5. Incubeer de microcores gedurende 1 minuten in een ultrasoonbad om hun aggregatie.
   Let op: Vergeet niet om de oren met koptelefoon te beschermen.
6. Om te storten de eerste polymeer laag van de sjablonen, resuspendeer de kernen in ~ 2 mL van een 4 mg/mL oplossing van poly(allylamine hydrochloride) (PAH) in 1 mol/L NaCl.
   1. Houd de microcores in de oplossing voor ~ 5 min met constante schudden.
   2. Na 15 albums van centrifugeren, verwijder het supernatant met de niet-afhankelijke PAH. De overdekte microcores met gedeïoniseerd water minstens 3 maal door middel van meerdere centrifugeren en wassen stappen wassen. Na de laatste centrifugeren, verwijder het supernatant.
   3. Incubeer de microcores gedurende 1 minuten in een ultrasoonbad om hun aggregatie.
      Opmerking: Als de toegepaste fluorescente kleurstof kationische, begint van poly (natrium-4-styreensulfonaat) (PSS) in 1 mol/L NaCl (zie stap 1.7).
7. Herhaal stap 1.6 met ~ 2 mL van een 4 mg/mL oplossing van PSS (ook met 1 mol/L NaCl) om te storten de tweede polymeer laag van de sjablonen.
8. Herhaal stap 1.6 en 1.7 zesmaal te deponeren 12 polymere lagen.
   Opmerking: Het is niet aanbevolen om een lange pauze (~ 12 h of meer) te nemen in de procedure tot ~ 3-5 lagen zijn nedergelegd omdat CaCO₃ microcores zonder dekking kunnen de neiging om recrystallize. Merk op dat PSS dekking een hogere aggregatie van de microcores veroorzaakt en de lange pauze is aan te raden dat alleen wanneer pak of poly-L-lysine met polyethyleenglycol geënt (PLL-g-PEG) is de buitenste laag.
9. Incubeer de overdekte microcores in 2 mg/mL PLL-g-PEG (~ 1 mL per microtube) gedurende ten minste 2 uur.
   1. Wassen van de microcores met water via opeenvolgende centrifugeren en resuspensie stappen. Na de laatste centrifugeren, verwijder het supernatant.
10. Voor het verkrijgen van holle microcapsules, Los de CaCO₃ sjablonen door toevoeging van 2 mL 0,1 mol/L ethyleendiamminetetra (EDTA) zuuroplossing (aangepast aan de pH 7.1 met NaOH) naar de overdekte microcores.
    1. Na ~ 5 min van incubatie, centrifugeer de microcapsules voor 45 s en negeren het supernatant met de EDTA.
    2. Herhaal stap 1.10-1.10.1 tweemaal.
11. Wassen van de microcapsules met 0,9% NaCl driemaal door meerdere centrifugeren binnen 45 stappen s gevolgd door wassen stappen. Na de laatste stap van het centrifugeren, verwijder het supernatant.
    Opmerking: De uiteindelijke microcapsule oplossing voor injectie moet worden bewaard steriele (bijvoorbeeld door toevoeging van ampicilline, 0,1 mg/mL), en de media moeten biocompatibel met het doel van onderzoek (isotone media met neutrale pH).
12. Schatting van de concentratie van de bereid microcapsules in een hemocytometer onder een fluorescentie Microscoop. Neem een serie foto's van de microcapsules, meet de diameter van over de honderd microcapsules ImageJ⁹ of gelijkwaardige softwarematig en onderzoeken de grootteverdeling met behulp van een histogram.
13. Winkel de verkregen ingekapseld sonde in het donker.
    Opmerking: na enkele wasbeurten in steriele 0.9% NaCl, de microcapsules kunnen worden opgeslagen voor maanden bij 4 ° C. Volledige droging van de microcapsules tijdens de opslag wordt niet aanbevolen.

2. voorbereiding van optische Setup en kalibratie van Microencapsulated SNARF-1

Opmerking: Ruwe pH metingen met microencapsulated SNARF-1 kan worden gemaakt met behulp van afbeeldingen in twee kanalen van een fluorescente microscoop⁷, maar in dit protocol een één-kanaals fluorescente microscoop op een vezel-spectrometer aangesloten werd toegepast.

