Stroom cytometry Imaging biedt een ideale aanpak voor het detecteren van de morfologische en functionele wijziging van cellen op individuele en populational niveau. Verstoorde endocytotische functie voor lipide antigeen presentatie in verontreinigende stoffen blootgesteld menselijke dendritische cellen werd aangetoond met een gecombineerde transcriptomic profilering van genexpressie en morfologische demonstratie van eiwit mensenhandel.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Integreren van Imaging Stroom Cytometry en profilering te evalueren veranderde endocytotische CD1d handel Transcriptomic
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Populational analyses van de morfologische en functionele wijziging van endocytotische eiwitten zijn uitdagend vanwege de vraag van Fotolader op een eencellige niveau en statistische beeldanalyse op een populational niveau. Om deze moeilijkheid te overwinnen, we gewend imaging stroom cytometry en transcriptomic (RNA-seq) profilering bepalen veranderde subcellular localisatie van het cluster van differentiatie 1d eiwit (CD1d) die zijn gekoppeld met verminderde endocytotische genexpressie in mens dendritische cellen (DC's), die werden blootgesteld aan de lipofiele common air pollutant benzo [a] pyreen. De colocalization van CD1d en endocytotische marker Lamp1 eiwitten uit duizenden cel beelden met imaging stroom cytometry werd geanalyseerd met behulp van ideeën en ImageJ-Fiji programma's. Talrijke cellulaire beelden met mede gekleurd CD1d en Lamp1 eiwitten waren gevisualiseerd na gating op CD1d+Lamp1+ DCs met behulp van ideeën. De verbeterde CD1d en Lamp1 colocalization bij BaP blootstelling werd verder aangetoond met behulp van thresholded scatterplots, getest met Mander de coëfficiënten voor co gelokaliseerde intensiteit, en uitgezet op basis van het percentage van de medefinanciering gelokaliseerde gebieden met behulp van ImageJ-Fiji. Onze gegevens geven een voordelige instrumentaal en bioinformatic aanpak voor het meten van eiwit colocalization zowel één als populational cellulaire niveau, ter ondersteuning van een verminderde functionele uitkomst van transcriptomic wijziging in verontreinigende stoffen blootgesteld mens DCs.
Inleiding
Antigeen presentatie omvat normaliter intracellulaire eiwitten mensenhandel, die is vaak onderzocht met behulp van morfologische karakterisering en fenotypische profilering van antigeen presentatie van cellen1,2,3 . Om de voordelen van beeldvorming en fenotypering methoden te integreren, beschrijven we een imaging platform van de analyse op zowel eencellige als populatie aan te tonen een veranderd eiwit colocalization in menselijke dendritische cellen (DC's). In peptide-antigeen presentatie, grote histocompatibility complex (MHC) klasse I moleculen binden een korte peptide (8....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Menselijke protocollen in deze studie werden goedgekeurd door de institutionele Review Board van de University of Cincinnati en alle methoden werden uitgevoerd volgens de relevante richtlijnen en verordeningen. Bloedmonsters van gezonde donoren waren van de Hoxworth bloed Center aan de University of Cincinnati Medical Center.
1. Transcriptomic profilering van verontreinigende stoffen-blootgesteld menselijke monocyt-afgeleide DCs
- Totaal RNA extractie van BaP-blootgesteld DCs
- Onderscheiden van menselijke DCs met behulp van cytokines GM-CSF en IL-4, en bloot DCs aan BaP voor 4 dagen13.
- Sorte....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De lipofiele verontreinigende stof BaP verandert endocytotische gene clusters in menselijke DCs. mens monocyt-afgeleide DCs van elke donor (n = 3) werden geïncubeerd met BaP en gesorteerd voor conventionele DCs, die verder voor RNA extractie en transcriptomic analyse gebruikt werden zoals beschreven . Bij de normalisatie van de genexpressie, werden veranderde genen tussen groepen BaP-blootgesteld en niet-blootgesteld geclusterd volgens de functionele correlatie van differentially uitgedru.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Functionele bevestiging van een veranderd gen-traject is uitdagend, vanwege sterk beïnvloed genexpressie waarbij meerdere trajecten en de moeilijkheid om individuele en populational cellulaire activiteiten te integreren. Wij werkzaam imaging stroom cytometry specifiek test CD1d mensenhandel endocytotische compartimenten. Stroom cytometry Imaging integreert de populational meting van cellen en de afzonderlijke demonstratie van subcellular colocalization van meerdere eiwitten. Confocale microscopie heeft eerder verstrekte .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Robert Giulitto (Hoxworth bloed midden) voor menselijke bloedmonsters en Dr. Liang Niu voor de normalisatie van de genexpressie leest. Wij danken ook financiële steun van de National Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), centrum voor milieu genetica (CEG) proefproject (S.H.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (AI115358) (S.H.), Universiteit van Cincinnati University Research Council award (sh) en de Universiteit van Cincinnati College van geneeskunde Enhancement basisfinanciering (X. Z.).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq-systeem |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Totale RNA-extractie | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Totale RNA QC-analyse | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzymreactie | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA-zuivering | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA-zuivering | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit voor Illumina | New England Biolab | Bibliotheekvoorbereiding | |
| Agencourt AMPure XP magnetische korrels | Beckman Coulter | DNA-zuivering | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Bibliotheek QC, grootteverdelingsanalyse | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Bibliotheek QC, grootteverdelingsanalyse | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Bibliotheekkwantificering | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Bibliotheekkwantificering | |
| cBot | Illumina | Bibliotheek clustergeneratie | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS | Illumina | Bibliotheek clustergeneratie | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycli) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrine/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrine/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-muis IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
Referenties
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. <....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
