Methodenartikel

Evaluatie van de opname van de Exon geïnduceerd door Splice switch Antisense Oligonucleotides in SMA patiënt fibroblasten

DOI:

10.3791/57530

⸱

11 mei 2018

 ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry, 2Muscular Dystrophy Canada Research Chair, Department of Medical Genetics, University of Alberta Faculty of Medicine and Dentistry

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende antisense oligonucleotides (AONs) hebben aangetoond dat induceren exon integratie (splice modulatie) en SMN expressie voor spinale musculaire atrofie (SMA) te redden. Hier beschrijven we een protocol voor AON lipotransfection ertoe exon opneming in het SMN2 -gen en de evaluatiemethoden te bepalen van de werkzaamheid bij SMA patiënt fibroblasten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spinale musculaire atrofie (SMA), een dodelijke neurologische ziekte die wordt veroorzaakt door het verlies van SMN1, presenteert een uniek geval op het gebied van antisense oligonucleotide (AON)-gemedieerde therapie. Terwijl SMN1 mutaties verantwoordelijk zijn voor de ziekte, AONs gericht op intronic splice demper (ISS) sites in SMN2, met inbegrip van de FDA-goedgekeurde nusinersen, hebben aangetoond dat herstellen SMN expressie en verbetering van de symptomen. Op dit moment veel studies waarbij AON therapie voor SMA richten op onderzoek naar nieuwe AON oplossingen gericht op SMN2 , die mogelijk meer effectieve en minder toxisch dan nusinersen. Hier beschrijven we een protocol voor in vitro evaluatie van exon integratie met behulp van lipotransfection van AONs gevolgd door omgekeerde transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR), kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR), en het westelijke bevlekken. Deze methode kan worden gebruikt voor verschillende soorten AON chemicaliën. Met behulp van deze methode, wij laten zien dat AONs samengesteld uit afwisselende vergrendelde nucleic zuren (LNAs) en DNA nucleotiden (LNA/DNA mixmers) tot efficiënte SMN2 exon insluiting en herstel van het SMN-eiwit op een zeer lage concentratie, en daarom, LNA leiden / DNA mixmer gebaseerde antisense oligonucleotides mogelijk een aantrekkelijke therapeutische strategie voor de behandeling van splicing defecten veroorzaakt door genetische ziekten. De in vitro evaluatie hier beschreven methode is snel, eenvoudig en gevoelig genoeg voor het testen van verschillende nieuwe AONs.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spinale musculaire atrofie (SMA) is een fatale neuromusculaire aandoening overgenomen in een autosomaal recessief patroon. Het wordt gekenmerkt door de afbraak van motorische neuronen en progressieve romp en ledematen spier verlamming1,2. De meerderheid van de SMA exemplaren zijn te wijten aan een homozygoot mutatie in de overleving van motor neuron 1 (SMN1) gen3. Het voortbestaan van de motor neuron 2 (SMN2) gen is een omgekeerde duplicaat van SMN1, en heeft een bijna identieke reeks uiteenlopende door slechts vijf basissen4,5. Een C-te-T-overgang in SMN2 gelegen in exon 7 maakt het gen bijna omdat de mutatie leidt tot de essentiële exon 7 buitengesloten in bijna 90% van de SMN2 afschriften (Figuur 1een). SMN2 mRNAs ontbrekende exon 7 compensatie geen voor de SMN1 -functie, omdat haar eiwit product onstabiel is en is snel afgebroken.

Antisense therapie onlangs naar voren gekomen als een veelbelovende strategie voor de behandeling van SMA6. De recente goedkeuring van nusinersen door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) het het eerste medicijn ter beschikking gesteld voor de behandeling van SMA7. Nusinersen is een 18-mer antisense oligonucleotide (AON) met een wijziging van de 2 '-O-methoxyethyl (MOE) en de ruggengraat van een phosphorothioate. De drug richt zich op de intronic splicing geluiddemper N1 (ISS-N1) gelegen in intron 7 van de SMN2 -gen. Binding van nusinersen aan ISS-N1 bevordert het herstel van functionele full-length SMN-eiwit expressie van de endogene SMN2 gen door inducerende exon 7 integratie (Figuur 1een)8,9,10 . Op dit moment veel studies waarbij AON therapie voor SMA richten op onderzoek naar nieuwe AON chemicaliën die meer effectieve en minder toxisch dan nusinersen kunnen. Is gebleken dat de AONs met andere chemicaliën ook efficiënt exon opneming in SMN2 exon 7 veroorzaken zowel in vitro als in vivo11,12,13.

