Methodenartikel

Generatie van menselijke nasale epitheliale cel spheroïden voor geïndividualiseerde Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator studie

DOI:

10.3791/57492

⸱

11 april 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een methode voor het genereren van driedimensionale sferoïde culturen van menselijke nasale epitheliale cellen. Spheroïden worden dan gestimuleerd naar station Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator (CFTR)-afhankelijk van de ion en vloeistof secretie, kwantificeren van de verandering in de sferoïde luminal grootte als een proxy voor CFTR-functie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terwijl de invoering van Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator (CFTR) modulator drugs heeft een revolutie teweeggebracht in zorg in Cystic Fibrosis (CF), heeft het genotype gerichte therapie model momenteel in gebruik verschillende beperkingen. Eerste, zeldzame of understudied mutatie groepen zijn uitgesloten van de definitieve klinische proeven. Bovendien, zoals extra modulator geneesmiddelen de markt betreden, het zal moeilijker geworden voor het optimaliseren van de modulator keuzes voor een individuele certificaathouder. Beide zaken worden behandeld met het gebruik van patiënt-afgeleid, geïndividualiseerde preklinische modelsystemen van CFTR-functie en modulatie. Menselijke nasale epitheliale cellen (HNEs) zijn een gemakkelijk toegankelijke bron van respiratoire weefsel voor een dergelijk model. Hierin beschrijven we de generatie van een driedimensionale sferoïde model van CFTR-functie en modulatie met behulp van primaire HNEs. HNEs zijn geïsoleerd van onderwerpen in een minimaal invasieve manier, uitgebreid in voorwaardelijke herprogrammering voorwaarden, en in de cultuur sferoïde agarvoedingsbodem. Binnen 2 weken na het zaaien, sferoïde culturen genereren HNE spheroïden die kunnen worden gestimuleerd met 3', 5'-cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP)-het genereren van agonisten CFTR-functie te activeren. Sferoïde zwelling is dan gekwantificeerd als een proxy voor CFTR-activiteit. HNE spheroïden kapitaliseren op de minimaal invasieve echter respiratoire oorsprong van nasale cellen voor het genereren van een toegankelijke, gepersonaliseerde model relevant zijn voor een epitheel die als gevolg van ziekte morbiditeit en mortaliteit. Vergeleken met de air-liquide interface HNE culturen, zijn spheroïden relatief snel te rijpen, die vermindert de totale verontreiniging tarief. In zijn huidige vorm, wordt het model beperkt door lage doorvoersnelheid, maar dit wordt gecompenseerd door het relatieve gemak van weefsel overname. HNE spheroïden kunnen worden gebruikt om betrouwbaar kwantificeren en karakteriseren CFTR activiteit op het individuele niveau. Een lopend onderzoek te binden deze kwantificering in vivo drug antwoord zal bepalen of HNE spheroïden een ware preklinische voorspeller van patiënt reactie op CFTR modulatie zijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cystic Fibrosis (CF) is een fatale, autosomaal recessieve ziekte die meer dan 70.000 mensen wereldwijd1. Deze leven-verkorting genetische ziekte wordt veroorzaakt door mutaties in de Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator eiwit (CFTR)2. CFTR is een lid van de familie van adenosinetrifosfaat-binding cassette, en functies als ionkanaal waardoor verkeer van chloride en bicarbonaat in de apicale membraan van meerdere gepolariseerde epitheel, met inbegrip van het maag-darmkanaal, zweetklier, en respiratoire tree, o.a.3,4. Als zodanig, leidt disfunctione....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HNE monsters werden verkregen onderwerpen aangeworven door de Cincinnati Children's Hospital Medical Center CF Research Center. Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Review Board (IRB) van Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Schriftelijke toestemming is verkregen uit alle onderwerpen vóór de test.

