Gebruik van twee dimensionale semi-denatureren wasmiddel Agarose gelelektroforese te bevestigen grootte heterogeniteit van amyloïde of Amyloid-achtige vezels

Samenvatting

Hier gebruiken we de Elektroforese van het gel van de tweedimensionale semi-denatureren agarose bevestigen de aanwezigheid van amyloid-achtige vezels van heterogene grootte en uitsluiten van de mogelijkheid dat de heterogeniteit van grootte te wijten aan de dissociatie van de amyloïde vezels tijdens de gel is lopend proces.

Samenvatting

Amyloïde of amyloid-achtige vezels zijn geassocieerd met vele ziekten bij de mens, en zijn nu belangrijk voor vele signaalroutes wordt ontdekt. De mogelijkheid om de vorming van deze vezels onder verschillende experimentele omstandigheden gemakkelijk te detecteren is van essentieel belang voor het begrijpen van hun potentiële functie. Veel methoden zijn gebruikt voor het detecteren van de vezels, maar niet zonder nadelen. Elektronenmicroscopie (EM) of kleuring met Congo rood of Thioflavin T vaak wordt bijvoorbeeld vereist dat de zuivering van de vezels. Aan de andere kant, maakt semi-denatureren wasmiddel agarose gelelektroforese (SDD-leeftijd) de ontdekking van de SDS-resistente amyloid-achtige vezels in de cel extracten zonder zuivering. Bovendien, staat het de vergelijking van het verschil van de grootte van de vezels. Wat nog belangrijker is, kan het worden gebruikt om te identificeren specifieke proteïnen binnen de vezels door het westelijke bevlekken. Het is minder tijdrovend en meer gemakkelijk toegankelijk is voor een groter aantal labs. Resultaten van de SDD-leeftijd blijkt vaak variabele mate van heterogeniteit. Het doet de vraag rijzen of het deel van de heterogeniteit voortvloeit uit de dissociatie van het eiwit complex tijdens de elektroforese in aanwezigheid van SDS. Om deze reden hebben we een tweede dimensie van de SDD-leeftijd om te bepalen als de heterogeniteit van de grootte gezien in SDD-leeftijd echt een resultaat van vezel heterogeniteit in vivo en niet een gevolg van afbraak of dissociatie van een aantal van de eiwitten tijdens is dienst elektroforese. Met deze methode kunt snelle en kwalitatieve bevestiging dat de amyloïde of amyloid-achtige vezels niet gedeeltelijk tijdens het proces van de SDD-leeftijd distantieert zijn.

Inleiding

De vorming van amyloïde vezels te wijten aan het eiwit misfolding is al lang bekend een rol te spelen in de pathologische aandoeningen zoals de ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington¹. Meer recentelijk, de vorming van amyloïde of amyloid-achtige vezels is gebleken om een deel van signaalroutes bij de mens, met inbegrip van tijdens anti-virale ingeboren immune reactie² en necroptosis^3,4, en in lagere organismen zoals gist^5,6. De mogelijkheid om op te sporen van deze vezels in het lab is daarom belangrijk. Momenteel zijn er drie belangrijke manieren om amyloid en amyloid-achtige vezels te detecteren: het gebruik van kleurstoffen, EM en SDD-leeftijd.

Het gebruik van kleurstoffen, zoals Congo rood of Thioflavin T, biedt het voordeel dat ze snel en gemakkelijk aantoonbaar met behulp van microscopie of spectroscopie⁷. Detectie door microscopie, in het geval van Congo rood, biedt echter geen specificiteit waarover eiwitten bestaan uit de vezels, of de grootte van de vezels. Ook biedt het gebruik van de spectroscopie te detecteren Congo rood of Thioflavin T binding aan eiwitcomplexen alleen een positief of negatief resultaat.

EM biedt sluitend bewijs van de aanwezigheid van vezels en ook kwantitatieve informatie over de vezel lengte en diameter⁸. Deze methode vereist echter zeer strenge zuivering. Bovendien, is EM een gespecialiseerde techniek die gebruik maakt van dure apparatuur.

