Een Model van de ligaturen intestinale lus in narcose van specifieke pathogenen vrije kippen te bestuderen van Clostridium Perfringens virulentie

Summary

Hier presenteren we een protocol om te 'intestinale ligaturen loops' in kip dunne darmen operatief te maken. Deze procedure kan voor het vergelijken van meerdere Clostridium perfringens stammen virulentie in situ in één host. Deze methode vermindert aanzienlijk het aantal kippen meestal nodig voor soortgelijke in vivo experimenten.

Abstract

Necrotische enteritis werd bestudeerd bij kippen met behulp van verschillende in vivo infectie modellen. Een combinatie van predisponerende factoren zoals coccidiosis en voeding, de meeste van deze gebruiken met maagsonde of administratie via de feed met behulp van Clostridium perfringens. In deze modellen vereist de vergelijking van meerdere C. perfringens stammen voor virulentie studies een groot aantal hosts om significante resultaten te verkrijgen. Sterfte in de loop van de studie kunnen hoge afhankelijk van het experimentele model, vandaar de ethische bezorgdheid met betrekking tot het welzijn van dieren in het onderzoek. De ontwikkeling van nieuwe modellen van de infectie waarbij minder dieren te bestuderen pathogenese, nog het verkrijgen van statistisch significante en geldige resultaten, is belangrijk bij het terugdringen van dierlijke gebruik in onderzoek. Intestinale ligaturen lus modellen zijn gebruikt om de studie van clostridial infecties in verschillende soorten zoals muizen, konijnen en kalveren. Na chirurgische ingrepen om ligaturen lus segmenten te maken, C. perfringens stammen worden geïnjecteerd rechtstreeks in de lussen om een nauw contact tussen de bacteriën en de intestinale mucosa. Monsters van de dunne darm en luminal inhoud worden genomen bij de beëindiging van de procedures na een paar uur. Meerdere bacteriestammen kunnen worden geënt in elk dier, dus vermindering van het aantal vereiste onderwerpen in de experimenten. Ook de procedures worden uitgevoerd onder algehele narcose om dieren pijn te verminderen. Bij kippen zou dit model meer aangewezen dan orale toediening te vergelijken C. perfringens stam pathogeniteit omdat minder dieren nodig zijn, geen predisponerende factoren nodig zijn voor het opwekken van de ziekte en pijn wordt gecontroleerd door pijnstillers . Het model van de intestinale ligaturen lus is slecht beschreven is bij kippen en standaardisatie is essentieel voor het optimale gebruik ervan. Dit manuscript biedt alle nodige stappen om de talrijke intestinale ligaturen loops maken in kippen en brengt informatie van de kritieke punten om geldige resultaten te verkrijgen.

Introduction

Het gebruik van dierlijke modellen om te studeren van besmettelijke ziekten bij mens en dier is een centraal instrument bij de beoordeling van virulentiefactoren regulering van de pathogenese van een bepaalde voorwaarde evenals aan het uitwerken van strategieën om te voorkomen of genezen van ziekten¹. Ondanks de talrijke voordelen van het gebruik van dierlijke modellen om te studeren van diverse ziekten, ontstaan ethische bezwaren met betrekking tot deze praktijk. Onderzoekers moeten tot een minimum beperken dierlijke terwijl het verkrijgen van aanzienlijke en geldig resultaten. Het concept van de 3 Rs-beginselen (vervangen, verminderen en verfijnen) werd uitgewerkt om ervoor te zorgen dat sociale kwesties werden behandeld in dergelijke proeven. Kip necrotische enteritis studies, worden in vivo kip modellen gebruikt om te onderzoeken de etiologie, preventie en behandelingen van deze voorwaarde^2,3,4,5. Pathogene stammen van C. perfringens uitvoering van specifieke virulentiefactoren, zoals de NetB toxine⁶, worden beheerd om het necrotische enteritis veroorzaken in kippen⁷. Het beginsel van vervanging is daarom moeilijk te bereiken in een dergelijk geval ook deze virulentiefactoren niet als kritiek op andere diersoorten mogen. De meeste modellen voor necrotische enteritis in kippen gebruik een combinatie van risicofactoren, zoals coccidiosis en veranderd dieet om te induceren necrotische enteritis gevolgd door middel van een maagsonde voor bouillon cultuur met grote aantallen C. perfringens². Deze modellen zullen het opwekken van de ziekte in een groot aantal kippen kan, en sterfte belangrijk zijn in dergelijke proeven⁸, dus bezorgdheid over de vermindering en verfijning principes in het dierlijke onderzoek.