1. Plaats van de vereiste set fluorescentie filters om de fluorescente microscoop volgens de kenmerken van de toegepaste fluorescente kleurstof en inschakelen van de TL-lamp.
   1. Trek de hendel aan de oculairs.
      Let op: Teveel licht kan schade aan de spectrometer-matrix. Dus, zorg ervoor dat de hendel in de modus "oculair" wanneer de spectrometer wordt niet gebruikt.
   2. Sluit één uiteinde van de optische vezel aan de spectrometer en het andere uiteinde op een collimator. Plaats de collimator met adapters in de focus van de camera-buis of andere beschikbare poort van de fluorescente microscoop.
   3. Inschakelen van de spectrometer. De spectrometer controleprogramma uitvoeren en stel de spectrometer voor metingen.
2. Voor de kalibratie van de microcapsule partij, ~ 5 µL van de microcapsule ophanging (microcapsules ~ 10 000 per µL in gedeïoniseerd water) op een microscoopglaasje plaats en drogen van de druppel op een donkere plek (bijvoorbeeld in een thermostaat bij 35 ° C).
   1. Als u wilt kalibreren de spectrale kenmerken van de microencapsulated SNARF-1, door een reeks van buffers met verschillende pH-waarden in het bereik ~ 6-9 te gebruiken. ~ 10 µL van een buffer op de gedroogde microcapsules met SNARF-1-dextran drop en bedek het met een dekglaasje aan.
   2. Plaats het glasplaatje in het werkgebied van de Microscoop. Zoek de microcapsules met behulp van een × 40 doelstelling.
   3. Zet de hendel van de Microscoop op de poort van de camera. Registreren hun fluorescentie met de spectrometer. Zet de hendel terug naar de oculairs.
      Opmerking: Zorg ervoor dat de spectrale signaal is tot ver buiten het achtergrondniveau, en zorgen dat de microcapsules in het gezichtsveld niet in een zeepbel (door over te schakelen naar een lagere vergroting indien nodig). Vermijd langdurige verlichting van de dezelfde microcapsules. SNARF-1 is gevoelig voor photobleaching.
   4. Herhaal stap 2.2.3 voor verschillende microcapsules 10 - 15 keer.
3. De ratio's van fluorescentie, piek (bijvoorbeeld met behulp van R of Scilab) voor alle geregistreerde spectra berekenen en bepalen van de regressielijn tussen de mediane verhouding (voor elke buffer) en middellange pH met behulp van de volgende formule:
   
   Opmerking: SNARF-1 heeft een spectrum met twee bergtoppen die overeenkomen met de emissie van de kleurstof geprotoneerd en ring, en de verhouding tussen de pieken is reageren op de pH van het medium. In deze studie, wordt de verhouding tussen de intensiteit van de fluorescentie van 605 en 660 nm gebruikt. Deze golflengten worden gekozen afhankelijk van het filter gebruikt. a en b zijn coëfficiënten te bepalen door middel van niet-lineaire regressie (bijvoorbeeld met behulp van R). Waarden 0,15 en 1.1 zijn, respectievelijk, de minimale en maximale waarden van ik₆₀₅/I₆₆₀ waargenomen tijdens de kalibratie.
4. Ongeveer 10 µL van vis bloed van ongeveer 5 volwassen dieren verzamelen. Plaats vissen in een petrischaal met 1 µL/mL water opschorting van kruidnagel olie voor anesthesie en wacht totdat het dier op zijn kant draait en reageert aan snuifjes van de fin (meestal ~ 2-3 min). Het overbrengen van de vis op een glasplaatje. De staart van de vis met een lancet afgesneden en verzamelen van ongeveer 2 µL van vis bloed uit de ader van de staart.
   Opmerking: Om te voorkomen dat de bloedstolling, behandelen de incisie met heparine (5000 U/mL) en gebruik van EDTA glazen capillairen en microcentrifuge buizen voor het verzamelen van het bloed.
   1. Ongeveer 10 µL van bloed met een pipet op het puntje van de micro-elektrode druppelen en bepaal de pH met behulp van een pH-meter.
   2. Drop het bloed op een dia met gedroogde microcapsules en registreren van de verhouding van de intensiteit van de fluorescentie zoals beschreven voor de kalibratie buffers (stappen 2.2-2.3).
5. Aanpassen van de lineaire coëfficiënt van de kalibratiekromme te maken van de curve dat overeenkomt met de metingen in het bloed van de vis (voor meer details zie Borvinskaya et al. 2017⁵).