Vergrendelde nucleic zuren (LNAs) zijn chemisch gewijzigde RNA-analogen met een brug van de methyleen verbindt de 4 ' -koolstof met de 2′ -zuurstof binnen de furanose structuur (Figuur 1b)14,15. In vergelijking met Ani of RNAs, LNAs hebben een grotere affiniteit voor binding aan aanvullende RNA-sequenties en hebben het extra voordeel van het zijn zeer resistent tegen endogene nucleasen. Het LNA-chemie is toegepast voor gebruik als sondes voor fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en in qPCR16,17. Ook, het wordt gebruikt voor het regelen van genexpressie zowel in vitro als in vivo. GapmeR AONs zijn een combinatie van single-stranded DNA moleculen geflankeerd door verschillende LNAs op de 5 ' en 3 ' einden. Ze neerslaan genexpressie door bindende aanvulling op gerichte mRNAs, waardoor ze worden afgebroken door het geactiveerde RNase H-18. LNA/DNA mixmers zijn AONs die bestaan uit DNA nucleotiden geïntegreerd tussen LNAs. Gepresenteerd in deze oriëntatie kunnen zij binden miRNA voor de remming van de functie (LNA-antimiR)19. Sommige LNA-antimiRs gekomen klinische ontwikkeling. Bijvoorbeeld, miravirsen (AntimiR-122) is een LNA-antimiR dat miR-122 voor de behandeling van hepatitis C infectie remt en verschillende fase II klinische proeven zijn momenteel lopende19,20. Onlangs is gebleken dat mixmers LNA/DNA ook RNA splicing21kunt moduleren. Het kan een specifieke opeenvolging van mRNA binden en induceren exon skipping in Dystrofine mRNA en exon deelname SMN2 mRNA in vitro13,22.

In dit artikel duidelijk naar voren komt een methodologie voor de inductie van exon integratie met behulp van AONs en de evaluatie van de werkzaamheid op het niveau van RNA en eiwitten. Om deze methode te illustreren, hebben we het LNA/DNA-mixmers dat targeting van ISS-N1 in intron 7 van SMN2gebruikt. AONs door lipotransfection in SMA patiënt cellen transfected geïnduceerde exon 7 opname in de definitieve SMN2 transcript en opregulatie van SMN eiwitproductie. Een van de voordelen van het gebruik van LNA/DNA mixmers voor het opwekken van de exon-integratie is dat de effectieve concentratie voor de transfectie beduidend lager dan andere oplossingen13 is. Deze methode kan worden gebruikt voor vele andere AONs met uitzondering van phosphorodiamidate morfolino oligomeren (PMOs), die, als gevolg van hun neutrale lading, moeten cellen via endocytose geïnduceerd door de Endo-Porter co transfectiereagens invoeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. de celkweek

  1. Cultuur SMA patiënt fibroblasten in het groeimedium (Dulbecco van gewijzigd Eagle middellange 1: 1 F-12 (Ham) met 10% foetale runderserum (FBS) en 0,5% penicilline/streptomycine) in een CO2 incubator bij 37 ° C.
  2. Bepalen van concentratie van de cel met behulp van een geautomatiseerde cel counter en Verdun cellen tot 1 x 105 cellen/mL in het groeimedium, en vervolgens het zaad op de juiste plaat. 12-Wells-platen (1 mL per putje) voor de RT-PCR of qPCR gebruiken.
  3. Incubeer de platen gedurende 24 uur in een CO2 incubator bij 37 ° C.

2. LNA/DNA mixmer transfectie

  1. Cel confluentie ongeveer 65-80% voor optimale transfectie efficiëntie zorgen.
  2. Ontdooi 10 μM LNA/DNA mixmers langzaam op ijs.
  3. Bereid in een 1.5-mL-buis, een 20 x mixmer-oplossing door het mixmers serum-beroofd media toe te voegen zodat het eindvolume 50 μl bereikt.
  4. Meng de mixmer oplossing met 50 μl van de serum-beroofd media met 3% transfectiereagens (1:1 verhouding).
  5. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Toevoegen van 900 μL serum-beroofd medium met 5% FBS aan elke buis.
  7. Gecombineerd de oude media van de plaat en 1 mL LNA/DNA mixmer oplossing met de transfectiereagens te vervangen.
  8. Incubeer de cellen gedurende 24-48 uur bij 37 ° C in een broedstoof CO2 .

