Integreren van Imaging Stroom Cytometry en profilering te evalueren veranderde endocytotische CD1d handel Transcriptomic

Summary

Stroom cytometry Imaging biedt een ideale aanpak voor het detecteren van de morfologische en functionele wijziging van cellen op individuele en populational niveau. Verstoorde endocytotische functie voor lipide antigeen presentatie in verontreinigende stoffen blootgesteld menselijke dendritische cellen werd aangetoond met een gecombineerde transcriptomic profilering van genexpressie en morfologische demonstratie van eiwit mensenhandel.

Abstract

Populational analyses van de morfologische en functionele wijziging van endocytotische eiwitten zijn uitdagend vanwege de vraag van Fotolader op een eencellige niveau en statistische beeldanalyse op een populational niveau. Om deze moeilijkheid te overwinnen, we gewend imaging stroom cytometry en transcriptomic (RNA-seq) profilering bepalen veranderde subcellular localisatie van het cluster van differentiatie 1d eiwit (CD1d) die zijn gekoppeld met verminderde endocytotische genexpressie in mens dendritische cellen (DC's), die werden blootgesteld aan de lipofiele common air pollutant benzo [a] pyreen. De colocalization van CD1d en endocytotische marker Lamp1 eiwitten uit duizenden cel beelden met imaging stroom cytometry werd geanalyseerd met behulp van ideeën en ImageJ-Fiji programma's. Talrijke cellulaire beelden met mede gekleurd CD1d en Lamp1 eiwitten waren gevisualiseerd na gating op CD1d⁺Lamp1⁺ DCs met behulp van ideeën. De verbeterde CD1d en Lamp1 colocalization bij BaP blootstelling werd verder aangetoond met behulp van thresholded scatterplots, getest met Mander de coëfficiënten voor co gelokaliseerde intensiteit, en uitgezet op basis van het percentage van de medefinanciering gelokaliseerde gebieden met behulp van ImageJ-Fiji. Onze gegevens geven een voordelige instrumentaal en bioinformatic aanpak voor het meten van eiwit colocalization zowel één als populational cellulaire niveau, ter ondersteuning van een verminderde functionele uitkomst van transcriptomic wijziging in verontreinigende stoffen blootgesteld mens DCs.

Introduction

Antigeen presentatie omvat normaliter intracellulaire eiwitten mensenhandel, die is vaak onderzocht met behulp van morfologische karakterisering en fenotypische profilering van antigeen presentatie van cellen^1,2,3 . Om de voordelen van beeldvorming en fenotypering methoden te integreren, beschrijven we een imaging platform van de analyse op zowel eencellige als populatie aan te tonen een veranderd eiwit colocalization in menselijke dendritische cellen (DC's). In peptide-antigeen presentatie, grote histocompatibility complex (MHC) klasse I moleculen binden een korte peptide (8....

Protocol

Menselijke protocollen in deze studie werden goedgekeurd door de institutionele Review Board van de University of Cincinnati en alle methoden werden uitgevoerd volgens de relevante richtlijnen en verordeningen. Bloedmonsters van gezonde donoren waren van de Hoxworth bloed Center aan de University of Cincinnati Medical Center.

1. Transcriptomic profilering van verontreinigende stoffen-blootgesteld menselijke monocyt-afgeleide DCs

1. Totaal RNA extractie van BaP-blootgesteld DCs
   1. Onderscheiden van menselijke DCs met behulp van cytokines GM-CSF en IL-4, en bloot DCs aan BaP voor 4 dagen¹³.
   2. Sorte....

Results

De lipofiele verontreinigende stof BaP verandert endocytotische gene clusters in menselijke DCs. mens monocyt-afgeleide DCs van elke donor (n = 3) werden geïncubeerd met BaP en gesorteerd voor conventionele DCs, die verder voor RNA extractie en transcriptomic analyse gebruikt werden zoals beschreven . Bij de normalisatie van de genexpressie, werden veranderde genen tussen groepen BaP-blootgesteld en niet-blootgesteld geclusterd volgens de functionele correlatie van differentially uitgedru.......

Discussion

Functionele bevestiging van een veranderd gen-traject is uitdagend, vanwege sterk beïnvloed genexpressie waarbij meerdere trajecten en de moeilijkheid om individuele en populational cellulaire activiteiten te integreren. Wij werkzaam imaging stroom cytometry specifiek test CD1d mensenhandel endocytotische compartimenten. Stroom cytometry Imaging integreert de populational meting van cellen en de afzonderlijke demonstratie van subcellular colocalization van meerdere eiwitten. Confocale microscopie heeft eerder verstrekte .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Transcriptomics	Illumina	HiSeq 2500 v4	Illumina HiSeq system
ImagingStream X	Millipore	100220	Imaging flow cytometry
mirVana miRNA Isolation Kit	Thermo Fisher		Total RNA extraction
Agilent RNA 6000 Pico Kit	Agilent		Total RNA QC analysis
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler	Thermo Fisher		PCR, enzyme reaction
NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module	New England Biolab		PolyA RNA purification
Automated SMARTer Apollo system	Takara		PolyA RNA purification
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolab		Library preparation
Agencourt AMPure XP magnetic beads	Beckman Coulter		DNA purification
2100 Bioanalyzer	Agilent		Library QC, size distribution analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent		Library QC, size distribution analysis
QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)	Thermo Fisher		Library quantification
NEBNext Library Quant Kit	New England Biolab		Library quantification
cBot	Illumina		Library cluster generation
TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot – HS	Illumina		Library cluster generation
HiSeq 1000	Illumina		Sequencing
TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)	Illumina		Sequencing
Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)	Bio Legend	L243
Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)	Bio Legend	3.9
Brilliant violet 421	Bio Legend	L161
PE-anti-mouse IgG2b	Bio Legend	51.1
Alexa Fluor 647 (AF647)	Bio Legend	CD107a(H4A3)