1. voorbereiding van de uitbreiding Media en antibiotica

  1. Verzamelen mediacomponenten vermeld in tabel 1. Ontdooien van bevroren materialen bij kamertemperatuur en maken noodzakelijk stamoplossingen zoals aangegeven in tabel 1 onder "Uitbreiding Media"....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HNEs moet hechten aan de cultuur-schotel en vormen eilandjes van cellen binnen 72 uur van zaaien; voorbeelden van goede en slechte eiland vorming op één week worden weergegeven in figuur 1A en 1B, respectievelijk. Deze eilanden moeten uitbreiden ter dekking van de schotel in de loop van 15-30 dagen. Kleine of suboptimaal monsters kunnen langer duren, en vaak levert niet veel nuttige spheroïden. Besmetting met infectieuze agentia wordt bewezen.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de generatie van patiënt-afgeleide nasale sferoïde celculturen kunnen produceren een geïndividualiseerde, specifieke model van CFTR-functie. Er zijn verscheidene belangrijke stappen in het proces dat moet nauw worden bijgewoond om te voorkomen dat problemen. Ten eerste is de verwerving van een goed voorbeeld uit de neus van de patiënt. Een goed voorbeeld moeten > 50.000 cellen, slijm/puin beperkt en worden klaar voor verwerking binnen 4 uur (hoewel succes ook gemakkelijk haalbaar met overnachting .......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door Cystic Fibrosis Stichting Therapeutics, nummer CLANCY14XX0 te verlenen en door middel van Cystic Fibrosis Stichting, verlenen nummer CLANCY15R0. De auteurs bedank Kristina Ray voor haar hulp bij de patiënt werving en regelgevend toezicht. De auteurs ook bedank de werkgroep HNE, ondersteund door de Cystic Fibrosis Stichting, die bijgestaan in de generatie van HNE cultuur mogelijkheden: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, G. Marty Solomon en Katherine Tuggle.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL Eppendorf TubeUSA Scientific 4036-3204
150 mL Filter FlaskMidsci TP99150Om Media te filteren
15 mL Conical TubeMidsci TP91015
1 L Filter FlaskMidsci TP99950Om Media te filteren
35 mm Glass-Bottom DishMatTek CorporationP35G-0-20-COptioneel
3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX)Fisher Scientific AC228420010 Bereid een 100 mM stamoplossing van 22,0 mg in 1 mL DMSO
50 mL Conical TubeMidsci  TP91050
AccutaseInnovative Cell Technologies, Inc.AT-104Celaflossingsoplossing
AdenineSigma-AldrichA2786-25GZie Tabel 1
Amphotericin BSigma-AldrichA9528-100MGZie Tabel 1
Bovine Brain Extract (9mg/mL)Lonza CC-4098Zie Tabel 2
Ceftazidime hydrateSigma-AldrichC3809-1GZie Tabel 1
Cell Scrapers 20 cm Midsci TP99010
CFTR Inh172Tocris Bioscience3430Bereid een 10 mM stamoplossing van 4,0 mg in 1 mL DMSO
Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae)Sigma-AldrichC8052-.5MGZie Tabel 1
CYB-1Medical Packaging CorporationCYB-1Cytologieborstel
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD5879-500ML
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes Life Technologies 11330-057Basismedium; Zie Tabellen 1 en 2
Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free)Thermo Fisher ScientificPHG6045Zie Tabel 1
EpinephrineSigma-AldrichE4250-1GZie Tabel 2
EthanolFisher Scientific 2701
EthanolamineSigma-AldrichE0135-500ML16,6 mM oplossing; Zie Tabel 2
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)TCI America E0084
Fetal Bovine Serum (high performance FBS)Invitrogen 10082147Zie Tabel 1
ForskolinSigma-AldrichF6886-50Bereid een 10 mM stamoplossing van 4,1 mg in 1 mL DMSO
Growth Factor-Reduced MatrigelCorning, Inc.356231Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL.
HemacytometerHausser Scientific1483
Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL)Advanced BioMatrix5007-ACollageenoplossing
HyClone (aka FetalClone II) GE Healthcare SH30066.03HIZie Tabel 2
HydrocortisoneStemCell Technologies07904Zie Tabellen 1 en 2
Insulin, human recombinant, zinc solutionLife Technologies 125850144 mg/mL oplossing; zie Tabel 2
IVF 4-Well Dish, Non-treatedNUNC (via Fisher Scientific)125663504-well plate voor sferoïden; vergelijkbare wellgrootte met een 24-well plate
MEF-CF1-IRRGlobalstemGSC-6001GBestraalde muis embryonale fibroblasten
Metamorph 7.7Molecular DevicesAnalysesoftware; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software voor een offerte
Olympus IX51 Inverted MicroscopeOlympus CorporationDiscontinuedBeeldvormende microscoop. Vervanging: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  voor een offerte
Pen StrepLife Technologies 15140122Zie Tabel 2
PhsophoryletheanolamineSigma-AldrichP0503-5GZie Tabel 2
Retinoic AcidSigma-AldrichR2625-50MGZie Tabel 2
RhinoprobeArlington Scientific, Inc.96-0905Nasale curette
Slidebook 5.53i, Intelligent Imaging InnovationsDiscontinuedBeeldvormende software. Vervanging: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook voor een offerte
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific20012050
Sterile WaterSigma-AldrichW3500-6X500ML
Tissue Culture Dish 100Techno Plastic Products93100Tissucuurschaal voor expansie
TobramycinSigma-AldrichT4014-100MGZie Tabel 1
Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL)Lonza CC-4205Zie Tabel 2
TriiodothryonineSigma-AldrichT6397-1G3,3',5-Triiodo-L-thyronine natriumzout  [T3]; Zie Tabel 2
Trypsin from Porcine PancreasSigma-AldrichT4799-10G
Ultroser-GCrescent Chemical (via Fisher Scientific)NC039302420 mL lyofilisaat poeder; Zie Tabel 2
Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalisSigma-AldrichV2002-5GZie Tabel 1
VX770Selleck ChemicalsS1144Bereid een 1 mM stamoplossing van 0,4 mg in 1 mL DMSO
VX809Selleck ChemicalsS1565Koop of bereid een 10 mM stamop

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
  2. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
  3. Anderson, M. P., et al.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Menselijke neusepitheelcellenCFTR functieonderzoekgeneratie van sfero denkwekenconditionele herprogrammeringsconditiescAMP genererende agonistensfero den zwellingstestincubatie in differentiatiemediumbasaalmembraanmatrixevaluatie met omgekeerde microscooptesten van CFTR modulatoren

Gerelateerde artikelen