Method Article

Visualisatie van Motor Axon navigatie en kwantificering van Axon Arborization In muis embryo's met behulp van licht blad fluorescentie microscopie

DOI:

10.3791/57546

⸱

May 11th, 2018

 ,  , 
1Molecular and Cell Biology, Taiwan International Graduate Program, Academia Sinica and Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center, 2Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, 3Institute of Biotechnology, College of Bio-Resources and Agriculture, National Taiwan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren van motor neuron projectie en axon arborization in transgene Hb9::GFP muis embryo's. Na immunokleuring voor motorische neuronen, we gebruikten licht blad fluorescentie microscopie op afbeelding embryo's voor verdere kwantitatieve analyse. Dit protocol is van toepassing op andere neuron navigatie processen in het centrale zenuwstelsel.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spinale motorische neuronen (MNs) breiden hun axonen om te communiceren met hun innervating doelen, waardoor beheersing van beweging en complexe taken in gewervelden. Het is dus van cruciaal belang voor het ontdekken van de moleculaire mechanismen van hoe motor axonen Navigeer naar arborize en hun perifere spier innervate richt zich tijdens het ontwikkelen en degeneratie. Hoewel transgene Hb9::GFP muis lijnen lang diende hebben te visualiseren motor axon trajecten tijdens de embryonale ontwikkeling, gedetailleerde beschrijvingen van het volledige spectrum van axon terminal arborization onvolledig als gevolg van de complexiteit van de patroon blijven en beperkingen van de huidige optische microscopie. Hier beschrijven we een verbeterde protocol dat combineert licht blad fluorescentie microscopie (LSFM) en robuuste beeldanalyse kwalitatief en kwantitatief visualiseren ontwikkelen van motorische axonen. Dit systeem kan gemakkelijk worden vastgesteld om het Kruis genetische mutanten of MN ziekte modellen met Hb9::GFP lijnen, onthullende roman moleculaire mechanismen die tot defecten in motor axon navigatie en arborization leiden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spinale MNs zijn het deel van het centrale zenuwstelsel maar innervate perifere spieren om te controleren van de beweging. De ontwikkelende ruggenmerg, zijn volgens de signalen afkomstig van de chorda en de aangrenzende somieten MN progenitoren (pMNs) gevestigd. Alle post mitotische MNs gedifferentieerd zijn vervolgens gegenereerd op basis van pMNs, die uiteindelijk aanleiding geven tot een reeks van MN subtypen langs de as van de rostrocaudal van het ruggenmerg1,2. Spinale MNs zijn topografisch en anatomisch goed georganiseerd. Hun morfologische overeenkomst correleert met de positie van hun respectieve doel ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle levende dieren werden bewaard in een specifieke pathogene vrije (SPF) dier faciliteit, erkende en onder toezicht van de IACUC van de Academia Sinica.

1. fixatie

  1. Verzamelen van de embryo's van embryonale dag 12,5 (E12.5) dan onthoofden en ze verwijderen van de ingewanden.
  2. Corrigeer de embryo's afzonderlijk in 24-Wells-platen met 1 mL/goed van vers bereide 4% paraformaldehyde in 1 x fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) 's nachts. Incubeer bij 4 ° C op een shaker.
  3. Wassen van de vaste embryo's ten minste 3 x, elk voor 5-10 min, met 1 mL 1 x PBS en na een nacht bebroeden bij 4 ° C op een shaker te verwijderen van....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM biedt gedetailleerde 3D visualisatie van MN baan en axon arborization in muis embryo's. Onder heldere veld verschijnen weefsels volledig transparant na ondergedompeld worden in de commerciële clearing-reagens. Geen krimp of zwelling van het monster werd opgemerkt na maximaal een week van opslag in het reagens voor imaging ontruimen. Onder fluorescentie kanaal, worden motorische neuronen aangeduid met transgenically uitgedrukt GFP (film 1). In sommige bijvoorbeeld det.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende stappen in het protocol kunnen worden onderworpen aan wijzigingen onder bepaalde omstandigheden. De duur van fixatie hangt bijvoorbeeld af van de leeftijd, van de embryo's, variërend van 2 h tot 1 of meer dagen met behulp van vers-en-klare paraformaldehyde. Aangezien de fixatie wordt uitgevoerd vóór de hele berg immunokleuring, op antilichamen die gevoelig voor eiwit crosslinking zijn, kan methanol worden gebruikt als een alternatieve kleefpoeders agent. Voor een hoge signaal-/ ruisverhouding na kleuring, i.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM experimenten en data-analyse werden uitgevoerd gedeeltelijk met behulp van de geavanceerde optische microscopen van de afdeling van de dienst van de Instrument in de Academia Sinica en met de hulp van Ms. Shu-Chen Shen. Wij danken mevrouw Sue-Ping Lee van de Imaging Core faciliteit van IMB voor aanzienlijke technische bijstand met Imaris beeldanalyse. Van de IMB wetenschappelijke Engelse bewerken Core herzien het manuscript. Dit werk wordt gefinancierd door de Academia Sinica Career Development Award (CDA-107-L05), meest (104-2311-B-001-030-MY3) en NHRI (NHRI-EX106-10315NC).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hb9::GFPThe Jackson labortory005029Collect embryos of embryonic day 12.5 (E12.5)
4% Paraformaldehyde (PFA)For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X)For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT.
Triton X-100SigmaX100-500ML
Fetal Bovine SerumThermoFisher26140079
Sheep polyclonal anti-GFPAbD Serotec4745-10511:1000
Alexa Fluor 488 donkey anti-sheepInvitrogenA-110151:1000
RapiClear 1.49 clearing reagentSunJin LabRC149001
1.5ml micro tubeSarstedt72.690.001
24 wells plateThermoFisher142475
5 SA Tweezerideal-tek3480641
Iris Scissors striaght sharp/sharpAesculapBC110R
Microsurgery Scalpels, single useAesculapBA365
Dissecting microscopeNikonSMZ800
ShakerTKSRS-01
Lightsheet Z.1 microscopeCarl Zeiss Microscopy
Imaris 8.4.0 image analysis softwareBitplane, Zurich, Switzerland
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice)The Jackson Laboratory005029

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
  2. Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293(2014).
  3. Kania, A., Jessell, T. M.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Motor Axon NavigationLight Sheet MicroscopyAxon ArborizationMouse EmbryosHb9 GFP MiceImage Analysis SoftwareFilament QuantificationSample ClearingAntibody IncubationZ Stack Acquisition

Related Articles