3. voorbereiding voor injectie

1. Laat de stalen naald uit het topje van de insuline pen (of spuit) door het verwijderen van de kunststof met een scherpe lancet.
   Opmerking: Een dunne naald (Ø0.33 mm of minder) of glazen viscometerbuizen (meestal Ø1 mm) kan worden voorbereid voor microinjection^10,11.
2. Plaats de naald halverwege in het glas-microcapillary; snel en zachtjes soldeer met behulp van een gas fakkel.
3. De glazen microcapillary verbinden met de microinjector en het spoelen met steriel water drie keer. Ervoor zorgen dat de vloeistof door de naald stroomt.
4. Vul het systeem met gedestilleerd water.
   Opmerking: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het systeem.

4. injectie

1. Resuspendeer de bereid schorsing van microcapsules (in steriele 0.9% NaCl, of andere media gebruikt voor de injecties, met een concentratie van 0,5 tot 6 miljoen microcapsules per microliter) met behulp van het ultrasoonbad voor 1 min.
   Opmerking: Aangezien de microcapsules neigen te precipiteren, tijdens de volgende injectie, schud de flacon met de microcapsules mechanisch (met behulp van een rotor) of handmatig elke paar minuten resuspendeer hen en hun aggregatie wordt voorkomen.
2. Plaats de vis in een petrischaal met verdoving (0,1 mL/L van kruidnagel olie geschorst in water) voor ~ 2-3 min. wachten totdat de vis op zijn kant draait en reageert op een lichte snuifje van de fin.
3. Met behulp van een lepel, overbrengen van de vis uit de verdoving en breng dit voorzichtig op een vochtige spons in een laterale positie met het hoofd naar links (voor rechtshandige persoon) of naar rechts (voor linkshandige persoon).
4. Zuigen net vóór de inspuiting, 1-2 mm van lucht in de glazen capillaire verbonden met microinjector. Vervolgens laad het met ongeveer 2 µL van de verspreide microcapsules.
   Opmerking: Voordat de injectie, de microcapsule oplossing moet worden aangepast aan de temperatuur waarop de vis worden gehouden.
5. Zachtjes het stabiliseren van het lichaam van de vis op de spons met niet-dominante hand.
   1. De zijlijn van de vis te vinden. Mentaal Selecteer een segment dat zich uitstrekt van de operculum aan het einde van de buikholte. Het vinden van het midden van dit segment. Steek de naald 1 mm lager in de ventrale richting.
   2. Met een schraperig beweging, verplaatsen voorzichtig de vis schalen opzij, en maak een lekke band. Steek de naald in het lichaam in een hoek van 45° naar de tabel oppervlak.
   3. Duw de nld richting de wervelkolom totdat het zorgvuldig ertegen rust.
   4. Laat ongeveer 1 µL van de microcapsules schorsing in de nier en de naald langzaam te trekken.
      Opmerking: Om te zoeken naar de juiste punctie site gemakkelijker, het is handig om te oefenen het vinden van de kofferbak nier door het transilluminating van de vissen die met behulp van een licht van de bodem, zoals weergegeven in figuur 2A en 2B.
6. Spoel de vis van kop tot staart met een stroom van water om eventuele gemorste microcapsules op de injectieplaats.

