Gebruik van twee dimensionale semi-denatureren wasmiddel Agarose gelelektroforese te bevestigen grootte heterogeniteit van amyloïde of Amyloid-achtige vezels

Summary

Hier gebruiken we de Elektroforese van het gel van de tweedimensionale semi-denatureren agarose bevestigen de aanwezigheid van amyloid-achtige vezels van heterogene grootte en uitsluiten van de mogelijkheid dat de heterogeniteit van grootte te wijten aan de dissociatie van de amyloïde vezels tijdens de gel is lopend proces.

Abstract

Amyloïde of amyloid-achtige vezels zijn geassocieerd met vele ziekten bij de mens, en zijn nu belangrijk voor vele signaalroutes wordt ontdekt. De mogelijkheid om de vorming van deze vezels onder verschillende experimentele omstandigheden gemakkelijk te detecteren is van essentieel belang voor het begrijpen van hun potentiële functie. Veel methoden zijn gebruikt voor het detecteren van de vezels, maar niet zonder nadelen. Elektronenmicroscopie (EM) of kleuring met Congo rood of Thioflavin T vaak wordt bijvoorbeeld vereist dat de zuivering van de vezels. Aan de andere kant, maakt semi-denatureren wasmiddel agarose gelelektroforese (SDD-leeftijd) de ontdekking van de SDS-resistente amyloid-achtige vezels in de cel extracten zonder zuivering. Bovendien, staat het de vergelijking van het verschil van de grootte van de vezels. Wat nog belangrijker is, kan het worden gebruikt om te identificeren specifieke proteïnen binnen de vezels door het westelijke bevlekken. Het is minder tijdrovend en meer gemakkelijk toegankelijk is voor een groter aantal labs. Resultaten van de SDD-leeftijd blijkt vaak variabele mate van heterogeniteit. Het doet de vraag rijzen of het deel van de heterogeniteit voortvloeit uit de dissociatie van het eiwit complex tijdens de elektroforese in aanwezigheid van SDS. Om deze reden hebben we een tweede dimensie van de SDD-leeftijd om te bepalen als de heterogeniteit van de grootte gezien in SDD-leeftijd echt een resultaat van vezel heterogeniteit in vivo en niet een gevolg van afbraak of dissociatie van een aantal van de eiwitten tijdens is dienst elektroforese. Met deze methode kunt snelle en kwalitatieve bevestiging dat de amyloïde of amyloid-achtige vezels niet gedeeltelijk tijdens het proces van de SDD-leeftijd distantieert zijn.

Introduction

De vorming van amyloïde vezels te wijten aan het eiwit misfolding is al lang bekend een rol te spelen in de pathologische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington¹. Meer recentelijk, de vorming van amyloïde of amyloid-achtige vezels is gebleken om een deel van signaalroutes bij de mens, met inbegrip van tijdens anti-virale ingeboren immune reactie² en necroptosis^3,4, en in lagere organismen zoals gist^5,6. De mogelijkheid om op te sporen van deze vezels i....

Protocol

1. voorbereiding van de monsters

1. Cultuur 2 x 10⁶ amyloid HT-29 dikke darm kankercellen in een schaal 10-cm weefselkweek in 10 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 10% foetale runderserum en penicilline-streptomycine produceren. Cultuur cellen overnachting in een incubator 37 ° C met 5% CO₂.
   1. Nadat de cellen tot 80% confluentie groeien, wassen de cellen met 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 3 mL trypsine oplossing en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten.
   2. Nadat de cellen volledig gedissocieerde uit de schotel zijn, voeg toe 10 mL gestolde voedingsbodem en de cellen met een pipet 10 mL ove....

Results

Na necroptosis inductie bleek RIPK1 en RIPK3 bijna identiek amyloid-achtige patronen (rijstroken 2 en 4, Figuur 1). Meer heterogene waren echter MLKL vezels en leek te zijn kleiner dan RIPK1/RIPK3 vezels (lane 6, Figuur 1). Dat gevraagd ons de 2D SDD-leeftijd-methode om de mogelijkheid MLKL vormt RIPK1/RIPK3-onafhankelijke vezels of MLKL gewoon distantieert van de grote RIPK1/RIPK3/MLKL-vezels tijdens SDD-leeftijd te ontwikkelen........

Discussion

De meest kritische aspect van de 2D SDD-leeftijd is dat de voorwaarden van de elektroforese hetzelfde voor de eerste en tweede dimensie zijn. De capaciteit om te ontdekken een scherpe diagonale lijn van 45 ° (hetgeen aangeeft dat geen dissociatie of aantasting heeft plaatsgevonden) hangt af van de vezels die migreren op identieke wijze tijdens beide electrophoreses. Met behulp van verschillende omstandigheden, bijvoorbeeld het wijzigen van de spanning of de lengte van de runtime zal het verdoezelen van deze resultaten. O.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
gel electrophoresis unit	Fisher	HE99XPRO	appratus for gel running.
agrose	VWR	97062-250	For agarose gel.
paper tower	Fisher	19-120-2484	for transfering
filter paper	VWR	21427-386	for transfering
PVDF membrane	Bio-Rad	162-0177	for transfering
blocking milk powder	Bio-Rad	1706404XTU	for blocking in Western blot
MLKL antibody	Genetex	GTX107538	rabbit anti-MLKL antibody
RIPK1 antibody	BD Biosciences	610459	mouse anti-RIPK1 antibody
RIPK3 antibody	gift from Dr. Xiaodong Wang		rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.
anti-Rabbit-HRP	Sigma	A6154	secondary antibody
ECL	Fisher	WBKLS0500	Western chemiluminescent HRP substrate
X-ray film	Fisher	F-BX810	for Western blot result
DMEM	Sigma	D6429	for cell culture
fetal bovine serum	Sigma	F4135	for cell culture
penicilin-streptomycin	Sigma	P4333	for cell culture
Trypsin solution	Sigma	T4049	for cell culture
PBS for tissue culture	Sigma	D8662	for cell culture
recombinant TNF	made in our lab		for inducing necroptosis. See reference 11.
smac-mimetic	gift from Dr. Xiaodong Wang		for inducing necroptosis. See reference 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	for inducing necroptosis. See reference 11.
Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Model TC20; for counting cells
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	for measuring protein concentration in cell lysates
Cell lifter	Fisher	07-200-364	to remove cells from dish
Lysis Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired)
10X TAE (1 L)			48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L
4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O
TBS Transfer Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O
PBST Wash Buffer (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L