SDD-leeftijd is gebruikt voor het detecteren van SDS-resistente mega Dalton eiwitcomplexen met inbegrip van amyloïde of amyloid-achtige vezels. Het biedt vele voordelen. Ten eerste, het is niet vereist voor de zuivering van de vezels en is gemakkelijk te peform⁹. Ten tweede, het biedt kwalitatieve informatie over de grootte van de vezels, met inbegrip van de relatieve grootte en hoeveelheid van de vezel heterogenicity. Ten slotte, omdat het westelijke bevlekken kan worden uitgevoerd na elektroforese, het is gemakkelijk om het detecteren van de aanwezigheid van een eiwit waarvoor er een antilichaam is, hoewel hierbij moet worden opgemerkt dat omdat SDD-leeftijd semi-denatureren is, sommige epitopes verborgen die blijven kunnen compliceert detectie door antilichaam.

Onlangs, receptor interactie proteïne kinase 1 (RIPK1) en 3 (RIPK3) gemeld aan formulier amyloïde vezels om te dienen als signalering platformen tijdens necroptosis, een geprogrammeerde vorm van necrose³. Terwijl het bestuderen van deze vezels, toonde ons lab dat een ander necroptosis-geassocieerde proteïne, gemengde afkomst kinase domein-achtige (MLKL), ook amyloid-achtige vezels⁴gevormd. Echter, bij onderzoek met de SDD-leeftijd, de grootte van de vezels MLKL verscheen onderscheiden van de RIPK1 en RIPK3 vezels, die leek identiek aan elkaar (Figuur 1). Dit was onverwacht omdat het is bekend dat MLKL aan RIPK1/RIPK3 bindt om te vormen de necroptosis signalering complex genaamd de necrosome¹⁰.

Er zijn ten minste twee verklaringen. Ten eerste, twee totaal verschillende amyloid-achtige vezels kunnen vormen tijdens de necroptosis, een met RIPK1/RIPK3 en de andere met MLKL. Ten tweede, is slechts één type van amyloid-achtige vezels die met RIPK1/RIPK3/MLKL kan worden gevormd tijdens de necroptosis, maar de associatie van MLKL met de andere eiwitten zwak genoeg dat het distantieert tijdens SDD-leeftijd.

Om aan te pakken dit, stellen wij voor het uitvoeren van een tweedimensionale (2D) SDD-leeftijd. SDD-leeftijd-stable amyloid of amyloid-achtige vezels zal hetzelfde patroon migratie hebben tijdens de eerste en de tweede dimensie elektroforese. Dit is aantoonbaar zijn na overdracht van de eiwitten naar een membraan en het uitvoeren van een westelijke vlek. Stabiele vezels zal een scherpe diagonaal patroon vertonen. Elke afwijking hiervan zou suggereren dat de vezels ondergaan veranderingen als gevolg van de SDS-elektroforese.

Protocol

1. voorbereiding van de monsters

1. Cultuur 2 x 10⁶ amyloid HT-29 dikke darm kankercellen in een schaal 10-cm weefselkweek in 10 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 10% foetale runderserum en penicilline-streptomycine produceren. Cultuur cellen overnachting in een incubator 37 ° C met 5% CO₂.
   1. Nadat de cellen tot 80% confluentie groeien, wassen de cellen met 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 3 mL trypsine oplossing en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten.
   2. Nadat de cellen volledig gedissocieerde uit de schotel zijn, voeg toe 10 mL gestolde voedingsbodem en de cellen met een pipet 10 mL overbrengen in een conische buis 15 mL. Centrifugeer de cellen bij 1.000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Het medium gecombineerd, resuspendeer de cellen in 5 mL gestolde voedingsbodem en met behulp van een cel counter cellen tellen. Plaat 2 x 10⁶ cellen in elk van de twee 10-cm schotels.
   3. De cellen te houden en te herstellen 's nachts in een incubator 37 ° C met 5% CO₂toestaan. Behandeling toepassen op een schotel voor het opwekken van de vorming van amyloids met 20 ng/mL Tumornecrosefactor-alfa (TNF-α), 100 nM Smac-mimetische en 20 µM pan-caspase-remmer Z-VAD-FMK¹¹. De combinatie wordt afgekort als TSZ. Behandelen de andere schotel met voertuig als een besturingselement.
2. Na de juiste lengte van de tijd, meestal 6 h, oogsten de cel lysate.
   1. Schraap de cellen uit de plaat met een kunststof schraper en een 10-mL pipet gebruiken om te zetten in een conische buis 15 mL. Centrifugeer de cellen bij 1.000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C.
   2. De cellen 2 keer wassen door resuspending in 10 mL ijs koud PBS en centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C. De PBS-oplossing gecombineerd.
      Opmerking: Het proces kan hier onderbroken worden door bevriezing van de cel pellet in vloeibare stikstof en slaan op ˗80 ° C voor maximaal 1 maand.
   3. De cel pellet overbrengen naar een 1.5-mL microcentrifuge buis en incubeer in 0.3 mL lysisbuffermengsel gedurende 30 minuten op het ijs. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. De bovendrijvende substantie is de hele cel lysate.
      Opmerking: Het proces kan hier onderbroken worden door op te slaan van het monster bij-20 ° C voor tot enkele maanden.
   4. De eiwitconcentratie meten door een analyse van Bradford volgens protocol van de fabrikant. Voeg 4 x SDD-leeftijd laden buffer te bereiden 20 µL van 3 µg/µL monster en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.