3. RNA extractie

  1. Verwijder het medium en voeg 1 mL guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform reagens toe aan de cellen. Wassen van de onderkant van het goed meerdere malen met guanidinium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroform en verzamel het in 1.5-mL buizen.
  2. Vortex op hoge snelheid voor 30 s en winkel bij-80 ° C gedurende 1 uur of 's nachts.
  3. Ontdooi de monsters bij kamertemperatuur en vortex goed.
  4. Toevoegen van 200 µL chloroform, schud krachtig voor 15 s, en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
  5. Centrifuge op 12.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.
  6. De top heldere waterige fase in een nieuwe buis verzamelen. Zorg ervoor om te voorkomen dat een van de witte interfase die tussen de bovenste en onderste fasen vormt te verzamelen.
  7. Voeg 500 µL isopropanol en 1 µL 8 µg/µL glycogeen (RNA grade). Vortex voor 10 s en bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten of bij-20 ° C na een nacht bebroeden.
  8. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en verwijder alle van de bovendrijvende substantie. Een witte pellet zullen vormen aan de onderkant van de buis.
  9. Voeg 1 mL koude 75% ethanol en centrifuge bij 7.500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
  10. Verwijder alle de ethanol en droog de pellet bij kamertemperatuur totdat geen ethanol niet in de buis.
  11. Los van de pellet in 30 µL DNase/RNase gratis water en incubeer gedurende 10 minuten bij 60 ° C.
  12. RNA concentratie met behulp van een spectrofotometer meten (op 260 nm), en 50 ng/µL RNA concentratie aan te passen.

4. een stap RT-PCR voor het meten van de exon opneming tarief van SMN2

  1. Mix 12,5 µL van 2 x rechts-PCR reactie buffer, 1,0 µL van one-step RT-PCR enzym mix, 0,5 µL van elke primer (SMN2 naar voren: 5'-CTGCCTCCATTTCCTTCTG-3', SMN2 reverse: 5'-TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC-3', GAPDH naar voren: 5'-TCCCTGAGCTGAACGGGAAG-3', GAPDH reverse: 5'-GGAGGAGTTTGGTCGCTGT-3', 2 µL van totale RNA (50 ng/µL), en 8,5 µL van RNase/DNase-vrij gedistilleerd water.
  2. Nadat de cDNA is gesynthetiseerd bij 50 ° C gedurende 15 minuten, start u de PCR-reactie. Versterken van de exon 6-8 van de SMN2 met 30 cycli van PCR (94 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 30 s, 68 ° C gedurende 25 s). Versterken van de GAPDH met 20 cycli van PCR (94 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 30 s, 68 ° C gedurende 20 s).
  3. Voeg 5 l 6 x laden kleurstof op het PCR-product, en 5 µL van het mengsel in een 2% agarose gel laden en uitvoeren gedurende 40 min. bij 100 V.
  4. Beeld van de gel en analyseren met behulp van ImageJ software.
  5. Meet de intensiteit van de full-length bands en Δ7 banden. Bereken het percentage van de exon 7 integratie met de intensiteitswaarde van de (volledige) / (full-length + Δ7 SMN2).

5. kwantitatieve PCR (qPCR) voor het meten van de exon opneming tarief van SMN2

  1. Voor cDNA synthese, meng 1 µL Oligo dT, 1 µL 10 mM dNTPs, en 11 µL totaal RNA (50 ng/µL). Incubeer bij 65 ° C gedurende 5 min.
  2. Leg de monsters op ijs en 4 µL 5 x buffer, 1 µL 0,1 M DTT, 1 µL RNase Inhibitor van de omwenteling en 1 µL reverse-transcriptase toevoegen aan elk monster.
  3. Incubeer bij 50 ° C gedurende 60 minuten, en verwarmen tot 80 ° C gedurende 10 minuten om te stoppen met de reactie. CDNA kan worden opgeslagen bij-20 ° C.
  4. Verdun de cDNAs met RNase-gratis water (in de verdunning 1:5). Mix 10 µL, 2 x SYBR-groen qPCR enzym mix, 0.8 µL elke 10 µM primer (full-length SMN2 naar voren: 5 '-GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT-3 ', full-length SMN2 omgekeerde: 5 '-CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT-3 ', Δ7 SMN2 naar voren: 5 ' - TCTGGACCACCAATAATTCCCC-3′, Δ7 SMN2 omgekeerde: 5 '-ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC-3 ', GAPDH naar voren: 5 '-GCAAATTCCATGGCACCGT-3 ', GAPDH reverse: 5 '-AGGGATCTCGCTCCTGGAA-3 '), 3 µL verdund cDNA en 5.4 µL RNase-gratis water.
  5. Start de qPCR reactie. De gebruiksvoorwaarden: 95 ° C gedurende 30 s, dan een 40 cyclus herhalen bij 95 ° C voor 5 s tot 60 ° C gedurende 20 s.
  6. Bereken de relatieve expressie full-length SMN2 aan GAPDH of Δ7 SMN2, en normalize op de niet-behandelde cellen met het algoritme van de ΔΔCt.

