Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Retroductal Nanoparticle injectie aan de lymfkliertest submandibulaire klier

10.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57521

⸱

3 mei 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, University of Rochester Medical Center, 3Center for Oral Biology, University of Rochester Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

Lokale drug levering aan de submandibulaire klieren is van belang in begrip speekselklier biologie en voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën. We presenteren een bijgewerkte en gedetailleerde retroductal injectie protocol, ter verbetering van de nauwkeurigheid van de levering en experimentele reproduceerbaarheid. De hier vermelde toepassing is de levering van polymere nanodeeltjes.

Samenvatting

Twee gemeenschappelijke doelen van speekselklier therapeutics zijn preventie en behandeling van weefsel disfunctie na een auto-immune of straling schade. Door lokaal leveren bioactieve stoffen aan de speekselklieren, kunnen grotere concentraties van weefsel veilig worden bereikt versus systemische toediening. Bovendien, uit doelweefsel effecten van extra klierweefsel accumulatie van materiaal drastisch kunnen worden verminderd. In dit verband is retroductal injectie een veel gebruikte methode voor het onderzoeken van zowel de speekselklier biologie en de pathofysiologie. Retroductal beheer van groeifactoren, primaire cellen, adenovirale vectoren en kleine molecuul drugs heeft aangetoond dat klier functie ondersteund bij het vaststellen van letsel. Wij hebben eerder de werkzaamheid van een retroductally geïnjecteerd nanoparticle-siRNA strategie te handhaven klier functie na bestraling getoond. Hier, een zeer effectieve en reproduceerbare methode voor het beheren van nanomaterialen aan de lymfkliertest submandibulaire klier door Wharton de koker is gedetailleerd (Figuur 1). We beschrijven toegang tot de mondholte en een overzicht van de noodzakelijke stappen voor het cannulate Wharton de koker, met verdere opmerkingen bijeenkomen kwaliteitscontroles gedurende de hele procedure.

Inleiding

Speekselklier dysfunctie heeft vele etiologie, met inbegrip van het Sjögren-syndroom, een auto-immuun gemedieerde verlies van functionele secretoire weefsel en straling geïnduceerde hyposalivation (RIH), een gemeenschappelijke sequella van hoofd en nek kanker radiotherapie1. Verlies van speeksel functie als gevolg van beide voorwaarden predisposes personen aan mondelinge en systemische infectie, tandbederf, spijsvertering en slikken dysfunctie, bijzondere waardevermindering van meningsuiting en depressie1,2,3. Dientengevolge lijdt levenskwaliteit aanzienlijk, met interventies beperkt tot palliatie van symptomen in plaats van genezen4. Voor het onderzoek naar nieuwe therapieën in vivo, is het van belang voor het beheer van biologische actieve stoffen rechtstreeks naar de speekselklier.

Retroductal injectie is een waardevolle methode om biologische actieve stoffen leveren rechtstreeks aan de speekselklieren en testen van de werkzaamheid in ziekte, letsel of onder normale weefsel homeostase. De drie grote speekselklieren zijn de oorspeekselklier (PG), de submandibulaire (SMG) en de sublinguaal (SLG), alle van welke lege in de mondholte via uitscheidingsmechanisme leidingen. De anatomie van de RattenUitrustingen SMG toelaat rechtstreekse toegang via de cannulation van de Wharton duct, gelegen in de vloer van de mond onder de tong5. Na de cannulation, de solvated drugs kan rechtstreeks aan de SMG worden toegediend. Na retroductal de levering, extra klierweefsel diffusie wordt beperkt door de omliggende weefsel capsule die de uitwisseling van materiaal regelt met omringende structuren6. De SMG zijn koker ook bij de mens zijn gestructureerd en routinematig tijdens SMG chirurgie en parotitis7worden benaderd. Bij mensen en muizen is de PG eveneens toegankelijk via Stensen de buis in de buccale mucosa-8.

In lymfkliertest modellen van RIH, is SMG retroductal injectie gebruikt voor het leveren van therapeutics met inbegrip van groeifactoren, primaire cellen adenovirale vectoren, cytokines en antioxidant verbindingen te moduleren van de cellulaire reactie op schade en de daaruit voortvloeiende te verminderen weefsel schade5,9,10,11,12,13,14,15,16. Het meest opvallende klinische succes van retroductal injectie is het beheer van adenovirale vector naar directe uitdrukking van een water-kanaal (Aquaporin-1; AQP1) bij patiënten na de straling voor hoofd en nek kanker17.