Intestinale ligaturen lussen modellen zijn een wenselijk alternatief voor de studie van ziekten veroorzaakt door intestinale ziekteverwekkers met betrekking tot het beginsel vermindering en verfijning. In deze modellen, worden intestinale segmenten genaamd 'lussen' gemaakt door het plaatsen van ligaturen langs het darmkanaal vormen van onafhankelijke en hermetische compartimenten waar ziekteverwekkers kunnen worden geïnjecteerd alleen⁹ of met andere moleculen, zoals vaccin kandidaten ^{10 , 11}. de ziekteverwekkers van belang staan in nauw contact met de intestinale cellen en na een paar uur tijd van infectie, intestinale monsters kunnen worden teruggekregen voor verdere analyse. Hierdoor kan het gebruik van meerdere behandeling en controlegroepen in hetzelfde dier. Statistische analyse kan met herhaalde maatregelen modellen, die verhoogt de macht van de discriminatie tussen groepen en vermindert het aantal nodige kippen in vergelijking met mondelinge maagsonde proeven worden uitgevoerd. Ook worden chirurgische ingrepen en latere infectie tijden uitgevoerd onder continue narcose en Analgesie, dus het minimaliseren van de dierlijke pijn. Kringloop ligations zijn een ideale sjabloon voor vermindering van de nummers van de host en het creëren van een meer humane systeem in dierlijke onderzoek.

Intestinale ligaturen lussen modellen zijn ook beschreven in verschillende soorten, zoals kalveren, konijnen en muizen^2,9, maar slecht in kippen⁷beschreven. Voor een optimaal gebruik van deze chirurgische model, zijn de juiste techniek en uitvoering zijn essentieel voor het creëren van ligaturen intestinale lussen om te voorkomen dat schade aan de intestinale integriteit. Het doel van dit manuscript is voor het beschrijven van een stap voor stap methode bij het creëren van meerdere intestinale lussen in een kip-model. Deze techniek wordt beperkt door de surgeon's vaardigheid en ervaring, zoals nauwkeurige procedures essentieel voor het succes van het project zijn.

Protocol

Alle procedures met levende dieren gebruik werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Faculteit Diergeneeskunde, Université de Montréal (CÉUA, 'Comité d' éthique de l'utilisation des Animaux').