5. in Vivo visualisatie

1. Gebruik de dissectie schaar te verwijderen van de gill-cover uit het hoofd van de vis en denude de kieuwen van de vis. Spoel de kieuwen met water.
2. Met behulp van een lepel, de vis naar een microscoopglaasje overbrengen, en plaats deze in het werkgebied van de fluorescente microscoop.
   Opmerking: Zorg ervoor dat de kieuwen van de vis niet tijdens opeenvolgende procedures doen uitdrogen. Om dit te vermijden, periodiek hen bevochtigen met water met behulp van een pipet van Pasteur (ongeveer elke 1-2 min).
3. De kamer donkerder en met behulp van lage vergroting (x 10 doelstelling) inspecteren de kieuwen om te vinden de fluorescerende microcapsules.
   Opmerking: Wanneer de procedure wordt gebruikt voor de invoering van sommige fluorescerende deeltjes in de bloedsomloop van de vis, is het aanbevolen om de kieuwen van verscheidene individuen voor onverwachte fluorescerende deeltjes vóór injecties inspecteren. Kieuwen van wild-type zebrafish hebben geen autofluorescence kunnen, maar in sommige gevallen sporadisch fluorescerende deeltjes (zoals voedsel stukken of eencellige symbionten) aanwezig op de kieuwen. Als nodig, deze deeltjes kunnen worden herkend op basis van hun specifieke vorm (bijvoorbeeld voedsel stukken hebben onregelmatige vorm, in tegenstelling tot de sferische microcapsules) of fluorescentie spectrum (bijvoorbeeld kleur).
   1. Overschakelen van de lens naar een hogere magnitude (× 40 doelstelling) en een microcapsule of een groep van microcapsules in het midden van het gezichtsveld plaats.
   2. Zet de hendel met de poort na een aangesloten spectrometer. Record de spectrale signaal.
   3. Zet de hendel terug naar het oculair.
   4. Herhaal de metingen voor verschillende microcapsules meerdere malen.
4. De vis overbrengen in het aquarium met goede beluchting voor herstel.
   Opmerking: Met minimale praktijk is het mogelijk om uit te voeren van de injectie en signaal opnemen met een geschatte snelheid van 2-3 min per vis. De meting kan worden herhaald voor een individuele meerdere malen met het gebruik van herhaalde lage, onschadelijk doses van verdoving of een andere methode van fixatie. Voor de lange termijn waarneming, een systeem met continu verdoving¹²te gebruiken.

Resultaten

De verkregen resultaten komen uit een van de drie belangrijkste categorieën van de gepresenteerde protocol: de vorming van fluorescerende microdeeltjes door inkapseling van een fluorescente kleurstof (Figuur 1), de nier injectie van microcapsules met verdere visualisatie in Gill haarvaten (Figuur 2 en 3) en, ten slotte, het in vivo spectrale opnemen van SNARF-1 fluorescentie te controler...

Discussie

We gebruikten om aan te tonen de injectie van microdeeltjes in de zebravis nier, semi-permeabel microcapsules geladen met een indicator kleurstof. Dus bevat het protocol instructies voor de fabricage van de microcapsules met behulp van de vergadering van de laag-voor-laag van tegengesteld geladen polyelectrolytes^{7,8,15,16,17 ,18}