6. het westelijke bevlekken

  1. Transfectie medium uit cellen verwijderen en wassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) eens.
  2. Voeg 100 µL lysis-buffermengsel met een proteaseinhibitor.
  3. Loskoppelen van de cellen vanaf de onderkant van elk putje met behulp van een steriele cel schraper en verzamelen in 1.5-mL buizen. Incubeer monsters op het ijs gedurende 30 minuten.
  4. Passeren cel lysate 21-G naald 10 keer om de cellen te verpletteren.
  5. Centrifugeer bij 20.800 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C en het supernatant in nieuwe 1.5-mL buizen verzamelen. Het monster kan worden opgeslagen in een diepvriezer-80 ° C.
  6. Bepalen eiwitconcentratie met behulp van een BCA eiwit Assay Kit, en aanpassen van de concentratie op 1.0 µg/µL.
  7. Meng 5 µL monsters en 5 µL 2 x natrium dodecyl sulfaat (SDS) monster buffer (10% SDS; 14% 0.5M Tris-HCl-oplossing, pH 6.7; 1% 0.5M EDTA-2Na stockoplossing, pH 8.0; 20% Glycerol; 0.004% bromophenol blauwe kleurstof, 5% β-mercaptoethanol) en warmte bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
  8. De monsters in een 4-12% Bis-Tris eiwit gels laden en uitvoeren gedurende 1 uur bij 150 V.
  9. Geniet van een dikke filtreerpapier in elke buffer: (geconcentreerde anode buffer: 0.3 M Tris-HCl, 20% methanol; anode buffer: 0.03 M Tris-HCl, 20% methanol; kathode buffer: 25 mM Tris, 20% methanol, 40 mM 6-amino-n-hexanoic acid, 0,01% SDS).
  10. Geniet van een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan in methanol voor 20 s, vervolgens overbrengen naar de anode buffer.
  11. De gel equilibreer na SDS-pagina met de kathode buffer voor 5-10 min onder agitatie.
  12. Plaats het filtreerpapier, PVDF membranen en de gel op een semi-droge Bevlekkende machine, als volgt: geconcentreerd anode buffer papier/anode buffer papier/PVDF membraan/proteïne gel/kathode buffer papier (Figuur 2).
  13. Bedek de stack en start de overdracht op 20 V voor 30 min.
  14. Na de overdracht, spoel het membraan PVDF met PBST (PBS met 0,05% Tween 20) zodra.
  15. Het blokkeren van het membraan bij kamertemperatuur gedurende 30 min. in 5% afgeroomde melkpoeder opgelost in PBST of bij 4 ° C voor overnachting.
  16. Verdun een gezuiverde muis anti-SMN antilichaam en een anti-Cofilin konijn antilichamen tegen 1:10,000 in 5% magere melkpoeder in PBST. Incubeer de membraan in het gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° C's nachts.
  17. Was 3 keer met PBST gedurende 10 minuten.
  18. Verdun secundaire antilichamen (HRP-geconjugeerde geit anti-muis en anti-konijn IgG (H + L)) naar 1:10,000 in 5% magere melkpoeder in PBST. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
  19. Het wassen van het membraan 3 keer met PBST gedurende 10 minuten.
  20. Het signaal van de band met de Chemoluminescentie westelijke bevlekkende detectie kit te detecteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van SMA patiënt fibroblasten, we gericht de ISS-N1 geluiddemper regio intron 7 van de SMN2 -gen met acht verschillende antisense LNA/DNA mixmers dat transfected waren met een 5 nM concentratie (Figuur 3). Elk van de mixmers bevatte een gemodificeerd phosphorothioated-backbone waardoor ze te verzetten tegen de aantasting van de nuclease. Om te evalueren van de doeltreffendheid van de mixmers, het tarief van SMN2 exon werd 7 integra...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De in vitro evaluatie hier beschreven methode is snel, eenvoudig en gevoelig genoeg voor het testen van verschillende AONs. Dit protocol is breed inzetbaar exon skipping en opname van andere genen en verschillende celtypes. Daarnaast kunnen meeste AON doorgaan (met uitzondering van PMOs) met behulp van deze methode zijn transfected. AONs kan splitsen van pre-mRNA van zowel endogene als kunstmatig geïntroduceerde genen kunnen regelen, en mede-transfected met plasmide vectoren uitvoering van gerichte genen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Nicole McRorie voor hulp met de experimenten. Dit werk werd gesteund door de Universiteit van Alberta faculteit geneeskunde en tandheelkunde Slipchuk SMA onderzoeksbeurs Stichting onderzoek, de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR), de vrienden van Garrett Cumming middelen voor onderzoek, neurologisch HM Toupin Middelen voor het onderzoek van wetenschap, de spierdystrofie Canada, de Stichting van Canada voor innovatie, Alberta Enterprise en geavanceerde onderwijs, en de vrouwen en kinderen Health Research Institute (WCHRI).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
SMA FibroblastsCoriell NIGMS human genetic cell repositoryGM03813
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher11320033
Fetal Bovine SerumSigma-AldrichF1051
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher15140122
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher25300062
Serum-deprived mediaThermo Fisher31985070
Transfection reagentThermo Fisher15338100
guanidinium thiocyanate-fenol-chloroform (TRIzol)Thermo Fisher15596-018
RT-PCR PrimersSequence 5' naar 3'
SMN2 voorwaarts: CTGCCTCCATTTCCTTCTG
SMN2 achterwaarts: TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC
GAPDH voorwaarts: TCCCTGAGCTGAACGGGAAG
GAPDH achterwaarts: GGAGGAGTTTGGTCGCTGT
qPCR Primers
volledige lengte SMN2 voorwaarts:GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT
volledige lengte SMN2 achterwaarts: CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT
GAPDH voorwaarts: GCAAATTCCATGGCACCGT
GAPDH achterwaarts:AGGGATCTCGCTCCTGGAA
ChloroformSigma-AldrichP3803
Glycogen, RNA gradeThermo FisherR0551
ImageJ Software
Protease cocktail inhibitor Roche11836153001
Kathode Buffer0,025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol
Anode Buffer0,03 M Tris Base + 20% Methanol
Geconcentreerde Anode Buffer0,3 M Tris base + 20% Methanol
Beta Mercaptoethanol MilliporeES-007-E
PVDF membraan GE10600021
Loading/sample buffer voor Western blottingNuPage InvitrogenNP007
One-Step RT-PCR kit Qiagen 210210
dNTPsClontech3040