1. overwegingen voor de operatie

1. Selecteer 10 weken oude specifieke pathogene vrije (SPF) Livorno kippen voor de operatie.
   Opmerking: Hun gewicht moet tussen 1,0 en 1,2 kg.
2. Trekken de feed 12u voorafgaand aan de procedures voor het leegmaken van het darmkanaal.
3. Voorafgaand aan de operatie, plaatst u de kuikens onder narcose, volgens een protocol dat is geverifieerd door een anesthesist. Elke kip 15 minuten voorafgaand aan de operatie met een intramusculaire injectie (IM) van midazolam premedicate 1 mg/kg en Butorfanol 4 mg/kg. Herhaal, elke 4 h, de injectie van Butorfanol 4 mg/kg IM of wanneer de ademhaling patroon veranderingen en de frequentie toeneemt tijdens de anesthesie. Voor de narcose, tijdens alle procedures, beheren Isofluraan bij een concentratie tussen 1,5 en 2,5% met een intratracheale buis.
   Opmerking: Het gebruik van premedication voor sedatie en analgesie wordt aanbevolen als ze zal aanzienlijk verbeteren van de diepte van de verdoving, verminderen de hoeveelheid verdoving nodig tijdens alle procedures, evenals inschakelen van onderzoekers om controle van pijn niveaus.
4. Het controleren van de narcose door het opnemen van de lichaamstemperatuur, hartslag en elektrocardiogram (ECG), respiratoire tempo en ritme, zuurstof saturatie, verlopen kooldioxide (CO₂) en neurologische reflexen.
   Opmerking: Een persoon moet worden toegewezen aan deze parameters in alle procedures volgen.
5. Volg steriliteit beginselen in de chirurgische procedures. Ervoor zorgen dat de chirurg en de assistent-chirurg jurk met steriele jassen, handschoenen, een masker en beschermende bril volgens institutionele preoperatieve protocollen. Ervoor zorgen dat de chirurg scrubs de handen met een chloorhexidine gluconaat geïmpregneerd steriele borstel tot de elleboog met de nadruk op nagels en elk oppervlak van de vinger.
6. Het steriliseren van de chirurgische instrumenten met een sterilisator.

2. de chirurgische Site-voorbereiding

1. Ten eerste, handmatig verwijderen van de veren uit de buik met een zachte tractie.
2. De chirurgische site met een chloorhexidine gluconaat wasmiddel geïmpregneerd steriele borstel schrobben. Scrub zachtjes de huid vanuit het midden naar buiten voor een totale contacttijd van 5 min zonder terugkomen naar het midden.
3. 3 alternatieve passages op de chirurgische site met een chloorhexidine gluconaat oplossing en isopropyl alcohol met behulp van steriele gauzes uitvoeren.
   Opmerking: De passage moet opstarten vanaf het midden van de chirurgische site aan de grenzen om te voorkomen dat besmetting van de niet-ontsmet gebieden van de chirurgische site.
4. Plaats de steriele chirurgische draperen over de kip.

3. extractie van de dunne darmen van de buikholte

1. Incise de chirurgische draperen met een schaar om alleen de huid van de chirurgische site bloot te stellen.
2. Incise van de huid door het uitvoeren van een '' L'' vorm laag-middellijn sneetje met een scalpel mes #3.
   1. Begint de eerste snede 1 cm caudal aan het borstbeen en eindigt het op 1 cm cranial aan de cloaca.
   2. Voer de tweede snede loodrecht op de eerste snede. Start vanaf het caudal einde van de eerste snede en blijven van 5 cm aan de linkerkant van de buik door het volgen van de bekken-lijn.
      Opmerking: Deze opening ontstaat een klep waarmee een gemakkelijker extractie van de darmen.
3. Met chirurgie snij schaar, het buikvlies en de buikspieren aan te spannen met de zelfde '' L'' vorm patroon te openen van de buikholte.
   Opmerking: Dit zal blootstellen de lucht zakjes. Darmen bevinden zich onder deze structuren. Air zakjes moeten worden bevochtigde met gauzes verzadigd met steriele zoutoplossing van 0,85% om uitdroging en mogelijke breuk gedurende de hele procedure te voorkomen.
4. Invoegen een Snook spay haak in de buikholte door het volgen van de links van de buikwand en werk de weg rond de buik air zakjes.
5. Zacht exteriorize van de darmen en dit verspreid over het chirurgische gebied.
   Opmerking: Houd darmen bevochtigde door sproeien vaak steriele zoutoplossing 0,9% gedurende de gehele procedure. Ook kunnen gauzes bevochtigde met steriele zoutoplossing worden geplaatst op de darmen te voorkomen van uitdroging.
6. Pak de darmen met behulp van een droog steriel gaas en trek voorzichtig uit de dunne darmen door manuele tractie bloot het jejunum.
   Opmerking: De mesenterische vaartuigen zijn kwetsbaar en overmatige spanning kan scheuren ze die kunnen leiden tot intestinale ischemische laesies en sterk compromis de uitkomst van de procedure.