Eerder, hebben we ontwikkeld en de werkzaamheid van een retroductally geïnjecteerd polymere nanoparticle-siRNA systeem ter bescherming van speekselklier functie van RIH11,18,19,20komt te staan. Als een verlengstuk van ons afgelopen werk, hier, tonen wij ons protocol voor retroductal SMG injectie met behulp van een fluorescently geëtiketteerde nanoparticle (NP) kan laden en leveren anders slecht oplosbare drugs21,22, 23.

We hebben gesynthetiseerd de NP uit een copolymeer van de diblock bestaat uit poly (styreen-alt-maleïnezuuranhydride anhydride)-b-poly(styrene) (PSMA) via de omkeerbare toevoeging keten fragmentatie (vlot) polymerisatie, zoals eerder beschreven21. Door middel van de uitwisseling van het oplosmiddel monteren deze polymeren spontaan zelf in micel NP structuren met een hydrofobe interieur en hydrofiele exterieur21. De NPs worden aangeduid met Texas-rood fluorophore wilt toestaan de verificatie van NP levering in de klieren zonder dat het dier offeren. Live dieren imaging en SMG immunohistochemistry wordt weergegeven na 1 uur en 1 dag na de injectie.

Dit bijgewerkt en reproduceerbaar cannulation protocol mogelijk moet maken dat anderen te bereiken retroductal injectie. We verwachten dat deze verfijnde techniek cruciaal voor in vivo studies en therapeutische ontwikkeling24,25 worden zal.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle in vivo procedures zoals hieronder beschreven werden goedgekeurd door het Comité van de Universiteit voor dier middelen aan de University of Rochester, Rochester, NY.

1. voorbereiding

  1. 32G intracraniële katheter buis met draad inzet, gesneden 3 cm van de buis om te vormen van een schuine einde, ongeveer 45° op de lengteas. Bevestigen dat de draad ten minste 1 cm langer dan de slang is.
  2. Laden 50 µL van PSMA nanoparticle oplossing (Figuur 1) of ander materiaal dat injectie, in een injectiespuit Hamilton. Verklein de kans op barotrauma tijdens de injectie en hechten de katheter buis, met de stilet verwijderd, naar de spuit en verdrijf dood volume.
  3. Inspecteer de injectie oplossing om ervoor te zorgen dat de nanoparticle is volledig solvated om te voorkomen dat ductaal obstructie na de toediening.
  4. Bereid atropine-oplossing 0,1 mg/ml.
    Opmerking: Omdat atropine lichtgevoelig is en na verloop van tijd degradeert, deze oplossing moet worden gemaakt van de dag van de injectie en beschermd tegen licht tot toegediend.

2. toegang tot en het visualiseren van ductaal ingangspunt

  1. Weeg C57/BL6 muizen met behulp van een analytische balans.
  2. Met een 0,5 mL injectiespuit met 29G x ½" naald, anesthetize muizen met een intraperitoneally geïnjecteerd steriele zoutoplossing van 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine. Ga naar de volgende stap wanneer de muis niet meer reageert op prikkels, die in het algemeen optreedt binnen 5 tot 10 minuten na de injectie.
    Opmerking: Deze procedure kan ook worden uitgevoerd onder Isofluraan, maar vergt een aangepaste neus kegel die toegang tot de mondholte biedt.
  3. Om te voorkomen dat droogte tijdens de procedure, smeermiddel van toepassing voor de ogen en plaatst u de muisaanwijzer in een liggend op een aangepaste podium.
    Opmerking: Als u wilt behouden van passende voorwaarden voor intra-orale procedure, hulpmiddelen moeten worden ontsmet of gesteriliseerd vóór elk gebruik.
  4. Open de mondholte door het veiligstellen van de maxillaire snijtanden over een metalen balk en gebruiken van een elastische band om te passen neerwaartse spanning achter de mandibulaire snijtanden (figuur 2A).
  5. De muis onder de ontleden Microscoop uitlijnen zodat de onderkant van de kaak is gevisualiseerd.
  6. Om het verbreden van de mond, gebruiken een aangepaste, gebogen stalen oprolmechanisme spanning bilateraal om de buccale mucosa.
  7. Om te visualiseren de submandibulaire papillen, pak en zachtjes tillen de tong van de verdieping van de mond met behulp van botte pincet.
    Opmerking: De papillen wordt weergegeven als twee bleke uitsteeksels onder de tong (figuur 2B).
  8. Plaatsen om te verlichten de visualisatie en de verdere manipulatie in de mondholte, katoen tussen de tong en de buccale mucosa.