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
SNARF-1-dextran, 70000 MW	Thermo Fisher Scientific	D3304	Fluorescente sonde. Elke andere geschikte polymeergebonden fluorescente kleurstof kan worden gebruikt als vulstof voor microcapsules
Albumine-fluoresceine isothiocyanate conjugaat (FITC-BSA)	SIGMA	A9771	Fluorescente sonde
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran)	SIGMA	R9379	Fluorescente sonde
Calciumchloride	SIGMA	C1016	CaCO3-sjablonenvorming
Natriumcarbonaat	SIGMA	S7795	CaCO3-sjablonenvorming
Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH)	SIGMA	283215	Katjonisch polymeer
Poly(natrium 4-styreensulfonaat), MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	Aanionisch polymeer
Poly-L-lysine [20 kDa] geënt met polyethyleenglycol [5 kDa], g = 3,0 tot 4,5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)	Laatste polymeer om de biocompatibiliteit van microcapsules te verhogen
Natriumchloride	SIGMA	S8776	Voor het oplossen van toegepaste polymeren
Waterzuiveringssysteem	Millipore	SIMSV0000	Voor het bereiden van gedeïoniseerd water
Magneetroerder	Stegler		Voor CaCO3-sjablonenvorming
Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL	Eppendorf		Doseringsoplossingen
Eppendorf Research plus pipette, 10 µL	Eppendorf		Doseringsoplossingen
Pipetpunten, volumebereik 200 tot 1000 µL	F.L. Medical	28093	Doseringsoplossingen
Pipetpunten, volumebereik 0,1-10 μL	Eppendorf	Z640069	Doseringsoplossingen
Mini-centrifuge Microspin 12, hoge snelheid	BioSan		Voor centrifugatie-wasprocedure van microcapsules
Microcentrifugebuisjes, 2 mL	Eppendorf	Z666513	Synthese en opslag van microcapsules
Shaker Intelli-mixer RM-1L	ELMY Ltd.		Om de aggregatie van microcapsules te verminderen
Ultrasoonreiniger			Om de aggregatie van microcapsules te verminderen
Hoofdtelefoons			Om de oren te beschermen tegen ultrageluid
Ethyleendiaminetetraazijnzuur	SIGMA	EDS	Om de CaCO3-sjablonen op te lossen
Mononatriumfosfaat	SIGMA	S9638	Bereiding van pH-buffers
Dinatriumfosfaat	SIGMA	S9390	Bereiding van pH-buffers
Natriumhydroxide	SIGMA	S8045	Om de pH van de EDTA-oplossing en buffers aan te passen
Thermostaatkamer			Om microcapsules op een glazen plaatje te drogen
Hemocytometer telkamer voor bloedcellen			Om de grootteverdeling en concentratie van de bereide microcapsules te onderzoeken
Fluorescente microscoop Mikmed 2	LOMO		In vivo visualisatie van microcapsules in visbloed
Set van fluorescente filters voor SNARF-1 (moet worden gekozen afhankelijk van het microscoopmodel; voorbeeld wordt gegeven)	Chroma	79010	Visualisatie van microcapsules met fluorescente sondes
Fiber spectrometer QE Pro	Ocean Optics		Calibratie van microcapsules onder microscoop
Optische vezel QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m	Ocean Optics		Om spectrometer met microscooppoort te verbinden
Collimator F280SMA-A	Thorlabs		Om spectrometer met microscooppoort te verbinden
Glaze microscoopplaatje	Fisherbrand	12-550-A3	Calibratie van microcapsules onder microscoop
Dekvlakken, 22 x 22 mm	Pearl	MS-SLIDCV	Calibratie van microcapsules onder microscoop
Glazen microcapillairen Intra MARK, 10 µL	Blaubrand	BR708709	Om visbloed te verzamelen
Kluuntjesolie	SIGMA	C8392	Visanesthesie
Lancet No 11	Apexmed international B.V.	P00588	Om de visstaart te snijden en de stalen naald los te maken van de punt van de insuline-auto-injector
Heparine, 5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	Voor het behandelen van alle oppervlakken die in contact komen met visbloed tijdens het verzamelen van visbloed
Seven 2 Go Pro pH-meter met micro-elektrode	Mettler Toledo		Om de pH van visbloed te bepalen
Insulinepennaalden Micro-Fine Plus, 0,25 x 5 mm	Becton, Dickinson and Company		Voor injectieprocedure. Elke dunne naald (Ø 0,33 mm of minder) is geschikt
Glazen capillairen, 1 x 75 mm	Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co	9201075	Voor injectieprocedure
Gasbrander			Om stalen naald aan glazen capillair te solderen
Microinjector IM-9B	NARISHIGE		Voor nauwkeurige dosering van microcapsules suspensie
Petrischalen, 60 mm x 15 mm, polystyreen	SIGMA	P5481	Voor manipulaties met vissen onder anesthesie
Kunststof lepel			Voor manipulaties met vissen onder anesthesie
Vochtige spons			Voor manipulaties met vissen onder anesthesie
Dissectie-schaar	Thermo Scientific	31212	Om de kieuwdeksel van het vishoofd te verwijderen
Pasteurpipet, 3,5 mL	BRAND	Z331767	Om vis