4. fabricage van intestinale Loops

1. Oprichting van lus no. 1.
   1. Plaats een eenvoudige ligatuur met een polyglactin multifilamenten absorbeerbare kunststof in de proximale jejunum door het vermijden van de ligatuur van grote mesenterische vaartuigen.
   2. Plaats een distale ligatuur 2 cm afstand van de proximale ligatuur.
      Opmerking: Eenvoudige ligaturen gemaakt met multifilamenten hechtdraad materiaal worden geplaatst langs het darmkanaal om hermetische segmenten te maken. De locatie van alle ligaturen wordt beschreven met een schema (Figuur 1). De lussen bestaan uit een proximale en distale ligatuur gescheiden door 2 cm.
2. Oprichting van interloop no. 1.
   1. Plaats een eenvoudige ligatuur 0.5 cm aborally tot de distale ligatuur van lus no.1.
      Opmerking: Tussen opeenvolgende lussen, er zijn interloops van 1 cm, d.w.z. segmenten een fysieke scheiding tussen de lussen maken. Als u wilt waarschijnlijk verlagen het risico van kruisbesmetting uit een lus naar de andere, wordt een eenvoudige ligatuur geplaatst in het midden van de interloop (0.5 cm vanaf de distale en proximale ligatuur van 2 aangrenzende loops). Dit vermindert het risico van een mogelijke gelekte verontreinigingen van een lus te bereiken de ligatuur van een aangrenzende lus. Deze segmenten zijn niet verplicht, maar zal verminderen het risico van kruisbesmetting.
3. Creatie van latere lussen en interloops.
   1. Herhaal stap 4.1 en 4.2 om het aantal gewenste lussen te verkrijgen.
      Opmerking: In dit experiment, 9 loops en 8 interloops werden gemaakt. Totale lengte bedraagt 26 cm. Het aantal lussen kan worden aangepast afhankelijk van de studie.

5. injectie van Clostridium perfringens stammen in de lussen

1. Injecteren met een steriele spuit en naald 26 G het pathogene agens in lus no.1. Zachtjes invoegen de naald aan de antimesenteric kant van de darm in een hoek van 45°.
   Opmerking: In dit experiment, 0.2 mL hersenen hart infusie (BHI) 1 x 10⁶ kve (kolonie vormende eenheden) van C. perfringens met in het midden log groeifase werd geïnjecteerd in elke lus. 5 verschillende variëteiten waren geïnjecteerd in 5 verschillende loops en de 4 overgebleven lussen werden ingespoten met een negatieve controle met geen bacteriën (steriele BHI), afwisselend van ziekteverwekkers en steriele BHI loops.
2. Herhaal stap 5.1 te injecteren van alle lussen.
3. Zachtjes vervangen het darmkanaal in het ruggedeelte van de buikholte, onder de lucht zakjes.

6. afsluiting van de buikholte

1. De hechtdraad van het buikvlies en de buikspieren aan te spannen.
   1. Het buikvlies en de buikspieren aan te spannen langs het bekken (gemaakt in stap 3.3) met een eenvoudige continu hechtdraad-patroon met behulp van een polyglactin multifilamenten absorbeerbare kunststof Suture.
   2. Suture van het buikvlies en de buikspieren van het borstbeen nog aan de cloaca (gemaakt in stap 3.3. met een eenvoudige continu hechtdraad-patroon met behulp van een polyglactin multifilamenten absorbeerbare kunststof.
2. De Sutuur (geologie) van de huid.
   1. Met behulp van een polyglactin multifilamenten synthetisch materiaal en het patroon van een eenvoudige continu hechtdraad, sluit de insnijding van de huid langs het bekken gemaakt in stap 3.2.
   2. Met behulp van hetzelfde multifilamenten ligatuur materiaal en het patroon van een eenvoudige continu hechtdraad, sluit de insnijding van de huid van het borstbeen nog aan de cloaca in stap 3.2 gemaakt.