3. ductaal Cannulation en plaatsing van de lijn

  1. Met fijne, begrijpen gekromde pincet, katheter buis met het verzonken vlak van de draad. Uitlijnen voor optimale Handbediening tijdens cannulation, de slang met de kromming van de verlostang (figuur 3A).
  2. Met behulp van de Microscoop ontleden, verplaats de pincet en draad in het gezichtsveld.
    Opmerking: De draad moet worden uitsteken van de buis.
  3. Zachtjes druk uitoefenen in de basis van één submandibulaire Papil met behulp van de draad inzet voor de productie van een kleine, oppervlakkige, mucosal lekke band (0.076 mm doorsnede) die latere vermelding van de katheter buis (0,25 mm doorsnede vergemakkelijken zal). Als er resistentie is opgetreden, snijd u verse schuine tips over zowel de buizen en de inzet van de draad met een scherpe ontleden schaar.
  4. Na de post, trekken de stilet en de aanwezigheid van speeksel op de site van de punctie met behulp van de Microscoop ontleden, bevestigen. Vermijd krachtige of plotselinge verplaatsing (intrekking of invoegpositie) van de stilet die kan bloeden of ductaal integriteit in gevaar brengen.
  5. Intrekken van de stilet binnen de buis (figuur 3B).
  6. Om ervoor te zorgen dat injectie leidingen zal passen in de Wharton buis openen, invoegen buizen met de stilet als een rigide gids in het eerder gemaakte lek (Figuur 2 C).
    Opmerking: Als niet snel uitgevoerd, lokale zwelling kan voorkomen dat opnieuw invoegen.
  7. Om te voorkomen dat de tegendruk van langdurige ductaal obstructie, door de buis te trekken. Inspecteren om te controleren dat er een opening, zichtbaar onder microscopie, kan worden gezien in de submandibulaire Papil. Als zichtbaar bloeden optreedt, verwijdert u de pistolen en probeer te brengen vanaf stap 3.2 op de tegengestelde submandibulaire papillen.
  8. Beheren zonder de muis te bewegen, intraperitoneale injectie van 1 mg/kg atropine oplossing, voor het verminderen van de speekselvloed tijdens de procedure. Wacht 5-10 min.
  9. Pak het eind van de slang van de spuit, en invoegen in de opening met behulp van de ontleden Microscoop (Figuur 3 c). Als weerstand wordt aangetroffen, snijdt u een verse schuine einde aan de buis en reattempt.
  10. Zodra de slang binnen de submandibulaire Papil is, langzaam verder 3-5 mm in de buis. Laat de slang van de verlostang.
  11. Ter verbetering van de afdichting tussen de slang en de submandibulaire papil, drogen de interface door zachtjes bevlekken met gaas voor 1 min.
  12. Inspecteren om te bevestigen dat de positie van de buis niet tijdens het drogen is verschoven.

4. injectie

  1. Injecteren van materiaal met een snelheid van 10 µL/min. inspecteren om te bevestigen dat de muis ingetogen blijft en geen tekenen van nood (figuur 2D vertoont).
    Opmerking: Injecties van 15-50 µL worden goed verdragen. Injectie van grotere volumes kan leiden tot barotrauma.
  2. Na de injectie, spuit druk voor 5 min om de bewaring van materiaal binnen de Wharton buis en SMG (Figuur 4) te blijven. Inspecteer de submandibulaire papilla periodiek om ervoor te zorgen dat de buizen niet de ductaal opening heeft verlaten.
  3. Met behulp van fijne pincet, pak en zachtjes trekken de slang uit de submandibulaire papillen.
    Opmerking: Het is normaal om te observeren wat vloeistof uitgang van de papillen.
  4. Het oprolmechanisme en katoen uit de mondholte alvorens de muis uit het werkgebied verwijderen.
    Opmerking: Het dier mag niet worden overgelaten zonder toezicht totdat het voldoende bewustzijn te handhaven sternale lighouding heeft herwonnen. Bovendien zorgen dat de muis niet is ondergebracht bij andere muizen tot volledig hersteld.

5. onderzoek en analyse

Opmerking: Een in vivo Imaging systeem (IVIS) kan worden gebruikt ter beoordeling van de retentie van fluorescently geëtiketteerde nanodeeltjes na injectie (zoals getoond 1 uur en 24 uur na de injectie in Figuur 5).