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4(2015).
  2. Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases. Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).
  3. Lefebvre, S., et al. Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene. Cell. 80 (1), 155-165 (1995).
  4. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).
  5. Monani, U. R., et al. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).
  6. Lee, J. J., Yokota, T. Antisense therapy in neurology. J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).
  7. Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).
  8. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).
  9. Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon. PLoS Biol. 5 (4), 73(2007).
  10. Passini, M. A., et al. Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy. Sci Transl Med. 3 (72), (2011).
  11. Hammond, S. M., et al. Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).
  12. Porensky, P. N., et al. A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse. Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).
  13. Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts. Sci Rep. 7 (1), 3672(2017).
  14. Obika, S., et al. Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering. Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).
  15. Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).
  16. Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
  17. Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods. Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).
  18. Wahlestedt, C., et al. Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).
  19. Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).
  20. Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
  21. Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping. Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).
  22. Shimo, T., et al. Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).
  23. Nguyen, Q., Yokota, T. Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy. J. Pers. Med. 7 (4), 13(2017).
  24. Echigoya, Y., et al. Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. , (2017).
  25. Saito, T., et al. Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient. PLoS One. 5 (8), 12239(2010).
  26. Donnelly, E. M., et al. Characterization of a murine model of SMA. Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).
  27. Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).
  28. Paton, D. M. Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy. Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).
  29. Prakash, T. P., et al. Comparing in vitro and in vivo activity of 2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2'-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides. J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).
  30. Aoki, Y., et al. Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Evaluatie van exon inclusieSMN2 exon 7lipotransfectieprotocolRT PCR analysekwantitatieve PCRWestern blottingLNA DNA mixmersantisense oligonucleotide therapie

Gerelateerde artikelen