2. opstellen en uitvoeren van Gels

1. Voeg 2 g agarose tot 200 mL voor 1 x Tris-acetaat buffer (TAE) in een bekerglas van glas en warmte in een magnetron te smelten de agarose. Voeg 1 mL 20% SDS voor een uiteindelijke concentratie van 0,1% SDS. Swirl zorgvuldig te mengen. Wees voorzichtig niet te bellen na de toevoeging van de SDS genereren.
2. Giet de agarose-oplossing in een gel-plaat van 15 cm x 14 cm. Gebruik een 1 mL pipet te elimineren alle bubbels. Plaats een 20-well kam boven.
3. Eerste dimensie: Pipetteer 60 µg van hele cel lysate in de extreem-rechtse rijstrook. Uitvoeren van de gel op 60 V voor ongeveer 4 h (totdat de kleurstof voorzijde ongeveer ¾ door de gel is) met behulp van de TAE met 0,1% SDS als de lopende buffer.
4. Tweede dimensie: zorgvuldig draaien de gel 90° linksom(Figuur 2). Stel de gel op 60 V voor ongeveer 4 uur.
   Opmerking: De algemene lopende voorwaarde is 4 V/cm gel lengte. Het is belangrijk dat de lopende voorwaarden precies hetzelfde voor de eerste en tweede dimensie zijn.

3. overdracht

1. Gebruik de capillaire overdrachtmethode om de eiwitten overbrengen in een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan (Figuur 2B).
   1. Voeg 500 mL buffer van de overdracht aan een ongeveer 20 x 20 cm container. Het maken van een 5-cm hoge stapel papieren handdoeken naast de container. De oppervlakte van de bovenkant van de stack moet groter zijn dan de afmetingen van de gel.
   2. Doordrenk een filtreerpapier 14 x 15 cm in overdracht buffer en plaats boven aan de stapel papier handdoek. Zorg om te plaatsen op het papier met geen rimpels of bellen. Herhaal met een ander stuk filtreerpapier.
   3. Activeren van een membraan PVDF 14 x 15 cm in methanol voor 30 s laag dan het op het filtreerpapier verzorgen met een roller te verwijderen alle bubbels. Spoel de gel af met overdracht buffer en het laag op de top van het membraan, opnieuw uitrollen van alle bubbels.
   4. Betrekking hebben op de rand van het dichtst bij de container van overdracht buffer met plastic wrap keukenpapier. Het is belangrijk dat de papieren brug gebouwd in de volgende stap niet in direct contact met de stapel papier handdoek komt.
   5. Geniet van een stuk van 15 x 35 cm filtreerpapier in overdracht buffer en plaats het zodat één uiteinde de bovenkant van de gel bestrijkt en het andere uiteinde in de container van overdracht buffer. Herhaal met een andere brug.
   6. Bedek de container met plastic wrap en laat 's nachts bij kamertemperatuur.