  1. Verwijderen de ventrale vacht overliggende de SMGs door scheren of met behulp van een chemische ontharingsmiddelen om beter te visualiseren fluorescent signaal binnen de SMG via de huid.
    Opmerking: Na euthanasie, SMG weefsel ook geoogst kan worden opgelost ('s nachts in 4% paraformaldehyde) en gekleurd met behulp van immunohistochemistry te bevestigen persistentie van fluorescently geëtiketteerde NP één dag na injectie (Figuur 6).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Retroductal injectie kan worden gebruikt voor het beheer van NPs op de lymfkliertest SMG (Figuur 1). Hier, leveren wij 50 µg PSMA NPs aangeduid met Texas Red fluorophore.

Juiste plaatsing van de muis kunt facile toegang en visualisatie van de verdieping van de mond (figuur 2A-B). De submandibulaire mannetjesvissen worden aangemerkt als twee vlezige uits...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Retroductal injectie is essentieel voor gelokaliseerde drug levering aan de speekselklier. Deze techniek heeft toepassingen in de screening van de therapeutische middelen voor de voorwaarden waaronder het syndroom van Sjogren en RIH9,10,28. Directe drug bezorging binnen de SMG via retroductal injectie biedt een belangrijk voordeel ten opzichte van systemische toediening in haar potentieel uit-target effecten, met inbegrip van im...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Onderzoek gemeld in deze publicatie werd gesteund door het nationale Instituut van Dental en craniofaciale onderzoek (NIDCR) en het National Cancer Institute (NCI) van de National Institutes of Health onder Award nummer R56 DE025098, UG3 DE027695 en CA206296 van de F30. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Dit werk werd ook ondersteund door de NSF DMR-1206219 en de IADR Innovation in mondelinge zorg Award (2016).

Wij wil Jayne Gavrity bedanken voor haar hulp bij het uitvoeren van IVIS experimenten. We bedank Karen Bentley voor haar inbreng en hulp bij het uitvoeren van EM. We zouden graag bedanken Pei-Lun Weng voor zijn hulp met IHC. Wij wil Matthew Ingalls bedanken voor zijn hulp ter voorbereiding van de figuur. We zouden graag bedanken Dr. Elaine Smolock en Emily Wu voor kritische lezing van dit manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Pilocarpine hydrochlorideSigma AldrichP6503Pilocarpine
Student Vannas Spring ScissorsFine Science Tools91500-9Spring Scissors for Tracheostomie
Sterile Saline SolutionMedlineRDI30296HSaline
Dumont #7 ForcepsFine Science Tools11274-20Gebogene pincetten
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-10Rechte pincetten
Standard Pattern ForcepsFine Science Tools11000-12Blunte pincetten
Fine Scissors- Tungsten CarbideFine Science Tools14568-09Dissectie schaar
Microhematocrit Heparinized Capillary TubesFisher Scientific22362566Capillaire buizen
Lubricant Eye OintmentRefreshN/ARefresh Lacri-Lube
Goat polyclonal anti-Nkcc1Santa Cruz BiotechSC-21545Nkcc1 Antilichaam
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306DAPI
GraphPad PrismGraphPadver6.0Statistische Software
Cotton tipped applicatorMedlineMDS202000Applicateur voor oogzalf
0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2"BD7629Spuit voor intraperitoneale injectie