7. conclusie

1. Na de chirurgische procedures, houden de kip onder narcose met juist gebruik van pijnstillers om te minimaliseren van dierlijke pijn gedurende de tijd van de infectie. Blijven verdoving volgen teneinde een voldoende verdoving niveau te garanderen.
2. Na de tijd van de gewenste infectie, humaan euthanaseren de kip door cervicale dislocatie onder algemene verdoving.
   Opmerking: Voor deze procedures, de vereiste tijd voor het opwekken van microscopische laesies met C. perfringens pathogene stammen was 7 h.
3. Met een scalpel blad #3, snijd een 0.5 cm tot 1 cm lange lus gedeelte en plaats deze in 10% formaline voor fixatie overnachting en verdere histopathologische analyse.
4. Met het dezelfde scalpel blad, het resterende gedeelte van de lus knippen en deze plaatsen in een steriele microcentrifuge buis voor de isolatie van de C. perfringens stammen in elke lus verder bacteriologische analyse voor hun genetische karakterisering.
5. Herhaal stap 7.2 en 7.3 voor alle lussen door het veranderen van het scalpel blad tussen iedere lus.

Results

Een schematische voorstelling van de 9 intestinale loops en 8 interloops is afgebeeld in Figuur 1. In dit model, een totaal van 9 loops en 8 interloops worden gemaakt met eenvoudige ligaturen. Een lus bestaat uit proximale en distale ligaturen verdeeld door 2 cm, gemeten vanaf de ligatuur proximale. Twee aangrenzende lussen worden gescheiden door een interloop van 1 cm. Om te verminderen het risico van kruisbesmetting tussen lussen door lekkage van een ligatu...

Discussion

Intestinale lussen modellen zijn beschreven in vele soorten te bestuderen van host-pathogen interactions en pathogenese van ziekten veroorzaakt door verschillende intestinale ziekteverwekkers, zoals Clostridium perfringens, Clostridium difficile en Salmonella enterica^7,9,13,14,15. Het is ook gebruikt voor het analyseren van de mucosa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Scrub 747	Becton Dickinson and Company		4% chloorhexidine gluconate geïmpregneerde steriele borstel. Geen catalogusnummer beschikbaar. Webadres: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes
Isopropyl alcohol 70% USP 4 L	Commercieel isopropyl alcohol	P016IP70	Webadres: http://www.comalc.com/products/
Chlorexidine	Sigma-Aldrich	282227-1G	Chlorhexidine gluconate oplossing, moet verdund worden tot 4%. Webadres: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2Z WQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE
Chirurgisch doekje Klein (27 inch x 24 inch) met 3 x 6 inch Fenestratie	Veterinary Specialty Products	32724	Webadres: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog. detail&productgroup_id=15
Scalpelmesjes #3	Swann-Morton	301	Webadres: https://www.swann-morton.com/product/16.php
Steriele zoutoplossing NaCl 0,9%	Sigma-Aldrich	S8776-100ML	Webadres: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA
Vicryl 3-0	Ethicon	D9003	Polyglactin multifilament absorbeerbaar hechtmateriaal. Webadres: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture
Spuit 1 ml met 26G naald	Becton Dickinson and Company	329652	Webadres: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes
Brain Heart Infusion	Sigma-Aldrich	1104930500	Webadres: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1
Eppendorfbuisje	Sigma-Aldrich	T9661-500EA	Microcentrifugebuisje. Webadres: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQ obChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh 30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE
Formaline oplossing, gebufferd neutraal, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	Weefsel: formaline verhouding van 1: 10 voor adequate fixatie. Webadres: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA
Clostridium perfringens stammen	Université de Montréal, Chaire en recherche avicole	N/A	Specifiek voor elk laboratorium, beschikbaar op aanvraag bij de corresponderende auteur