Verschillende antisense oligonucleotides (AONs) hebben aangetoond dat induceren exon integratie (splice modulatie) en SMN expressie voor spinale musculaire atrofie (SMA) te redden. Hier beschrijven we een protocol voor AON lipotransfection ertoe exon opneming in het SMN2 -gen en de evaluatiemethoden te bepalen van de werkzaamheid bij SMA patiënt fibroblasten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Evaluatie van de opname van de Exon geïnduceerd door Splice switch Antisense Oligonucleotides in SMA patiënt fibroblasten
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Spinale musculaire atrofie (SMA), een dodelijke neurologische ziekte die wordt veroorzaakt door het verlies van SMN1, presenteert een uniek geval op het gebied van antisense oligonucleotide (AON)-gemedieerde therapie. Terwijl SMN1 mutaties verantwoordelijk zijn voor de ziekte, AONs gericht op intronic splice demper (ISS) sites in SMN2, met inbegrip van de FDA-goedgekeurde nusinersen, hebben aangetoond dat herstellen SMN expressie en verbetering van de symptomen. Op dit moment veel studies waarbij AON therapie voor SMA richten op onderzoek naar nieuwe AON oplossingen gericht op SMN2 , die mogelijk meer effectieve en minder toxisch dan nusinersen. Hier beschrijven we een protocol voor in vitro evaluatie van exon integratie met behulp van lipotransfection van AONs gevolgd door omgekeerde transcriptie polymerasekettingreactie (RT-PCR), kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR), en het westelijke bevlekken. Deze methode kan worden gebruikt voor verschillende soorten AON chemicaliën. Met behulp van deze methode, wij laten zien dat AONs samengesteld uit afwisselende vergrendelde nucleic zuren (LNAs) en DNA nucleotiden (LNA/DNA mixmers) tot efficiënte SMN2 exon insluiting en herstel van het SMN-eiwit op een zeer lage concentratie, en daarom, LNA leiden / DNA mixmer gebaseerde antisense oligonucleotides mogelijk een aantrekkelijke therapeutische strategie voor de behandeling van splicing defecten veroorzaakt door genetische ziekten. De in vitro evaluatie hier beschreven methode is snel, eenvoudig en gevoelig genoeg voor het testen van verschillende nieuwe AONs.
Inleiding
Spinale musculaire atrofie (SMA) is een fatale neuromusculaire aandoening overgenomen in een autosomaal recessief patroon. Het wordt gekenmerkt door de afbraak van motorische neuronen en progressieve romp en ledematen spier verlamming1,2. De meerderheid van de SMA exemplaren zijn te wijten aan een homozygoot mutatie in de overleving van motor neuron 1 (SMN1) gen3. Het voortbestaan van de motor neuron 2 (SMN2) gen is een omgekeerde duplicaat van SMN1, en heeft een bijna identieke reeks uiteenlopende door slechts vijf basissen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. de celkweek
- Cultuur SMA patiënt fibroblasten in het groeimedium (Dulbecco van gewijzigd Eagle middellange 1: 1 F-12 (Ham) met 10% foetale runderserum (FBS) en 0,5% penicilline/streptomycine) in een CO2 incubator bij 37 ° C.
- Bepalen van concentratie van de cel met behulp van een geautomatiseerde cel counter en Verdun cellen tot 1 x 105 cellen/mL in het groeimedium, en vervolgens het zaad op de juiste plaat. 12-Wells-platen (1 mL per putje) voor de RT-PCR of qPCR gebruiken.
- Incubeer de platen gedurende 24 uur in een CO2 incubator bij 37 ° C.
2. LNA/DNA mixmer transfectie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van SMA patiënt fibroblasten, we gericht de ISS-N1 geluiddemper regio intron 7 van de SMN2 -gen met acht verschillende antisense LNA/DNA mixmers dat transfected waren met een 5 nM concentratie (Figuur 3). Elk van de mixmers bevatte een gemodificeerd phosphorothioated-backbone waardoor ze te verzetten tegen de aantasting van de nuclease. Om te evalueren van de doeltreffendheid van de mixmers, het tarief van SMN2 exon werd 7 integra.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De in vitro evaluatie hier beschreven methode is snel, eenvoudig en gevoelig genoeg voor het testen van verschillende AONs. Dit protocol is breed inzetbaar exon skipping en opname van andere genen en verschillende celtypes. Daarnaast kunnen meeste AON doorgaan (met uitzondering van PMOs) met behulp van deze methode zijn transfected. AONs kan splitsen van pre-mRNA van zowel endogene als kunstmatig geïntroduceerde genen kunnen regelen, en mede-transfected met plasmide vectoren uitvoering van gerichte genen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Nicole McRorie voor hulp met de experimenten. Dit werk werd gesteund door de Universiteit van Alberta faculteit geneeskunde en tandheelkunde Slipchuk SMA onderzoeksbeurs Stichting onderzoek, de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR), de vrienden van Garrett Cumming middelen voor onderzoek, neurologisch HM Toupin Middelen voor het onderzoek van wetenschap, de spierdystrofie Canada, de Stichting van Canada voor innovatie, Alberta Enterprise en geavanceerde onderwijs, en de vrouwen en kinderen Health Research Institute (WCHRI).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| SMA Fibroblasts | Coriell NIGMS human genetic cell repository | GM03813 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Serum-deprived media | Thermo Fisher | 31985070 | |
| Transfection reagent | Thermo Fisher | 15338100 | |
| guanidinium thiocyanate-fenol-chloroform (TRIzol) | Thermo Fisher | 15596-018 | |
| RT-PCR Primers | Sequence 5' naar 3' | ||
| SMN2 voorwaarts: | CTGCCTCCATTTCCTTCTG | ||
| SMN2 achterwaarts: | TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC | ||
| GAPDH voorwaarts: | TCCCTGAGCTGAACGGGAAG | ||
| GAPDH achterwaarts: | GGAGGAGTTTGGTCGCTGT | ||
| qPCR Primers | |||
| volledige lengte SMN2 voorwaarts: | GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT | ||
| volledige lengte SMN2 achterwaarts: | CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT | ||
| GAPDH voorwaarts: | GCAAATTCCATGGCACCGT | ||
| GAPDH achterwaarts: | AGGGATCTCGCTCCTGGAA | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | P3803 | |
| Glycogen, RNA grade | Thermo Fisher | R0551 | |
| ImageJ Software | |||
| Protease cocktail inhibitor | Roche | 11836153001 | |
| Kathode Buffer | 0,025 M Tris base + 40 mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol | ||
| Anode Buffer | 0,03 M Tris Base + 20% Methanol | ||
| Geconcentreerde Anode Buffer | 0,3 M Tris base + 20% Methanol | ||
| Beta Mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | |
| PVDF membraan | GE | 10600021 | |
| Loading/sample buffer voor Western blotting | NuPage Invitrogen | NP007 | |
| One-Step RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | |
| dNTPs | Clontech | 3040 |
Referenties
- Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies. F1000Prime Rep. 7, 4(2015).
- Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. New developments in exon skipping and splice modulati....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