4. westelijke bevlekken detectie

1. Spoel het membraan met 50 mL PBS met 0,05% Tween-20 (PBST) in een container van 20 cm × 20 cm. Voeg 20 mL 5% melk in PBST. Rock bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om te blokkeren.
2. Pipetteer 10 µL konijn anti-MLKL antistof in 20 mL 5% melk in PBST en toevoegen aan de container. Incubeer op rocker's nachts bij 4 ° C.
3. Het membraan in 20 mL PBST voor 5 min. Herhaal 5 keer wassen.
4. Pipetteer 4 µL van anti-rabbit-HRP tot 20 mL 5% melk in PBST en toevoegen aan de container. Incubeer op rocker bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
5. Het membraan in 20 mL PBST voor 5 min. Herhaal 5 keer wassen.
6. Verbeterde Chemiluminescentie substraat (ECL) toevoegen en blootstellen aan X-ray films volgens protocol van de fabrikant.

Resultaten

Na necroptosis inductie bleek RIPK1 en RIPK3 bijna identiek amyloid-achtige patronen (rijstroken 2 en 4, Figuur 1). Meer heterogene waren echter MLKL vezels en leek te zijn kleiner dan RIPK1/RIPK3 vezels (lane 6, Figuur 1). Dat gevraagd ons de 2D SDD-leeftijd-methode om de mogelijkheid MLKL vormt RIPK1/RIPK3-onafhankelijke vezels of MLKL gewoon distantieert van de grote RIPK1/RIPK3/MLKL-vezels tijdens SDD-leeftijd te ontwikkelen....

Discussie

De meest kritische aspect van de 2D SDD-leeftijd is dat de voorwaarden van de elektroforese hetzelfde voor de eerste en tweede dimensie zijn. De capaciteit om te ontdekken een scherpe diagonale lijn van 45 ° (hetgeen aangeeft dat geen dissociatie of aantasting heeft plaatsgevonden) hangt af van de vezels die migreren op identieke wijze tijdens beide electrophoreses. Met behulp van verschillende omstandigheden, bijvoorbeeld het wijzigen van de spanning of de lengte van de runtime zal het verdoezelen van deze resultaten. O...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
gelelektroforese-eenheid	Fisher	HE99XPRO	apparaten voor gel uitvoering.
agrose	VWR	97062-250	Voor agarosegel.
papieren toren	Fisher	19-120-2484	voor overdracht
filterpapier	VWR	21427-386	voor overdracht
PVDF-membraan	Bio-Rad	162-0177	voor overdracht
blokkerende melkpoeder	Bio-Rad	1706404XTU	voor blokkering in Western blot
MLKL-antilichaam	Genetex	GTX107538	konijn anti-MLKL-antilichaam
RIPK1-antilichaam	BD Biosciences	610459	muis anti-RIPK1-antilichaam
RIPK3-antilichaam	geschenk van Dr. Xiaodong Wang		konijn anti-RIPK3. Zie referentie 11.
anti-Konijn-HRP	Sigma	A6154	secundair antilichaam
ECL	Fisher	WBKLS0500	Western chemiluminescent HRP-substraat
X-ray film	Fisher	F-BX810	voor Western blot-resultaat
DMEM	Sigma	D6429	voor celkweek
foetaal bovien serum	Sigma	F4135	voor celkweek
penicilline-streptomycine	Sigma	P4333	voor celkweek
Trypsinoplossing	Sigma	T4049	voor celkweek
PBS voor weefselkweek	Sigma	D8662	voor celkweek
recombinant TNF	gemaakt in ons lab		voor het induceren van necroptose. Zie referentie 11.
smac-mimetiek	geschenk van Dr. Xiaodong Wang		voor het induceren van necroptose. Zie referentie 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	voor het induceren van necroptose. Zie referentie 11.
Cell Counter	Bio-Rad	1450102	Model TC20; voor het tellen van cellen
Pierce™ BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	voor het meten van eiwitconcentratie in cellysaten
Cell lifter	Fisher	07-200-364	om cellen uit het schaaltje te verwijderen
Lysis Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease en fosfaatremmers naar wens)
10X TAE (1 L)			48,4 g Tris-base 11,42 mL ijzerazijnzuur 20 mL 0,5M EDTA pH 8 ddH20 tot 1 L
4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)			5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0,5 mL 10% broomfenolblauw 31 mL ddH2O
TBS Transfer Buffer (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O
PBST Wash Buffer (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20
10X PBS (10 L)			800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 voeg ddH2O toe tot 10 L