Referenties

  1. Miranda-Rius, J., Brunet-Llobet, L., Lahor-Soler, E., Farre, M. Salivary Secretory Disorders, Inducing Drugs, and Clinical Management. International Journal Of Medical Sciences. 12 (10), 811-824 (2015).
  2. Acauan, M. D., Figueiredo, M. A. Z., Cherubini, K., Gomes, A. P. N., Salum, F. G. Radiotherapy-induced salivary dysfunction: Structural changes, pathogenetic mechanisms and therapies. Archives of Oral Biology. 60 (12), 1802-1810 (2015).
  3. Dirix, P., Nuyts, S., Vander Poorten, V., Delaere, P., Van den Bogaert, W. The influence of xerostomia after radiotherapy on quality of life. Supportive Care in Cancer. 16 (2), 171-179 (2008).
  4. Vissink, A., et al. Clinical management of salivary gland hypofunction and xerostomia in head-and-neck cancer patients: successes and barriers. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (4), 983-991 (2010).
  5. Delporte, C., et al. Increased fluid secretion after adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA to irradiated rat salivary glands. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (7), 3268-3273 (1997).
  6. Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: from the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta. 1812 (11), 1515-1521 (2011).
  7. Beahm, D. D., et al. Surgical approaches to the submandibular gland: A review of literature. International Journal of Surgery. 7 (6), 503-509 (2009).
  8. Zheng, C., Shinomiya, T., Goldsmith, C. M., Di Pasquale, G., Baum, B. J. Convenient and reproducible in vivo gene transfer to mouse parotid glands. Oral diseases. 17 (1), 77-82 (2011).
  9. Zheng, C., et al. Prevention of Radiation-Induced Salivary Hypofunction Following hKGF Gene Delivery to Murine Submandibular Glands. Clinical Cancer Research. 17 (9), 2842-2851 (2011).
  10. Okazaki, Y., et al. Acceleration of rat salivary gland tissue repair by basic fibroblast growth factor. Archives of Oral Biology. 45 (10), 911-919 (2000).
  11. Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).
  12. Cotrim, A. P., Sowers, A., Mitchell, J. B., Baum, B. J. Prevention of irradiation-induced salivary hypofunction by microvessel protection in mouse salivary glands. Molecular Therapy. 15 (12), 2101-2106 (2007).
  13. Redman, R. S., Ball, W. D., Mezey, E., Key, S. Dispersed donor salivary gland cells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree. Biotechnic & Histochemistry. 84 (6), 253-260 (2009).
  14. Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417-417 (2010).
  15. Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
  16. Marmary, Y., et al. Radiation-induced loss of salivary gland function is driven by cellular senescence and prevented by IL-6 modulation. Cancer Research. , (2016).
  17. Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19403-19407 (2012).
  18. Arany, S., et al. Pro-apoptotic gene knockdown mediated by nanocomplexed siRNA reduces radiation damage in primary salivary gland cultures. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (6), 1955-1965 (2012).
  19. Benoit, D. S. W., Henry, S. M., Shubin, A. D., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. pH-responsive polymeric siRNA carriers sensitize multidrug resistant ovarian cancer cells to doxorubicin via knockdown of polo-like kinase 1. Molecular pharmaceutics. 7 (2), 442-455 (2010).
  20. Malcolm, D. W., Varghese, J. J., Sorrells, J. E., Ovitt, C. E., Benoit, D. S. W. The Effects of Biological Fluids on Colloidal Stability and siRNA Delivery of a pH-Responsive Micellar Nanoparticle Delivery System. ACS Nano. , (2017).
  21. Baranello, M. P., Bauer, L., Benoit, D. S. Poly(styrene-alt-maleic anhydride)-based diblock copolymer micelles exhibit versatile hydrophobic drug loading, drug-dependent release, and internalization by multidrug resistant ovarian cancer cells. Biomacromolecules. 15 (7), 2629-2641 (2014).
  22. Wang, Y., et al. Fracture-Targeted Delivery of β-Catenin Agonists via Peptide-Functionalized Nanoparticles Augments Fracture Healing. ACS Nano. 11 (9), 9445-9458 (2017).
  23. Baranello, M. P., Bauer, L., Jordan, C. T., Benoit, D. S. W. Micelle Delivery of Parthenolide to Acute Myeloid Leukemia Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 455-470 (2015).
  24. Kuriki, Y., et al. Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct. Journal of Visualized Experiments. (51), e3074(2011).
  25. Nair, R. P., Zheng, C., Sunavala-Dossabhoy, G. Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
  26. Wang, Y., Malcolm, D. W., Benoit, D. S. W. Controlled and sustained delivery of siRNA/NPs from hydrogels expedites bone fracture healing. Biomaterials. 139 (Supplement C), 127-138 (2017).
  27. Hoffman, M. D., Van Hove, A. H., Benoit, D. S. W. Degradable hydrogels for spatiotemporal control of mesenchymal stem cells localized at decellularized bone allografts. Acta Biomaterialia. 10 (8), 3431-3441 (2014).
  28. Nguyen, C. Q., Yin, H., Lee, B. H., Chiorini, J. A., Peck, A. B. IL17: potential therapeutic target in Sjogren's syndrome using adenovirus-mediated gene transfer. Laboratory Investigation. 91 (1), 54-62 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Retroductale injectiecanulatie van de ductus van Whartonaflevering van nanodeeltjesmuismodeltherapie voor speekselklierenductale punctiein vivo imagingfluorescentie imagingflowcytometrie
Retroductal Nanoparticle injectie aan de lymfkliertest submandibulaire klier
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.